Introduction
В естественных условиях модели центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания требуют эффективной доставки экзогенных веществ, таких как наркотики, патогенных микроорганизмов, или экзосомы, в мозг. Следовательно, идеальный способ доставки должен вызывать минимальную травму животному, сохранить целостность нейронной сети, и достигать высоких концентраций веществ в головном мозге 1.
Несколько хирургических методов локальной доставки действующего вещества были описаны, в том числе внутри-оболочки, внутрицеребральная, внутрижелудочкового инъекций или имплантатов 2, 3, 4, 5. Эти подходы, однако, считаются травматическое в ЦНС, и позволить введение только низких объемов вещества, представляющего интерес. Кроме того, было высказано предположение , что экзогенные вещества могут быть быстро удалены спинно - мозговой жидкости 6 7 , когда вышеуказанные методы используются. Системные методы доставки, такие как пероральный, легочный, подкожного и внутривенного путей, чаще используются в моделях на животных, хотя они демонстрируют низкую эффективность в доставке веществ в ЦНС, благодаря поглощению другими органами 8, 9. Таким образом, эти маршруты поставки требуют повышенных доз на администрируемых веществ, увеличивая риск побочных эффектов и токсичности 10, 11.
Здесь мы опишем метод микрохирургии мыши настой, который эффективно доставляет вещества непосредственно в мозг через внутреннюю сонную артерию. В дополнение к ориентации на доставку в ЦНС, этот метод не обходит нормальные физиологические барьеры и поэтому весьма актуальным для Биологическийл процессы, участвующие в проходах терапевтических средств или патогенов в мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, участвующие в следующем протоколе были одобрены в Университете Майами Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC). Кроме того, все процедуры проводятся в учреждениях, утвержденных Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных Care International (AAALAC).
1. Подготовка мышей для хирургии
- Обезболить мышь с изофлуран в смеси с кислородом, с использованием лабораторной системы анестезии. Используйте изофлуран при установке между 4-5% и расход кислорода при 2 л / мин на коммерческой машине (см Материалы таблицу). Передача животное на поверхность хирургии, под стереомикроскопа, и поддерживать анестезии с помощью носовой конус (используйте настройку 1,5 изофлуран - 2,5 и кислорода поток со скоростью 2 л / мин).
- Убедитесь в том, что частота дыхания мыши составляет около 1 - 2 дыхания / сек без задыхаться. Кроме того, убедитесь, что животное не проявляет усов реакции стимуляции и педали гeflex (носок щепотку). Монитор частоты дыхания и сил во время операции, по крайней мере , каждые 5 мин. Следуйте конкретным институциональным уходу и использованию животных комитета и ветеринарные руководящие принципы для мониторинга грызун анестезии.
- Нанесите каплю глазной смазки на каждый глаз, используя стерильный тампон, чтобы предотвратить сухость кожи. Администрация противовоспалительного и обезболивающего, чтобы облегчить дискомфорт рекомендуется.
- С животное, лежа на спине, поддержания анестезии с помощью носовой конус.
- Очистите область шеи животного, протерев площадь в три раза с этанолом 70% и хлоргексидин. Бритье область хирургии животного с помощью бритвы (подробно изложено ниже).
2. Рассечение общей сонной артерии (ССА)
- Выполните всю процедуру микрохирургии под стереомикроскопа. Используя хирургические ножницы и пинцет выполняют неглубокую срединный разрез в области шеи, сверху грудины до уровня ниже тон челюсти (примерно от 3 до 4 см).
- Использование щипцов тщательно отдельной жирной и соединительной ткани подвергать трахеи.
- Поместите подушку (круглый предмет, около 0,5 см в диаметре) на задней части шеи мыши, чтобы продлить шеи, далее подвергая область.
- Отделить ткани, используя либо механизм втягивания ткани или крючки.
- На левой стороне животного трахеи, тщательно выщипывать друг от друга соединительной ткани, чтобы выставить левую CCA.
- Использование щипцов тщательно удалить все соединительные ткани, чтобы разоблачить развилки CCA, и начало как внешних, так и внутренних сонных артерий.
3. Подготовка ОАС для вещества Infusion
- Вставьте два сегмента нейлоновой нити (около 1 см каждая) под наружной сонной артерии (ЭКА), с помощью пинцета.
- Поместите постоянный узел на самом высоком ЕКСХ точки.
- В самой нижней точке возможного ЕКСХ, непосредственно над бифуркацией ОСА, местосъемный узел. Этот узел должен быть свободным по сравнению с верхним узлом.
- Закройте CCA с помощью клипа судна, по самой низкой возможной точки.
- Закройте внутренней сонной артерии (ВСА), используя зажим судна.
- Использование микродиссекция пружинные ножницы выполняют небольшой разрез в ECA (около 2 мм), между этими двумя узлами.
