Summary
Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.
Abstract
תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) הם מתורבתים במבחנה עם מדיה שונה. הגבלות על השימוש שלהם במסגרות קליניות, אולם, תלויות בעיקר סיכוני Biohazard ודלקת פוטנציאל המופעלים על ידי חומרים מזינים xenogeneic לתרבות שלהם. נגזר אדם או חומרים רקומביננטי הם מועמדי הבחירה תחילה להפחתת התגובות האלה. לכן, תוספי תרבות וחומרים ממוצא עצמי מייצגים את החומרים המזינים הטובים ביותר ואת המוצרים הבטוחים.
כאן אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור הבידוד וההתרבות של hMSCs מח עצם בתנאים עצמיים - כלומר, סרום נגזרות חולה כתוספת עבור מדיום התרבות הפיברין כמו פיגום עבור ממשל hMSC. ואכן, hMSC / בונה קריש הפיברין יכול להיות שימושי מאוד עבור יישומים קליניים כמה. בפרט, אנו מתמקדים השימוש שלהם בכירורגיה אורטופדית, שבו קריש הפיברין נגזר דם עצמו התורם מותרחילופי משלוח מזין / פסולת תא יעיל. כדי להבטיח תנאי בטיחות אופטימליים, הוא בעל החשיבות העליונה, כדי למנוע את הסיכונים של שינוי hMSC ואת יתר רקמות. מסיבות אלה, הגישה המתוארת במאמר זה גם מצביע על התרחבות מינימלית vivo לשעבר hMSC, להפחית הזדקנות התא שינויים מורפולוגיים, ו-בידול osteo לטווח קצר לפני ההשתלה, כדי לגרום מפרט השושלת osteogenic, ובכך להקטין את הסיכון שלאחר מכן לא מבוקרת שִׂגשׂוּג.
Introduction
תאי סטרומה האדם mesenchymal (hMSCs) מייצגים את אחד המקורות הסלולריים הטובים ביותר לשימוש בהנדסת רקמות לקידום osteogenesis 1,2. הם מבודדים בקלות ממח עצם ורקמות בוגרות אחרות, ולהביע סמני משטח טיפוסיים כגון CD90, CD105, CD73 1. יתר על כן, הם יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, כגון אוסטאובלסטים, chondrocytes ו adipocytes 3. ההשפעות הטיפוליות שלהם מיוחסות ההתחדשות שלהם ומאפייני trophic 4. hMSCs יוכל לשמש בכירורגיה אורטופדית, כמו גם ביישומים קליניים משובי אחרים. הם רצויים בשילוב עם פיגומים, כדי לשפר את התוצאה הקלינית 5.
לעומת חומרים אחרים, הג'ל הפיברין מציג תכונות מעניינות כגון דביקות, ספיג והובלה יעילה של חומרים מזינים, אשר עושים את זה מאוד שימושי עבור מגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות 6,7.
ילדה = "jove_content"> האתגר העיקרי תרגום גישת הנדסת רקמות לתוך יישומים קליניים הוא השיג פיגום מלא-ביולוגית biosafe ו מדיום תרבות ללא קסנו, שחוסם כל השפעה זיהומיות או תגובתי.
בשיטה שלנו, ג'ל הפיברין, נגזרה דם של החולה עצמו, וסרום עצמי, לתרבות במבחנה hMSCs, הועסקו כפתרון טיפולי אפשרי בתחום האורתופדים 8.
