Introduction
In vivo modellering van het centraal zenuwstelsel (CNS) aandoeningen vereisen een effectieve aflevering van exogene stoffen, zoals geneesmiddelen, pathogenen of exosomes, in de hersenen. Daartoe moet een ideale levermethode minimaal trauma veroorzaken aan het dier, de integriteit van het neurale netwerk en het bereiken van hoge concentraties van stoffen in de hersenen 1.
Verschillende chirurgische methoden plaatselijke afgifte van een substantie zijn beschreven, inclusief interne schede, intracerebrale, intraventriculaire en injecties of implantaten 2, 3, 4, 5. Deze benaderingen zijn echter traumatische beschouwd als de CNS, en laat het beheer van slechts kleine hoeveelheden van de stof van belang. Bovendien is gesuggereerd dat exogene stoffen snel kunnen worden verwijderd door de cerebrospinale vloeistof 6 7 van de bovengenoemde technieken worden gebruikt. Systemische afgifte werkwijzen, zoals orale, pulmonaire, subcutane, en intraveneuze routes worden vaker gebruikt in diermodellen, hoewel ze lage werkzaamheid vertonen in het leveren van de stoffen aan het CNS, door opname van andere organen 8, 9. Daarom zijn deze toedieningsroutes vereisen verhoogde doses voor toediening van stoffen, waardoor het risico op bijwerkingen en toxiciteit 10, 11.
Hier beschrijven we een muis infusie microchirurgie technieken, die effectief levert stoffen rechtstreeks in de hersenen via de inwendige halsslagader. Naast richt de aflevering aan het centrale zenuwstelsel, is deze techniek niet voorbij normale fysiologische barrières en reden belangrijk biological-processen voor passages therapeutica of pathogenen in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De betrokken bij de volgende protocol procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Miami Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Daarnaast worden alle procedures worden uitgevoerd in voorzieningen die door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de muizen voor Heelkunde
- Verdoven muis met isofluraan gemengd met zuurstof met een klinisch anesthesiesysteem. Gebruik isofluraan bij het instellen van tussen 4-5% en zuurstoftoevoer bij 2 L / min op de commerciële machine (zie Materials tabel). Breng het dier de operatie oppervlak onder een stereomicroscoop en sustain anesthesie via een neuskegel (gebruik isofluraan instelling 1,5-2,5 en zuurstoftoevoer bij 2 l / min).
- Zorg ervoor dat de muis ademfrequentie is ongeveer 1-2 ademhaling / sec zonder hijgen. Daarnaast is ervoor te zorgen dat het dier snorharen stimulatie reactie en pedaal r vertoontEflex (teen knijpen). Monitor ademhaling en inspanning tijdens de operatie, ten minste om de 5 min. Volg specifieke Institutional Animal Care en gebruik Comite en veterinaire richtlijnen voor knaagdieren anesthesie monitoring.
- Breng een druppel oftalmische smeermiddel op elk oog met een steriel wattenstaafje om uitdroging te voorkomen. Toediening van anti-inflammatoire en analgetische te verlichten ongemak aanbevolen.
- Met het dier op zijn rug, handhaven anesthesie via een neuskegel.
- Reinig nek van het dier door vegen het gebied drie keer met ethanol 70% en chloorhexidine. Scheer operatie gebied van het dier met behulp van een scheermes (hieronder).
2. Dissectie van de halsslagader (CCA)
- Voer de gehele microchirurgie procedure onder een stereomicroscoop. Gebruik chirurgische schaar en forceps uitvoeren van een ondiepe middellijn incisie in de nek, van boven het borstbeen tot onder tHij kaak (ongeveer 3-4 cm).
- Met behulp van pincet voorzichtig gescheiden vet en bindweefsel de luchtpijp bloot.
- Plaats een kussen (rond voorwerp, ongeveer 0,5 cm diameter) op de achterkant van de hals van de muis om de hals te verlengen, het gebied verder blootstellen.
- Scheid het weefsel met behulp van een weefselhaak of haken.
- Aan de linkerkant van de luchtpijp van het dier voorzichtig tweeze behalve het bindweefsel naar links CCA bloot.
- Met behulp van een tang verwijder zorgvuldig alle bindweefsel aan de CCA bifurcatie bloot te leggen, en het begin van zowel externe als interne halsslagaders.
3. Voorbereiding van de CCA voor Substance Infusion
- Plaats twee segmenten van nylon hechtdraad (ongeveer 1 cm per stuk) in het kader van de externe halsslagader (ECA), met behulp van een tang.
- Plaats een permanente knoop op het hoogste punt mogelijk van de Europese Rekenkamer.
- Op het laagste punt mogelijk van de Rekenkamer, direct boven de CCA bifurcatie, plaatseen verwijderbare knoop. Deze knoop moet los in vergelijking met de bovenste knoop.
- Sluit de CCA met behulp van een schip clip, tegen de laagst mogelijke punt.
- Sluit de interne halsslagader (ICA) met behulp van een vat clip.
- Met behulp van microdissectie voorjaar een schaar het uitvoeren van een kleine snede in de ECA (ongeveer 2 mm), tussen de twee knopen.
