Summary
Культивирование человеческих клеток мезенхимальных стромальных (hMSCs) с аутологичной сыворотки, снижает риск отторжения от ксеногенного материала и других негативных последствий. Она также позволяет для восстановления подмножества мезодермальных предшественниках, которые могут доставить свежие hMSCs. Встраивание hMSCs в аутологичных фибринового сгустка обеспечивает простой и эффективной хирургической имплантации.
Abstract
Человеческие клетки мезенхимальных стромальных (hMSCs) культивировали в пробирке с различными средами. Ограничения на их использование в клинических условиях, однако, в основном зависит от потенциальных биологически опасных и воспаление рисков, оказываемого ксеногенных питательными веществами для их культуры. Человеческие производные или рекомбинантные материалы являются первыми кандидатами выбор, чтобы уменьшить эти реакции. Таким образом, культура добавки и материалы аутологичных происхождения представляют лучшие питательные вещества и безопасные продукты.
Здесь мы опишем новый протокол для изоляции и культуры hMSCs костного мозга в аутологичных условиях, а именно - пациента происхождения сыворотки в качестве дополнения для культуральной среды и фибрина в качестве каркаса для введения hMSC. В самом деле, hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть чрезвычайно полезны для нескольких клинических применений. В частности, мы ориентируемся на их использование в ортопедической хирургии, где тромб фибрина происходит от собственной крови донора разрешеноэффективной доставки клеток и питательных веществ / отходов обмены. Для обеспечения оптимальных условий безопасности, это крайне важно, чтобы избежать риска трансформации hMSC и разрастание ткани. По этим причинам подход , описанный в этой статье также указывает на минимально ех естественных условиях hMSC расширения, для уменьшения клеточного старения и морфологические изменения, а также краткосрочный костно-дифференциацию перед имплантацией, чтобы побудить остеогенной спецификации клонов, тем самым снижая риск последующего неконтролируемого пролиферации.
Introduction
Человек мезенхимальных стромальных клеток (hMSCs) представляют собой один из лучших источников клеток для использования в тканевой инженерии для содействия остеогенез 1,2. Они легко выделены из костного мозга и других тканей взрослого, и выражают типичные поверхностные маркеры , такие как CD90, CD105, CD73 1. Более того, они могут дифференцироваться в несколько типов клеток, таких как остеобласты, хондроциты и адипоциты 3. Их терапевтический эффект объясняется их регенеративных и трофических свойств 4. hMSCs можно было бы использовать в ортопедической хирургии, а также в других регенеративных клинических применений. Их предпочтительно в сочетании с подмостей, чтобы улучшить клинический исход 5.
По сравнению с другими материалами, гель - фибрин показывает интересные свойства , такие как липкостью, резорбции и эффективной транспортировки питательных веществ, что делает его чрезвычайно полезным для различных тканевой инженерии 6,7.
В нашем методе фибринового геля, полученного из собственной крови пациента, и аутологичной сыворотки, для культивирования в пробирке hMSCs, были использованы в качестве возможного терапевтического раствора в ортопедической области 8.
Для клинических целей hMSCs, как правило , управляются с помощью двух основных процедур: (I) процедуры "одностадийного" (т.е. минимальное манипуляции), что позволяет автоматическое пересадка костного мозга, либо полностью или концентрированные (т.е. мононуклеары), во время операции; и (II) , процедура "двухстадийный" (то есть, обширные манипуляции), который основан на экс виво расширения hMSCs , чтобы увеличить их урожайность до имплантации, и требует GMP 9 объектов. Интересно отметить , что культивированием клеток с взрослого человека сыворотки вместо коровьей сыворотки теленка позволяет извлекать вместе с hMSCs, подмножества клеток (1 - 10% в мононуклеарных культурах) , называемые Мезодерма клетки - предшественники (ПДК), которые способны дифференцироваться в пробирке в пресную hMSCs 10,11. Таким образом, hMPCs может играть существенную роль в восстановительном процессе, по сравнению с только 12,13 hMSCs. И, наконец, краткосрочные костно-индукционная толкает hMSCs , чтобы начать их дифференцировки в остеогенной линии без потери их пролиферативный потенциал и жизнеспособность 12. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования, которые сообщили усиливается в естественных условиях формирования костной ткани с помощью hMSCs, а затем с помощью предкультурой в остеогенной среде 14. К тому же , аутологичной сгустка плазмы , как помост для доставки клеток можно легко манипулировать с помощью хирурга и формованные , чтобы соответствовать форме кости полости 13.