לצורך קליני, hMSCs בדרך כלל מנוהלת באמצעות שני הליכים עיקריים: (i) נוהל "צעד אחד" (כלומר, מניפולציה מינימאלית), המאפשר השתלה האוטומטית של מח עצם, שלמים או מרוכזים (כלומר, תאי mononuclear), במהלך הניתוח; ו (ii) נוהל "שני השלבים" (כלומר, המניפולציה ענפה), אשר מבוסס על רחבת vivo לשעבר של hMSCs כדי להגדיל את התשואה שלהם לפני ההשתלה, ודורש Gמתקני MP 9. מעניין לציין, כי תאי culturing עם סרום מבוגר אנושי במקום נסיוב עגל שור מאפשר התאוששות, יחד עם hMSCs, של תת קבוצה של תאים (1 - 10% בתרבויות mononuclear) בשם ובתאים mesodermal (MPCs), מסוגל בידול במבחנה לתוך טריים hMSCs 10,11. לפיכך, hMPCs עשוי לשחק תפקיד משמעותי בתהליך ההתחדשות בהשוואת hMSCs לבד 12,13. לבסוף, אינדוקצית osteo לטווח קצר דוחף hMSCs להתחיל הבידול שלהם לתוך שושלת osteogenic מבלי לאבד השגשוג שלהם פוטנציאליים כדאי 12. תוצאות אלו מאשרים מחקרים קודמים דיווחו המוגברים היווצרות העצם vivo על ידי hMSCs, ואחריו preculture במדיום osteogenic 14. יתר על כן, קריש פלזמה עצמי כמו פיגום למסירת תא ניתן להשפיע בקלות על ידי המנתח מעוצב כדי להתאים את הצורה של חלל העצם 13.
therefore, שיטה זו יכולה להיות שימושית מאוד עבור אלה חוקרים ומטפלים אשר מכוונים תרגום תרפים hMSC המבוסס שלהם מהספסל אל מיטת החולה ביישומים אורטופדיים.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם להצהרה של ההסתדרות הרפואית העולמית של הלסינקי בנוגע להתנהלות האתית של בני אדם היה מעורב במחקר. זה אושר על ידי ועדת האתיקה של Azienda Ospedaliero-Universitaria פיזאנה.
הערה:
מח עצם התקבל בחולים העוברים ניתוח החלפת מפרק ירך הכולל שיגרתי (לפי צעד 1.1) 15; פלזמה לעריכת הקריש הושגה מדם היקפי עצמי 13; סרום אוטולוגי, כתוספת עבור מדיום התרבות, נאסף מתוך apheresis כל-דם עצמי. כל המטופלים קיבלו מידע מפורט על הליך וחתם על טופס הסכמה בכתב.
1. איסוף מדגם מח עצם
- אסוף מח עצם מהתעלה מדולר הירך לאחר ניתוח החלפת מפרק ירך (עבור מחקרים). בקצרה, במהלך תקופת ההכנה כירורגית של תעלה מהדולרית כדי hOuse הגבעול התותב, לאסוף את הדם במח העולה על גדותיה (כ 10 - 15 מיליליטר, תלוי בגודל התותב) 15.
אוֹ - אסוף לשאוב מח עצם מפסגת הכסל בהרדמה מקומית, בעקבות הליך המטולוגיות סטנדרטי על 20 - 30 ד מראש (עבור יישומים קליניים) 16.
הערה: בשני המקרים heparinized מזרקים (כדי למנוע היווצרות קריש) יש להשתמש לצורך התאוששות מח עצם.
2. הכנת פלזמה עצמית
- אסוף 20 מיליליטר של דם היקפי ממטופל צינורות איסוף דם ואקום המכילים EDTA K3 (5.4 מ"ג ב 3 צינורות מיליליטר) ו צנטריפוגות ב 2,400 × גרם במשך 15 דקות.
- לשאוב את רכיב פלזמה בתוך שפופרת 15 מ"ל ו ההקפאה ב -20 ° C עד השימוש.
3. הכנה של הסרום העצמי
- מעביר את יחידת הפלזמה לתוך שקית העברה באמצעות ספייק. ניתק את התיק המלא על ידי ריתוך weigh את השקית כדי לחשב את הנפח של הפלזמה (איור 1 א).
- להקריש הפלזמה העצמית על ידי הזרקת גלוקונאט סידן 100 מ"ג / מיליליטר ב 10% w / v דרך מחבר היציאה (האיור 1B). לאחר ערבוב את התיק, למקם אותו על 4 מעלות CO / N בלי ללחוץ כדי להקל היווצרות קריש דם.
