Introduction
Dans les modèles in vivo du système nerveux central (SNC) ont besoin d' une prestation efficace des substances exogènes, tels que les médicaments, les agents pathogènes, ou exosomes, dans le cerveau. Par conséquent, une méthode de distribution idéale devrait provoquer un traumatisme minimal à l'animal, de préserver l'intégrité du réseau neuronal, et d' atteindre des concentrations élevées de la substance dans le cerveau 1.
Plusieurs méthodes chirurgicales de distribution de substance locale ont été décrites, y compris intra-gaine, intracérébrale, et les injections intraventriculaire ou implants 2, 3, 4, 5. Ces approches, cependant, sont considérés comme traumatique du système nerveux central, et permettent l'administration des seuls volumes faibles de la substance d'intérêt. En outre, il a été suggéré que les substances exogènes peuvent être éliminées rapidement par le liquide céphalo - 6 7 lorsque les techniques mentionnées ci-dessus sont utilisées. Méthodes de libération systémique, comme par voie orale, pulmonaire, sous - cutanée et intraveineuse, sont plus couramment utilisés dans des modèles animaux, bien qu'ils présentent une faible efficacité dans la livraison des substances au système nerveux central, en raison de l' absorption par les autres organes 8, 9. Par conséquent, ces voies d'administration nécessitent des doses élevées de substances administrées, ce qui augmente le risque d'effets secondaires et de toxicité 10, 11.
Ici, nous décrivons une technique de microchirurgie d'infusion de souris, ce qui crée effectivement des substances directement dans le cerveau par l'intermédiaire de l'artère carotide interne. En plus de cibler la livraison au CNS, cette technique ne contourne pas les barrières physiologiques normales et est donc très pertinente pour biological processus impliqués dans les passages des agents thérapeutiques ou des agents pathogènes dans le cerveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les procédures impliquées dans le protocole suivant ont été approuvés par l'Université de Miami Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC). En outre, toutes les procédures sont menées dans des installations agréées par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC).
1. Préparation de la souris pour la chirurgie
- Anesthésier souris avec de l'isoflurane mélangé avec de l'oxygène, en utilisant un système de laboratoire de l'anesthésie. Utilisez isoflurane à mettre entre 4-5% et le débit d'oxygène à 2 L / min sur la machine commerciale (voir tableau Matériaux). Transférer l'animal à la surface de la chirurgie, sous un stéréomicroscope, et maintenir l'anesthésie en utilisant un cône de nez (utiliser le paramètre 1,5 isoflurane - 2,5 et de l'oxygène au débit de 2 L / min).
- Assurez-vous que la fréquence respiratoire de la souris est d'environ 1 - 2 respiration / sec sans haleter. En outre, veiller à ce que l'animal ne présente pas de réaction de stimulation des moustaches et de la pédale reFlex (pincement de l'orteil). Surveiller le taux de respiration et d' efforts au cours de la chirurgie, au moins tous les 5 min. Suivez spécifique Institutional Animal Care et utilisation Comité et directives vétérinaires pour la surveillance des rongeurs d'anesthésie.
- Appliquer une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil à l'aide d'un écouvillon stérile afin de prévenir la sécheresse. L'administration de l'anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l'inconfort est recommandée.
- Avec l'animal couché sur le dos, maintenir l'anesthésie à l'aide d'un cône de nez.
- Nettoyer la zone du cou de l'animal en essuyant la zone trois fois avec de l'éthanol à 70% et la chlorhexidine. Rasez la zone de chirurgie de l'animal à l'aide d'un rasoir (détaillé ci-dessous).
2. Dissection de l'artère carotide commune (CCA)
- Effectuez la procédure de microchirurgie entière sous un stéréomicroscope. Avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces effectuer une incision médiane peu profonde dans le cou, au-dessus du sternum au-dessous de til mâchoire (environ 3 à 4 cm).
- En utilisant une pince grasse soigneusement séparée et du tissu conjonctif pour exposer la trachée.
- Placer un oreiller (objet rond, d'environ 0,5 cm de diamètre) au dos du col de la souris pour s'étendre du col, ce qui expose en outre la région.
- Séparer le tissu en utilisant soit un écarteur de tissus ou des crochets.