Therefore, этот метод может быть очень полезным для тех исследователей и врачей, которые направлены на перевод их hMSC терапии на основе от скамьи к постели больного в ортопедической практике.
Protocol
Настоящий протокол был разработан в соответствии с декларацией Всемирной медицинской ассоциации Хельсинки относительно этического поведения исследований с участием людей. Он был одобрен Комитетом по этике Azienda Оспедальеро-Universitaria Pisana путем.
ЗАМЕТКА:
Костный мозг был получен у пациентов , проходивших рутинную тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (согласно пункту 1.1) 15; Плазма для приготовления сгустка получали из аутологичной периферической крови 13; аутологичной сыворотки, в качестве дополнения к культуральной среде, была собрана из аутологичных афереза цельной крови. Все пациенты получили подробную информацию о процедуре и подписали письменное информированное согласие.
1. Сбор пробы костного мозга
- Собирают костный мозг из бедренной кости костномозгового канала после тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (для научных исследований). Если коротко, то во время хирургической подготовки костномозгового канала к чУз ортопедическую стебель, собирают кровь мозга , которая перетекает (около 10 - 15 мл, в зависимости от размера протеза) 15.
ИЛИ - Сбор кости аспирация костного мозга из гребня подвздошной кости под местной анестезией, после стандартной процедуры гематологические около 20 - 30 г заранее (для клинического применения) 16.
Примечание: В обоих случаях гепарином шприцы (для предотвращения образования тромбов) должны быть использованы для восстановления костного мозга.
2. Получение аутологичной плазмы
- Сбор 20 мл периферической крови от пациента в приборке вакуумной крови, содержащих K3 ЭДТА (5,4 мг в 3 мл пробирки) и центрифуге при 2400 & bull; g в течение 15 мин.
- Аспирируйте компоненты плазмы в 15 мл трубки и не замерзает при -20 ° С до использования.
3. Приготовление аутологичной сыворотки
- Передача единицы плазмы в сумку переноса с использованием шип. Отсоедините заполненный мешок с помощью сварки и Weigч мешок для расчета объема плазмы (фиг.1А).
- Коагулирования аутологичной плазмы путем введения глюконата кальция 100 мг / мл при 10% вес / об через порт разъема (Рисунок 1В). После смешивания пакет, поместите его на 4 ° CO / N без встряхивания, чтобы облегчить образование тромбов.
- Центрифуга мешок в 4900 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Возьмите центрифугу ведро из центрифуги и осторожно снять мешок (следовать рекомендациям производителя по подготовке тромбоцитов лизата) (Рисунок 1C).
- Изолировать тромб прямо над зажимом, чтобы облегчить фильтрацию. Подключение комплекта фильтрации к сумке переноса использованием стержневой помещен в выходной порт комплекта фильтрации.
- Повесьте мешок и открыть синий зажим чтобы поток в сыворотке крови под действием силы тяжести. Не давите на фильтр, чтобы избежать передачи фибрина в мешок. После фильтрации, запечатать трубку и удалите мешок (следовать изготовлпринципы дитель для получения тромбоцитов лизата).
- Подключение по выделенной линии до конечной мешок и переноса сыворотки в 50 мл пробирки под лавкой ламинарного потока, чтобы избежать микробного загрязнения.