4. Ten gronde Infusion via ICA
- Monteer een infusie-systeem. Bevestig 6 inches van de capillaire buis (ideale afmetingen: 2,5 mm x 1,2 mm) om een tuberculine spuit met 250 ul van de stof te worden toegediend (drugs, pathogenen, extracellulaire blaasjes, onder anderen) en steek de capillaire tip voorzichtig in de incisie uitgevoerd in stap 3,6.
- Ga verder af te glijden de capillaire totdat het een middelpunt tussen de splitsing en de clip sluiten van de CCA bereikt.
- Bind de onderste ECA knoop. Controleer of de knoop is los genoeg om capillaire doorstroming mogelijk te maken en strak genoeg om te voorkomen dat leaking.
- Verwijder clip van de ICA.
- Voorzichtig druk op de spuit zuiger waardoor stof infusie met ongeveer 10 gl per seconde.
5. Plaats Infusion Procedures
- Plaats clip terug op de ICA.
- Verwijder voorzichtig de capillaire buis.
- Bind de onderste ECA knoop volledig.
- Verwijder clips van de ICA en de CCA.
6. incisie sluiten en postoperatieve zorg
- Verwijder retractor of weefsel haken en kussen.
- Clean hechtdraad gebied met behulp van een steriele zoutoplossing.
- Sluit de incisie met behulp van nylon hechtdraad / naald en tang.
- Dien anti-inflammatoire en analgetische postoperatieve pijn verlichten.
- Plaats dier in de kooi geplaatst op verwarming pad gedurende ten minste 1 uur en de monitor herstel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De muis infusie microchirurgische techniek beschreven is zeer veelzijdig en is gebruikt om verschillende stoffen te leveren rechtstreeks in de hersenen, inclusief de levering van tumorcellen in een representatief model van hersenmetastasen vorming 1, 12.
Deze techniek is ook geschikt voor de pathologische aspecten van verschillende pathogenen in het CZS te beoordelen. In een muismodel van HIV-infectie, werd de infusie chirurgie gebruikt om virusdeeltjes direct te injecteren in de CCA. We vonden dat 7 dagen na de operatie, het CNS was positief voor HIV door real-time PCR. Bovendien is de ipsilaterale hemisfeer infectie 6-10 vouwt boven de contralaterale hemisfeer (Figuur 2).
Andere geschikte benadering van de infusie operatie hier beschreven te leveren extracellulaire blaasjes (ECV), voornamelijk exosomes, in het centraal zenuwstelsel. Figuur 3 toont de aanwezigheid van CD63, een marker voor exosomes, gemerkt met groen fluorescerend eiwit (GFP) in de ipsilaterale hersenen van een muis 24 uur na infusie.
Figuur 1: Schematische weergave van de infusie via de interne halsslagader. In het inzetstuk (a) en (b) tonen de lokalisatie van de bovenste en onderste knopen, respectievelijk; (c) vertegenwoordigt de kleine snede in de ECA, waardoor de capillaire buis wordt geplaatst (grijze lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4804fig2.jpg "/>
Figuur 2: HIV Opsporing van Real-time PCR na Viral Infusion via de interne halsslagader. Balken geven de gemiddelde HIV DNA niveaus geoogst uit muizen 7 dagen na de infusie via de linker interne halsslagader. Error bars verbeelden standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunofluorescentie van muizenhersenen Section afschilderen van GFP-gelabeld CD63, een exosome Marker, na ECV Infusion via de interne halsslagader. De vertegenwoordiger beeld schildert een muis hersenen microvaatje geassocieerd met CD63 uitdrukken ECV (groen). Schaal bar: 50 pm.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De infusie microchirurgie beschreven is zeer succesvol gebleken bij het leveren exogene stoffen van verschillende biologische functies in het centraal zenuwstelsel en voorkomt verspreiding door het lichaam 1, 12 te zijn. Verstoring van de bloed-hersenbarrière is een pathologisch kenmerk van verschillende CNS-gerelateerde aandoeningen; dus de beoordeling van de relatie van exogene stoffen met de bloed-hersenbarrière is van groot belang en het belang.
Deze operatie gepresenteerde model zorgt beperkt trauma aan de dieren en is geassocieerd met zeer lage sterfte 1, 12. Bovendien is de procedure niet interfereren met de CNS-functie of cerebrale doorbloeding 1, 12. De meest kritische aspect van deze procedure is om de correcte snede voeren in de ECA, die alleen moet toelaten deinbrengen van de capillaire buis. Een bredere cut zal leiden tot het lekken van de stof moet worden toegediend, waarbij een andere ECA een operatie aan de andere zijde. Om deze situatie te voorkomen, moet de capillaire buis een grotere diameter dan het knippen, en moet ook een scherpe rand zodat de ingang door de slagader te vergemakkelijken. Wat de technische aspect volledig opgeleid personeel kan deze operatie uit te voeren binnen 20 minuten.
De belangrijkste beperking van deze techniek is de mogelijkheid van infusie eenmaal door dezelfde ICA. Voor herhaalde afgifte van een substantie in het centraal zenuwstelsel, een schip Microport moet worden gebruikt en is eerder beschreven .Het 1 techniek hier beschreven heeft de potentie om te helpen bij het onderzoek naar nieuwe positieve en negatieve interacties binnen de BBB, alsmede pathogenen leveren , drugs en fysiologische middelen in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