- Sur le côté gauche de la trachée de l'animal, tweeze avec précaution le tissu conjonctif pour exposer le CCA gauche.
- Utiliser une pince retirer délicatement tous les tissus conjonctifs pour exposer la bifurcation CCA, et le début des deux artères carotides internes et externes.
3. Préparation de la CCA pour perfusion des substances
- Insérez deux segments de suture en nylon (environ 1 cm chacun) sous l'artère carotide externe (ECA), en utilisant une pince.
- Placez un nœud permanent au point possible de la CEA le plus élevé.
- Au point le plus bas possible de la CEA, immédiatement au-dessus de la bifurcation CCA, le lieuun noeud amovible. Ce nœud doit être lâche par rapport au nœud supérieur.
- Fermez le CCA en utilisant un clip de navire, au point le plus bas possible.
- Fermez l'artère carotide interne (ICA) à l'aide d'un clip navire.
- Utilisation de microdissection ciseaux à ressort effectuer une petite incision dans l'ECA (environ 2 mm), entre les deux nœuds.
4. Substance Infusion via ICA
- Assembler un système de perfusion. Fixer 6 pouces de tube capillaire (dimensions idéales: 2,5 mm x 1,2 mm) à une seringue tuberculine contenant 250 ul de la substance à infuser (médicaments, des agents pathogènes, des vésicules extracellulaires, entre autres) et insérez la pointe capillaire doucement dans l'incision réalisée à l'étape 3.6.
- Continuez à glisser vers le bas le capillaire jusqu'à ce qu'il atteigne un point médian entre la bifurcation et le clip de fermeture du CCA.
- Attachez le nœud de la CEA inférieure. Vérifiez que le noeud est suffisant pour permettre la fluidité capillaire lâche et assez serré pour empêcher leaking.
- Retirer l'attache de l'ICA.
- Appuyez doucement sur la substance perfusion seringue piston permettant à environ 10 pi par seconde.
5. Procédures de perfusion post
- Placez dos clip sur la CIA.
- Retirez délicatement le tube capillaire.
- Attachez le nœud ECA inférieure complètement.
- Retirer les clips de l'ICA et le CCA.
6. Incision clôture et des soins post-opératoires
- Retirer écarteur ou de tissus crochets et oreiller.
- zone de suture Nettoyer avec une solution saline stérile.
- Fermer l'incision en utilisant suture en nylon / aiguille et pince.
- Administrer anti-inflammatoire et analgésique pour soulager l'inconfort post-opératoire.
- Placez l'animal dans une cage placée sur un coussin chauffant pendant au moins 1 h et la récupération du moniteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La technique de microchirurgie d'infusion de souris décrit ici est très polyvalent et a été utilisé pour délivrer différentes substances directement dans le cerveau, y compris la fourniture des cellules tumorales dans un modèle représentatif de la formation de métastases cérébrales 1, 12.
Cette technique est également adaptée pour évaluer les aspects pathologiques de différents agents pathogènes présents dans le système nerveux central. Dans un modèle murin de l'infection par le VIH, la chirurgie de la perfusion a été utilisée pour injecter des particules virales directement dans l'ACC. Nous avons constaté que 7 jours après l'intervention chirurgicale, le système nerveux central a été positif pour le VIH par PCR en temps réel. En outre, l'infection de l' hémisphère ipsilatéral a été 6-10 plis supérieur à l'hémisphère contralateral (figure 2).
Une autre approche appropriée de la chirurgie de perfusion décrit ici est de fournir vésicules extracellulaires (VCE), principalement exosomes, dans le SNC. La figure 3 montre la présence de CD63, un marqueur pour des exosomes, marquées avec une protéine fluorescente verte (GFP) dans le cerveau d'une souris ipsilatéral 24 heures après la perfusion.