- Возьмите пробу с помощью шприца , чтобы проверить отсутствие фибриногена и провести испытание стерильности для аэробных и анаэробных бактериальных культур 17. Пометьте пробирки надлежащим образом и заморозить их при - 20 ° C до использования.
4. Подготовка расширения среды
- Подготовьте 500 мл полной среды распространения. Для Дульбекко модификации Дульбекко - низкий уровень глюкозы (DMEM-LG), добавьте 10% аутологичной сыворотки (полученного, как описано в разделе 3), 2 мМ глутамина, 1% раствор антибиотика и 1% противогрибкового раствора. Стерильный фильтр полная среда распространения.
5. Выделение hMSCs из костного мозга
- Переноса образца костного мозга (5 - 10 мл) из шприца в 50 мл коническую втбыть и разбавить его стерильным физиологическим раствором (соотношение 1: 4). Вихре 50 мл трубки в течение 30 лет, чтобы детализировать кластеры клеток.
- Подогреть градиент плотности (плотность 1,077 г / л, см таблицу материалов) до комнатной температуры перед использованием и слой разбавленного костный мозг мягко (для предотвращения смешивания обоих слоев) на градиент плотности путем добавления 20 мл образца до 15 мл плотности градиент для каждого 50 мл трубки (рисунок 2А).
- Центрифуга при 400 х г без тормоза при 25 ° С в течение 30 мин, затем собирают фракцию мононуклеарных на границе раздела жидкость-жидкость и перенести ее в новый 50 мл пробирку с использованием стерильного 5 мл пипетки.
- Промыть собранную фракцию мононуклеарных дважды с полной средой пролиферации и центрифугировать пробирки при 400 × г в течение 10 мин при 25 ° С для получения клеточных гранул.
- Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют каждый осадок клеток в 5 мл полной среды распространения. Развести в соотношении 1: 100 для подсчета клеток.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра после того, как 1: 1 разбавление окрашивания трипановым синим, чтобы оценить жизнеспособность клеток.
6. Культура hMSCs в присутствии аутологичной сыворотки
- Заполните два или более 75 см 2 культуры ткани (TC) колбах с 15 мл свежей полной среды распространения и не передавать их в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 до использования.
- семенной 0,3 - 0,5 х 10 6 клеток / см 2 (37,5 х 10 6 клеток / 15 мл свежей полной среды пролиферации) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 ч.
- В то же время, начальное число 1 х 10 6 клеток в 25 см 2 ТК колбе с 5 мл свежей полной среды распространения для формирующего устройства колонии - фибробласта (CFU-F) анализа. Культура в течение 2-х недель (будет продолжено в разделе 12).
- Выбросьте среды и аккуратно мыть колбы с шага 6.2 с полной средой распространения РемуОве прилипших клеток и мусора. Добавить свежую среду в колбах и заменить половину его два раза в неделю, до 70 - 80% сплошности (первичной культуры, прохождение 0 (P0)) (рис 2В).
- Восстановление клеток с использованием конкретного свободного протеазы рекомбинантный животных (таблица материалов; используют 3 мл раствора на колбу в соответствии с рекомендациями производителя) и инкубируют при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 10 мин. Добавить 6 мл полной среды распространения на колбу и собирают в одну 50 мл трубки. Повторите шаг 5.6.
Примечание: ВАЖНО: Использование этой протеазы вместо трипсина позволяет восстановление некоторых мезодермальных предшественниках клеток (ПДК) , присутствующих в культуре, которая трипсина устойчивостью. - Для дальнейшего расширения, replate клеточной суспензии при 2000 - 3000 клеток / см 2 в новом 75 см 2 TC колб (P1) (рис 2С).
- С помощью аликвот клеток, чтобы оценить дифференциацией потенциалы ПКЦв направлении остеогенных, Adipogenic и хондрогенными родословных. Провести дифференциацию анализов в соответствии с рекомендациями производителя (рис 2D).
Примечание: Различные методы окраски могут быть использованы для оценки мультилинейной дифференциации.