- צנטריפוגה השקית 4,900 גרם × במשך 15 דקות ב RT. קח את הדלי צנטריפוגות מתוך צנטריפוגה ולהסיר את השקית בזהירות (פעל על פי ההנחיות של היצרן לעריכת lysate טסיות) (תרשים 1C).
- לבודד את הקריש בדיוק מעל המהדק כדי להקל סינון. חבר את ערכת הסינון לשקית ההעברה באמצעות ספייק להציב לתוך פתח היציאה של ערכת הסינון.
- לתלות את התיק ופתח את המהדק הכחול כדי לאפשר את הזרימה בסרום על ידי כוח הכביד. אל תפעילו לחץ על מסנן כדי למנוע העברה של הפיברין לשקית. לאחר סינון, לאטום את הצינורות ולהסיר את השקית (יש לעקוב אחר התעשייהההנחיות של turer להכנת lysate טסיות).
- חבר קו ייעודי אל בסרום השקית והעברה הסופי לתוך צינורות 50 מיליליטר תחת ספסל זרימה למינרית כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי.
- לקחת דגימה עם מזרק כדי לבדוק בהעדר פיברינוגן ולבצע בדיקת סטריליות עבור תרביות חיידקים אירוביים ואנאירוביים 17. לייבל הצינורות כראוי ולהקפיא אותם - 20 ° C עד השימוש.
4. הכנה הבינונית הרחב
- כן 500 מיליליטר של מדיום התפשטות מלא. כדי בינוני הנשר שונה של Dulbecco - גלוקוז נמוך (DMEM-LG), להוסיף 10% בסרום אוטולוגי (שהושגו כמפורט בסעיף 3), 2 מ"מ גלוטמין, 1% פתרון אנטיביוטיקה 1% פתרון antimycotic. מסנן סטרילי מדיום התפשטות המלא.
בידוד 5. hMSCs ממח העצם
- העבר בדגימת מוח העצם (5 - 10 מ"ל) מן המזרק לתוך חרוטי 50 מ"ל tuלהיות לדלל אותו עם מי מלח סטרילית (יחס 1: 4). וורטקס הצינור 50 מ"ל במשך 30 s ל disaggregate אשכולות התא.
- מומלץ לחמם את שיפוע צפיפות (L / 1.077 גרם צפיפות; ראו טבלה של חומרים) כדי RT לפני השימוש בשכבה במח העצם בדילול בעדינות (כדי למנוע ערבוב שתי שכבות) על שיפוע צפיפות על ידי הוספת 20 מ"ל של המדגם ל -15 מ"ל של צפיפות שיפוע לכל (איור 2 א) 50 צינור מ"ל.
- צנטריפוגה ב g 400 × ללא הבלם של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן לאסוף את השבר mononuclear בממשק נוזל-נוזל ולהעביר אותו צינור חדש 50 מ"ל בעזרת פיפטה 5 מ"ל סטרילי.
- שטוף את החלק יחסי mononuclear שנאסף פעמים עם מדיום התפשטות מלא צנטריפוגות הצינורות ב g 400 × 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס להשיג כדורי תא.
- בטל supernatant בעדינות resuspend כל גלולה תא 5 מ"ל של מדיום הפצת מלאה. לדלל ביחס של 1: יחס 100 עבור ספירת תאים.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer לאחר דילול 1: 1 עם מכתים Trypan כחול להעריך כדאיות התא.
6. תרבות של hMSCs בנוכחות סרום עצמי
- מלאו שתיים או יותר 75 ס"מ 2 רקמות תרבות (TC) צלוחיות עם 15 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי ולהעבירם חממה תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד השימוש.
- זרע 0.3 - 0.5 x 10 6 תאים / 2 ס"מ (37.5 x 10 6 תאים / 15 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
- במקביל, זרע 1 x 10 6 תאים בבקבוק 25 ס"מ 2 TC עם 5 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי עבור יחידת המושבה להרכיב - פיברובלסטים (CFU-F) assay. תרבות 2 שבועות (המשך יבוא בסעיף 12).