4. Вещество Настой через ICA
- Собрать систему для инфузии. Приложить 6 дюймов капиллярной трубки (идеальные размеры: 2,5 мм х 1,2 мм) к туберкулину шприц, содержащий 250 мкл вещества, подлежащего инфузии (наркотики, патогены, внеклеточные везикулы, среди других) и вставьте кончик капилляра осторожно в разрез выполняется на шаге 3.6.
- Продолжайте скользить вниз капилляр, пока он не достигнет средней точки между бифуркацией и зажимом закрытия ОАС.
- Свяжите вниз нижний ECA узел. Убедитесь в том, что узел достаточно, чтобы позволить капиллярную текучестью свободно и достаточно плотно, чтобы предотвратить leakinг.
- Удалить клип из ВСА.
- Осторожно надавливайте на поршень шприца, позволяющего вещества инфузии приблизительно 10 мкл в секунду.
5. Процедуры после инфузии
- Поместите клип обратно на ВСА.
- Осторожно удалите капиллярной трубки.
- Свяжите вниз нижний ECA узел полностью.
- Удалить клипы из ВСА и ОСА.
6. Разрез Закрытие и послеоперационный уход
- Удалите втягивающего устройства или ткани крючки и подушку.
- Очистить поверхность шва с помощью стерильного физиологического раствора.
- Закрыть разрез с помощью нейлоновой шовный / иглы и пинцета.
- Администрирование противовоспалительное и обезболивающее, чтобы облегчить послеоперационный дискомфорт.
- Поместите животное в клетке, размещенной на грелку в течение по крайней мере 1 ч и восстановление монитора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Техника микрохирургии мышь вливание описанный здесь очень универсальна и используется для доставки различных веществ непосредственно в мозг, в том числе доставку опухолевых клеток в репрезентативной модели формирования метастаз головного мозга 1, 12.
Этот метод также подходит для оценки патологических аспектов различных патогенов в ЦНС. В мышиной модели ВИЧ-инфекции, вливание операция была использована для введения вирусных частиц непосредственно в ОАС. Мы обнаружили, что через 7 дней после операции, ЦНС была положительной реакцией на ВИЧ с помощью ПЦР в реальном времени. Кроме того, инфекция ипсилатеральная полушарие 6-10 складки выше , чем контралатерального полушария (рис 2).
Другой подходящий подход хирургии вливания, описанного здесь, чтобы доставить внеклеточные везикулы (ОКП), в основном, экзосомы в ЦНС. На рисунке 3 показывает наличие CD63, маркера экзосомы, меченного зеленого флуоресцентного белка (GFP) в ипсилатеральной головном мозге мыши через 24 часа после инфузии.
Рисунок 1: Схематическое изображение Infusion через артерии внутренней сонной. На вставке (а) и (б) изображают локализацию верхних и нижних узлов, соответственно; (с) представляет собой небольшой разрез в ECA, через который вставлен капиллярная трубка (серая линия). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
4804fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Обнаружение ВИЧ с помощью ПЦР в реальном времени после того, как Viral Infusion через артерии внутренней сонной. Полоски показывают средние уровни ДНК ВИЧ заготовленные от мышей через 7 дней после инфузии с помощью левой внутренней сонной артерии. Столбики ошибок показывают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иммунофлуоресценции мышиного мозга Раздел изображающая GFP-меченых CD63, в экзосома Marker, после ОКП Infusion через артерии внутренней сонной. Представитель изображения изображает микрососудов мозга мыши, связанный с CD63 выражения ОКП (зеленый цвет). Шкала бар: 50 мкм.получить = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь настой микрохирургии было доказано быть очень успешным в доставке экзогенных веществ различных биологических особенностей в ЦНС, предотвращая нежелательное распространение по всему телу 1, 12. Срыв гематоэнцефалического барьера является патологическим характеристика нескольких ЦНС-связанных заболеваний; Поэтому оценка взаимосвязи экзогенных веществ с гематоэнцефалического барьера имеет большое значение и интерес.
Эта модель хирургии представлена вызывает ограниченную травмирование животных и связано с очень низкой смертностью 1, 12. Кроме того, эта процедура не влияет на функцию ЦНС или мозгового кровотока 1, 12. Наиболее важным аспектом этой процедуры является выполнение правильного разреза в ECA, что должно позволить тольковставка капиллярной трубки. Более широкий разрез будет привести к утечке вещества должны быть пронизаны, требуя еще одну операцию ECA на противоположном участке. Для того чтобы предотвратить эту ситуацию, капиллярная трубка должна иметь больший диаметр, чем диаметр реза, а также должны иметь острый край, чтобы облегчить его вход через артерию. Что касается технического аспекта, полностью обученный персонал способен выполнять эту операцию в течение 20 минут.
Основным недостатком этого метода является возможность вливания только один раз через тот же ICA. Для доставки неоднократного веществ в ЦНС, сосуд Микропорт должен быть использован , и был описан ранее 1 .The способ , описанный здесь , имеет потенциал , чтобы помочь в исследованиях новых положительных и отрицательных взаимодействий внутри ВВВ, а также для доставки патогены , лекарственные препараты и физиологические агенты в мозг.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