7. Подготовка Остеогенной среды с фармацевтических добавок
- Разбавленный раствор аскорбиновой кислоты (раствор 1А:. Аскорбиновая кислота 200 мг / мл (табл материалов) в соотношении 1:10 с DMEM-LG, чтобы получить 20 мг / мл раствора (раствор 1В, рабочий раствор) Фото аликвот растворов 1А и 1В при -20 ° С до использования.
- Ресуспендируют 1 г гидрокортизона в 10 мл стерильной воды (раствор 2А: гидрокортизон 100 мг / мл (см Таблицу материалов) разведенный раствор 2А в соотношении 1:. 1000 с DMEM-LG , чтобы получить 100 мкг раствора / мл (раствор 2B, работая раствор). Сток аликвоты растворов 2А и 2В при -20 ° С до использования.
- При использовании рсвежий остеогенной его восстановить среду следующим образом: добавить DMEM-LG с 10% аутологичной сыворотки, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты и 0,4 мкг / мл гидрокортизона. Стерильный фильтр остеогенный среда.
8. Остеогенная Предварительная индукция и восстановление hMSCs
- Полностью удалить среду распространения и добавить остеогенных средних 96 ч до сбора клеток (то есть, 80 - 90% стечение обычно достигается в 7 г). Обеспечить дополнительный остеогенных замены среды за 24 ч до сбора клеток.
- Открепления клеток, как описано на стадии 6.5, и осторожно ресуспендируют осадок добавлением 2 мл полной среды пролиферации в трубке 50 мл.
Примечание: Жизнеспособность клеток может быть снижена (около 10%) , в результате остеоиндукции. Клеточные агрегаты можно наблюдать. - После подсчета, промыть клетки с полной средой пролиферации и центрифуге при 300 × г в течение 5 мин. Ресуспендируют осадок осторожно на 1 - 2 х 10 6 жизнеспособных клеток / 2мл аутогенной плазмы (см раздел 2) на 50 мл трубки.
9. Получение hMSC / фибринового сгустка конструктов
- Добавьте 150 мкл глюконата кальция в количестве 100 мг / мл в каждую пробирку по 50 мл полученного на стадии 8.3. и клетки вновь суспендируют при осторожном встряхивании.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 15 - 30 мин , чтобы получить hMSC / фибринового сгустка конструкции (рис 3 , а ). Подготовьте фибринового сгустка конструкцию без клеток, которые будут использоваться в качестве контроля.
Примечание: ВАЖНО: Это рекомендуется подготовить этот контроль сгустка по крайней мере , 2 ч до анализа жизнеспособности клеток, так как она занимает 30 минут или более сшивать.
10. Жизнеспособность клеток Анализ
- Удалите жидкость из 50 мл пробирки и добавляют 1 мл полной среды пролиферации , содержащей 10% v / v жизнеспособность клеток реагента (AB, см таблицу материалов), в соответствии с рекомендациями производителя.
- Выдержите тысе пробирки при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в течение 3 часов. Измеряют поглощение при 570 нм с эталонной длине волны 600 нм (АВ в момент времени 0, t0).
- Удалите супернатант и добавляют 2 мл свежей полной среды распространения. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 O / N. На следующий день (AB в момент времени 24 ч, T24), повторите шаги с 10.1 до 10.3 (Рисунок 3B).
11. Гистологическое Оценка Жизнеспособность клеток и отложение кальция внутри фибринового сгустка конструктов
- Закрепить / фибринового сгустка конструкции hMSC в 4% вес / об нейтральном буферном растворе формалина O / N при 4 ° С. Вымойте 4x в D-PBS в течение 15 мин и хранят в 70% этаноле.
- Обезвоживают образцы при температуре 40 ° С в серии градуированных этанола: 80% один раз в течение 30 мин, 95% в два раза в течение 45 мин и 3 х 100% в течение 1 ч. Уточнить дважды в ксилоле в течение 45 мин при 40 ° С.