- מחק את בינוניים לשטוף בעדינות את צלוחיות משלב 6.2 עם מדיום התפשטות מלא remove תאים ופסולת nonadherent. הוסף בינוני טרי הצלוחיות ולהחליף חצי ממנו פעמים בשבוע, עד 70 - 80% confluency (תרבות העיקרית, מעבר 0 (P0)) (איור 2 ב).
- לשחזר את התאים באמצעות פרוטאז בחינם חיה ספציפית רקומביננטי (ראו טבלה של חומרים; להשתמש 3 מ"ל של הפתרון לכל בקבוק כפי המומלץ על ידי היצרן) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה לכל בקבוק ולאסוף בצינור אחד 50 מ"ל. חזור על שלב 5.6.
הערה: חשוב: השימוש פרוטאז זה במקום טריפסין מאפשרת התאוששות של כמה תאים mesodermal אבות (MPCs) נוכחים בתרבות, אשר טריפסין עמיד. - להתרחבות נוספת, replate ההשעיה התא 2,000 - 3,000 תאים / 2 ס"מ ב 75 ס"מ 2 TC צלוחיות חדש (P1) (איור 2 ג).
- השתמש aliquots של תאים כדי להעריך את פוטנציאל הבידול של MSCsלקראת osteogenic, adipogenic שושלות chondrogenic. לבצע מבחני בידול בעקבות המלצות היצרן (איור 2 ד).
הערה: שיטות מכתימות שונה שניתן להשתמש בם כדי להעריך בידול multilineage.
הכנת 7. של בינוני osteogenic עם תוספי התרופות
- לדלל פתרון חומצה אסקורבית (פתרון 1A:. חומצה אסקורבית 200 מ"ג / מ"ל (ראו טבלה של חומרים) 1:10 עם DMEM-LG, כדי להשיג פתרון 20 מ"ג / מ"ל (פתרון 1B, הפתרון עובד) aliquots מאגר של פתרונות 1A ו 1B ב -20 ° C עד השימוש.
- הידרוקורטיזון גלולה 1 גרם ב 10 מ"ל של מים סטריליים (פתרון 2A: הידרוקורטיזון 100 מ"ג / מ"ל (ראו טבלה של חומרים) מדוללת 2A 1:. 1,000 עם DMEM-LG כדי להשיג פתרון 100 מיקרוגרם / מ"ל (פתרון 2B, עובד פתרון). aliquots מאגר של פתרונות 2 א ו -2 ב -20 ° C עד השימוש.
- עם השימוש prepare בינוני osteogenic טריים כדלקמן: להוסיף DMEM-LG עם 10% בסרום אוטולוגי, 50 חומצה אסקורבית מיקרוגרם / מ"ל ו הידרוקורטיזון 0.4 מיקרוגרם / מ"ל. סטרילי-מסנן המדיום osteogenic.
8. osteogenic טרום אינדוקציה ושחזור של hMSCs
- להסיר לחלוטין את מדיום ההתפשטות ולהוסיף 96 שעות בינוניות osteogenic לפני קטיף תא (כלומר, 80 - 90 מפגש% בדרך כלל הוא הגיע ב -7 ד). לספק שינוי בינוני osteogenic נוסף 24 שעות לפני קטיף תא.
- לנתק את התאים כמתואר בשלב 6.5 בעדינות resuspend גלולה הוספת 2 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה בתוך שפופרת 50 מ"ל.
הערה: כדאיות התא עשוי להיות מופחת (כ -10%) כתוצאה osteoinduction. ניתן לצפות אגרגטים הסלולר. - לאחר ספירה, לשטוף את התאים עם מדיום התפשטות מלא צנטריפוגות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. Resuspend גלולה בעדינות ל 1 - 2 x 10 6 תאים קיימא / 2מיליליטר של פלזמה עצמית (ראה סעיף 2) לכל 50 צינור מיליליטר.