Figure 1: Représentation schématique de la perfusion via l'artère carotide interne. Dans l'insert (a) et (b) représentent la localisation des noeuds supérieurs et inférieurs, respectivement; (c) représente la petite coupure dans la CEA, à travers laquelle le tube capillaire est inséré (ligne grise). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4804fig2.jpg "/>
Figure 2: Détection du VIH par PCR en temps réel après perfusion virale via l'artère carotide interne. Les barres indiquent les niveaux moyens d' ADN VIH récoltées à partir de souris 7 jours après la perfusion par la gauche artère carotide interne. Les barres d'erreur représentent l'écart-type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: immunofluorescence de cerveau de souris Section Depicting GFP-tagged CD63, un marqueur Exosome, après VCE Infusion via l'artère carotide interne. L'image représentative représente une microvaisseaux du cerveau de la souris associée à CD63 exprimant VCE (vert). Barre d'échelle: 50 um.obtenir = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La microchirurgie de perfusion décrit ici a été prouvé être très efficace dans la prestation de substances exogènes de diverses caractéristiques biologiques dans le SNC, ce qui empêche la diffusion non désirée dans tout le corps 1, 12. Rupture de la barrière hémato-encéphalique est une caractéristique pathologique de plusieurs maladies liées au système nerveux central; Par conséquent évaluer la relation entre les substances exogènes à la barrière hémato-encéphalique est d'une importance et d'un intérêt majeur.
Ce modèle est présenté en chirurgie provoque un traumatisme limité aux animaux et est associée à une mortalité très faible 1, 12. En outre, la procédure de ne pas interférer avec la fonction du système nerveux central ou le débit sanguin cérébral 1, 12. L'aspect le plus critique de cette procédure est d'effectuer la bonne coupe de la CEA, qui ne devrait permettre à lal'insertion du tube capillaire. Une coupe plus large va provoquer une fuite de la substance à infuser, nécessitant une autre intervention chirurgicale de la CEA sur le site opposé. Afin d'éviter cette situation, le tube capillaire doit avoir un diamètre plus grand que la coupe, et doit également avoir un bord tranchant, afin de faciliter son entrée à travers l'artère. En ce qui concerne l'aspect technique, un personnel compétent est en mesure d'effectuer cette opération dans les 20 minutes.
La principale limitation de cette technique est la possibilité d'une perfusion qu'une seule fois par le même LIC. Pour administration d' une substance répétée dans le système nerveux central, un récipient microport doit être utilisé et a été précédemment décrit une technique .Le décrit ici est susceptible de contribuer aux études sur les nouvelles interactions positives et négatives au sein de la BHE, ainsi que pour délivrer des agents pathogènes , des médicaments et des agents physiologiques dans le cerveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).
- Frisella, W. A., et al. Intracranial injection of recombinant adeno-associated virus improves cognitive function in a murine model of mucopolysaccharidosis type VII. Mol Ther. 3 (3), 351-358 (2001).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Wu, G., et al. Targeted delivery of methotrexate to epidermal growth factor receptor-positive brain tumors by means of cetuximab (IMC-C225) dendrimer bioconjugates. Mol Cancer Ther. 5 (1), 52-59 (2006).
- Pignataro, G., Studer, F. E., Wilz, A., Simon, R. P., Boison, D. Neuroprotection in ischemic mouse brain induced by stem cell-derived brain implants. J Cereb Blood Flow Metab. 27 (5), 919-927 (2007).
- Sugiyama, Y., Kusuhara, H., Suzuki, H. Kinetic and biochemical analysis of carrier-mediated efflux of drugs through the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers: importance in the drug delivery to the brain. J Control Release. 62 (1-2), 179-186 (1999).
- Pardridge, W. M. Drug and gene delivery to the brain: the vascular route. Neuron. 36 (4), 555-558 (2002).
- Vantyghem, S. A., Postenka, C. O., Chambers, A. F. Estrous cycle influences organ-specific metastasis of B16F10 melanoma cells. Cancer Res. 63 (16), 4763-4765 (2003).
- Huang, R. Q., et al. Efficient gene delivery targeted to the brain using a transferrin-conjugated polyethyleneglycol-modified polyamidoamine dendrimer. FASEB J. 21 (4), 1117-1125 (2007).
- Liu, R., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Intracarotid delivery of oncolytic HSV vector G47Delta to metastatic breast cancer in the brain. Gene Ther. 12 (8), 647-654 (2005).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448 (7149), 39-43 (2007).
- Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels. Biol Trace Elem Res. , (2015).