הכנת 9. hMSC / הפיברין קריש בונה
- להוסיף 150 μl של gluconate סידן ב 100 מ"ג / מ"ל על צינור אחד 50 מ"ל המתקבל צעד 8.3. ו resuspend התאים תחת רעד עדין.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במשך 15 - 30 דקות כדי להשיג בונת קריש hMSC / הפיברין (איור 3 א). כן מבנה קריש הפיברין ללא תאים לשמש כביקורת.
הערה: חשוב: זה recommendable להכין קריש שליטה זו לפחות 2 שעות לפני assay כדאיות התא, כפי שהוא לוקח 30 דקות או יותר כדי crosslink.
Assay כדאיות התא 10.
- הסר את הנוזל מתוך 50 צינורות מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום התפשטות מלאה המכילה מגיב כדאיות התא 10% v / v (AB; ראו טבלה של חומרים), על פי הנחיות היצרן.
- דגירת הצינורות דואר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שעות. מדוד את הספיגה ב 570 ננומטר עם אורך גל ייחוס של 600 ננומטר (AB בזמן 0; t0).
- בטל supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום הפצת שלם טרי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. למחרת (AB בשלב 24 שעות; T24), חזור על שלבים 10.1 כדי 10.3 (איור 3 ב).
הערכת היסטולוגיים 11. של כדאיות התא הפקדת סידן בתוך בונה קריש פיברין
- תקן את בונה קריש hMSC / הפיברין 4% w / v O נייטרלי שנאגרו פורמלין / N ב 4 ° C. 4x לשטוף D-PBS במשך 15 דקות ולאחסן באתנול 70%.
- מייבשים את הדגימות ב 40 ° C בסדרה של אתנול מדורג: 80% פעם למשך 30 דקות, 95% פעמים במשך 45 דקות ו 3x 100% במשך 1 שעה. להבהיר פעמים קסילן במשך 45 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
- שוטפים את דגימות פרפין נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות והטמיעו אותם. חותכים את גוש פרפין עם microtome ו הר tהוא סעיפים (5 מיקרומטר) על שקופיות זכוכית.
- כתם בסעיפי deparaffinized באמצעות Hematoxylin הסטנדרטי Eosin (H & E) שיטה (איור 3 ג).
- בצע מכתים פון Kossa ידי טיפול קטעים עם 1 כסף חנקתי% במשך 15 דקות, 0.5% Pyrogallol למשך 2 דקות, ו thiosulfate נתרן 5% למשך 2 דקות. Counterstain את החלקים עם אדום מהיר גרעיני 0.1% בדילול בתמיסה המכילה אלומיניום סולפט 5 גרם במשך 5 דקות ולשטוף אותם במי ברז במשך 5 דקות. הר החלק עם סוכן גובר.
- להעריך את בתצהיר מינרליים כמו גרגירים שחורים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה 400X) (איור 3D).
12. Assay CFU-F
- לשטוף את הבקבוק 25 ס"מ 2 (משלב 6.3.) עם D-PBS. כתם על ידי שימוש בשיטת מאי-גרינוולד / Giemsa הסטנדרטי. ראייה לכמת מספר hMSC כשקלע מושבות בודדות (איור 4) תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: אםמח העצם נלקח כמו בשלב 1.2. ואת סעיפים 2 - 9 הם ביצעו ב Good Manufacturing Practice (GMP) עם קבלת כל האישורים הרגולטוריים הנדרשים, המבנים קריש hMSC / הפיברין יכול להיות מושתל עבור יישומים אורתופדיות.
Representative Results
הכנת סרום אוטולוגי
קרישת פלזמה, שבוצעה על ידי הוספת גלוקונאט סידן לשקית ההעברה, מאפשרת התאוששות של סרום אוטולוגי בכמויות גדולות, כנדרש לתרבות hMSC. ואכן, עם טכניקה זו, ניתן להשיג עד 200 מ"ל של סרום (איור 1).
HMSC בידוד, התרבות והתמיינות שימוש בסרום אוטולוגי
תאי mononuclear מח עצם מבודדים באמצעות שיפוע צפיפות, אשר מוליד את שכבת טבעת ביניים (איור 2 א). על ידי ציפוי תאים אלה והסרה אלה nonadherent ברחצה, אפשר לבודד hMSCs (איור 2 ב). בתנאי תרבות עצמיים, קבוצת משנה של תאים, המכונה MPCs, מאותר על P0 ובאחוזים עד t o 10%, תלוי השתנות החולה (איור 2 ב). MPCs עדיין קיים לאחר replating (כלומר, P1) אם פרוטאז משמש passaging תא (איור 2 ג). hMSCs מבודד ותרבותי בסביבה עצמית לשמור על היכולת שלהם להבדיל כלפי שלוש שושלות mesodermal הידועות (osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic). מבחני הבידול בוצעו להשוות את זהות אוכלוסיית hMSC עם אלו המתקבלות באמצעות תקן תנאי תרבות (nonautologous). כמו מבחנים פונקציונליים עבור פרוטוקול זה, מכתים פון Kossa, מכתים tetroxide אוסמיום, והכתים כחול Alcian ב- pH 1 נבחרו במקום מאלו שהוצעו על ידי יצרן תקשורת בידול (ראה טבלה של חומרים) (איור 2 ד).
הכנה, כדאיות ואפיון היסטולוגית של מבני קריש MSC / הפיברין
together.within-page = "1"> hMSCs מפוזרים בפלסמה, שהוא צולבים ידי גלוקונאט סידן בתוך שפופרת 50 מ"ל, המוביל להיווצרות של דיסק ג'לי מוקף supernatant שלה (איור 3 א). בתוך קרישי פלזמה אלה, hMSCs הם קיימא, כפי שהודגם על ידי שינוי צבע של T24 לצבוע כדאיות התא מכחול (שליטה ללא תאים) לוורוד (קריש cellularized) (איור 3 ב). כדאיות התא בתוך קריש אושר על ידי צביעת H & E, מראה מורפולוגיה תאים השתמרו היטב (איור 3 ג). יתר על כן, osteoinduction מינימאלי ממש לפני קציר התא השני מוליד בתצהיר סידן טרומי hMSCs מגורה (איור 3D).
יחידת המושבה להרכיב
הנוכחות של מושבות hMSC לאחר 2 שבועות בתרבות מוצגת על ידי assay CFU-F (איור 4).
s = "jove_step" FO: keep-together.within-page = "1"> יישום של קריש MSC / הפיברין לבנות עצם האיחוד הלא
HMSC / קריש הפיברין בונה השיג כמתואר בשיטה זו (שלב 1.1) יושמו בהצלחה לטיפול nonunions גפה העליונה חמור 8 מקרים רחומים 13. לטווח ארוך הערכה (7.6 חודשים לכל היותר) אשרה את תוצאות קליניות ופונקציונליות מוצלחות לכל החולים, ללא עדות יתר רקמות או היווצרות גידול.
איור 1. הכנת עצמיים סרום.
(א) יחידת הפלזמה מועברת בתוך שקית העברה באמצעות ספייק; (ב) הפלזמה היא קורשת על ידי הזרקת גלוקונאט סידן באמצעות מחבר היציאה; (ג) צנטריפוגות דם תיק משמש להפריד את הנסיוב./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בידוד איור 2. hMSC, התרבות והתמיינות באמצעות עצמיים סרום.
(א) את שכבת התאים mononuclear (בחלון הקו הכחול) המתקבל לאחר מח עצם צנטריפוגה עם שיפוע צפיפות; (ב) תרבית תאים כפי שהוא מופיע ב P1; (C) תרבית תאים כפי שהיא מופיעה בחלק P0 (תרבות העיקרית); חצים - (ב ג) להראות נוכחות של MPCs בתרבות MSC. בר סולם הוא 100 מיקרומטר; (ד) תוצאות histochemical של מבחני בידול multilineage. בידול osteogenic נבחנת באמצעות פון Kossa מכתים להפקדה מטריקס מינרליים בידול שחור, adipogenic מוצג על ידי נוכחות של vacuoles שומן, מוכתם בשחור ידי אוסמיום tetroxiבידול דה, ו chondrogenic מוצג על ידי נוכחות של glycosaminoglycans גופריתי, אשר מוכתם ציאן ידי מכתים כחול Alcian בבר סולם pH 1. הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכנה איור 3., הכדאיות ו היסטולוגיים אפיון MSC / הפיברין קריש בונה.
(א) קריש hMSC / הפיברין לבנות כפי שהוא מופיע לאחר cross-linking; (ב) תוצאות של assay AB: את MSCs הם קיימא בתוך קריש הפיברין, כפי שהודגם על ידי שינוי צבע של צבע כדאיות התא (T24), מכחול (שליטה ללא תאים, מימין) לוורוד (קריש cellularized, על שמאל). (C - D) תוצאות histochemical של מבני קריש hMSC / הפיברין. סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. (C) Hematoxylin ו מכתים Eosin מראה תאי קיימא מוטבעים במטריצה הפיברין; (ד) בתצהיר מטריצת מינרליים מוכתם בשחור ידי מכתים פון Kossa, אשר מאשר osteogenesis ראשונית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. Assay CFU-F.
תמונה של בקבוק תרבותי עם hMSCs יוכתם שיטת מאי-גרינוולד / Giemsa. אזור zoomed-in הוא מיקרוסקופ-אור מראה את המורפולוגיה של מושבת hMSC. בר סולם הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
= "1"> 
איור 5. יישום של קריש hMSC / הפיברין Construct ב עצם שאינו שייך לאיגוד.
(א) רנטגן של הגפה העליונה של חולה מושפע pseudarthrosis; (ב) hMSC / הפיברין לבנות קריש רק לפני ההשתלה; (ג) בקשת כירורגים של מבנה קריש hMSC / הפיברין; (ד) רנטגן של הגפה העליונה של אותו החולה לאחר 5 שנים. נתון זה מחדש מאל Giannotti S. et. עם שינויים מינימליים 13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
השלבים הקריטיים של דאגת פרוטוקול זה את השימוש בסרום מבוגר אנושי פרוטאז, המאפשר לקבל טיפול hMSC biosafe. בפרט, הסרום המבוגר האנושי מאפשר בידוד ותחזוקה, תוך פרוטאז מבטיח הקציר, של MPCs. אלה הם בשלי תאים במח העצם שיכול להצמיח hMSCs הטרי, ובכך להבטיח מאגר של hMSCs קיימא לאורך זמן התרבות. לא כל MPCs ניתן לאסוף, מאז הגדלת זמן חשיפת הפעילות הפרוטאז היא מזיק כדאיות hMSC. מסיבה זו, דגירה פרוטאז 10 דקות נבחרה פשרה אופטימלית בין ההתאוששות של MPCs ואת הכדאיות של hMSCs. עוד צעד קריטי הוא זמן osteodifferentiation. אכן, רב osteodifferentiation במבחנה יפחית כדאיות התא באופן משמעותי, ובכך להשפיע על היווצרות העצם הסופי in vivo. השלב הקריטי האחרון מורכב availing של פיגום bioresorbable עצמי, which מתקבל על ידי הטבעת תאים (hMSCs ו MPCs) בתוך ג'ל הפיברין קרישת פלזמה.
צעד מרכזי כדי לשפר את התשואה של MPCs הוא זרע תאי mononuclear בריכוז גבוה. בעזרת הליכי apheresis להשיג פלזמת טיפול זה עם גלוקונאט סידן מאפשר להשיג סרום אוטולוגי בכמויות גדולות. זה נצפה כי נסיוב אדם כתוספת בינונית ניתן להשוות עוברי שור סרום (FBS) בתרבויות hMSC. עם זאת, הניסיון שלנו, מדיום שלם השלים עם FBS תורם להזדקנות מהר יותר בסרום אדם בוגר. צעד משמעותי זה של חולש על osteoinduction מינימלית hMSCs. ואכן, הטיפול הזה מוביל את התאים כדי להבדיל בקלות כלפי שושלת osteogenic, ובכך להיות שימושי כדי למנוע שינוי תא נוסף in vivo. כדי לשמור על כדאיות טובה של hMSCs osteoinduced המינימאלית, מומלץ לעקוב בזהירות ההמלצות כמתואר צעדי 6.5.ד 8.2., כוללים טיפול, צנטריפוגה וכמויות בינוניות להתווסף. אם הליך apheresis אינו זמין, זה עדיין אפשרי לבצע פרוטוקול זה על ידי ביצוע דם מרובים שואבת למטופל או, לחלופין, על ידי רכישת סרה AB נקווה. ברור, על מנת להביא בפרוטוקול זה מהספסל אל מיטת החולה, הוא חובה לקיים מפעלי תא GMP, או ושווי, זמין.
מגבלות על היישום של דאגת טכניקה זו-אונקולוגיה המטולוגית אנמית, וחולי אורתופדיים מושפע אוסטאומיאליטיס., ציור כמויות גדולות של דם מחולים אנמית, יש להימנע. בחולים אונקולוגיים, איכות דגימות תאים מושפע טיפולים כימותרפיים, ואילו חולים אוסטאומיאליטיס הזיהום יכול להשפיע על התוצאה הסופית. בכל המקרים שבם סרום אוטולוגי אינו מספיק או לא מתאים, סרה AB זכר ויקוו לייצג אלטרנטיבה טובה.
באמצעות תא / הפיברין CLOבונת t עבור יישומים קליניים אפשריים היא חיונית כדי לשחרר טיפול בתאים עצמי לחלוטין, אשר יכול להיות קל לטפל עובש במהלך ניתוח, וכתוצאה מכך תוצאות מצוינות לטיפול 13 הלא איגודי עצם. לצורך קליני, hMSCs בדרך כלל מנוהלת באמצעות שני הליכים עיקריים: מניפולציה מינימאלית ו -9 מניפולציה נרחבת. כדי להתגבר על הבעיות הקשורות תרבות נרחבת לשעבר vivo, כגון ליקויי מורפולוגיה תאים בגודל 18, בצענו זמן קצר לשעבר הרחבת תא vivo ו-בידול osteo (רק 4 ד).
פרוטוקול קסנו ללא המתואר במאמר זה, יחד עם פעמי התרחבות תא הקצרות osteodifferentiation, הפגין להיות רלוונטי במרפאות כדי להשיג ייצור עצם מהר in vivo, ללא עדות יתר רקמה וטרנספורמציה, ובכך אשר את היעילות והארוכה בטיחות -term תיקון עצם (איור 5) 13.
המתודולוגיה המוצג בדוח זה נועד להדגים את היעילות והבטיחות של hMSC בהרחבה במבחנה בתנאים עצמיים לשימוש אפשרי בכירורגיה אורטופדית. פרוטוקול זה מעסיק hMSCs מבודד ממח עצם בתרבית מדיום בתוספת סרום אוטולוגי ומוטבע קריש הפיברין עצמי, ובכך להבטיח טיפול בתאים עצמי לחלוטין. אינדוקצית osteogenic הכפולה, ממש לפני הניתוק השני, משפרת את יכולת hMSC להתמיין אוסטאובלסטים. כתוצאה מכך, טכניקה זו מתאימה במיוחד ליישומי פגמי עצם, שכן הוא אינו מוגבל pseudarthrosis. יישומים עתידיים אפשריים עשויים להיות כרוכים בניהול אובדן שפיע ציסטה ועצמות.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