- Промыть образцов в жидком парафине при 60 & deg; С в течение 2 ч и вставлять их. Вырезать блок парафина с помощью микротома и смонтировать тон секции (5 мкм) на стеклах.
- Пятно депарафинировали секции , используя стандартный метод гематоксилином и эозином (H & E) (рис 3C).
- Выполните фон Косса окрашивания путем обработки участков с добавлением 1% нитрата серебра в течение 15 мин, 0,5% Пирогаллол в течение 2 мин, 5% раствором тиосульфата натрия в течение 2 мин. Проводят контрастное участки с 0,1% ядерного быстрого красного, разбавленного в растворе, содержащем 5 г сульфата алюминия в течение 5 мин и ополаскивают их в водопроводной воде в течение 5 мин. Установите секции с монтажным агентом.
- Оценка минерального осаждения в виде черных гранул под световым микроскопом (400X увеличение) (Рисунок 3D).
12. КОЕ-F Анализ
- Промыть колбу 25 см 2 (со стадии 6.3.) С D-PBS. Пятно с использованием стандартного метода, Май-Грюнвальд / Giemsa. Визуально количественно число hMSC, забив отдельных колоний (Рисунок 4) под световым микроскопом.
Примечание: Есликостный мозг принимается на шаге 1.2. а секции 2 - 9 выполняются в надлежащей производственной практики (GMP) с необходимым одобрения регулирующих органов, в hMSC / фибринового сгустка конструкции могут быть имплантированы для ортопедических приложений.
Representative Results
Получение аутологичной сыворотки
Коагуляция, осуществляется путем добавления кальция глюконат в передаточное мешок, позволяет извлекать аутологичной сыворотки в больших количествах, как это требуется для культуры hMSC. В самом деле, с этой техникой, можно достичь до 200 мл сыворотки (рисунок 1).
HMSC изоляция, культура и дифференциации с использованием аутологичной сыворотки
Костные мононуклеарные клетки костного мозга выделяют с использованием градиента плотности, что приводит к промежуточному слою кольцевого (фиг.2А). Путем покрывать эти клетки и удаления прилипших них с промывкой, то можно изолировать hMSCs (рис 2б). При аутологичных условиях культивирования, подмножество клеток, называемых ПДКп, обнаруживаются при P0 и в процентах до тO 10%, в зависимости от вариабельности пациентов (Фигура 2В). ПДКп все еще присутствуют после replating (т.е. P1) , если протеаза используется для клеточного пассирования (фиг.2с). hMSCs выделяют и культивируют в аутологической обстановке поддерживать их способность дифференцироваться в направлении трех хорошо известных мезодермальных клонов (остеогенной, липогенный и хондрогенными). Дифференцирования анализы проводили для сравнения идентичности населения hMSC с результатами, полученными с использованием стандартных (nonautologous) условий культивирования. Как были выбраны функциональные анализы для этого протокола, фон Косса окрашивания, четырехокиси осми окрашивания и Альциановый Синей окрашивания при рН 1 вместо предложенным производителем дифференцировки (таблица материалов) (рис 2D).
Подготовка, жизнеспособность и гистологическое характеристика MSC / фибринового сгустка конструкций
(рис 3 , а ). Внутри этих плазменных сгустков, что hMSCs жизнеспособны, о чем свидетельствует изменение цвета Т24 красителя жизнеспособность клеток от синего (управления без клеток) до розового (cellularized тромб) (рис 3B). Жизнеспособность клеток внутри сгустка подтверждается с помощью окрашивания H & E, показывая хорошо сохранившийся морфологии клеток (рис 3C). Кроме того, минимальный остеоиндукция как раз перед второй урожай клеток приводит к предварительным депонированием кальция Стимулируемой hMSCs (рис 3D).
Колониеобразующих Unit
Присутствие hMSC колоний через 2 недели в культуре показано с помощью анализа КОЕ-F (рисунок 4).
s = "jove_step" ВОК: Keep-together.within-страницу = "1"> Применение MSC / фибринового сгустка построить в костном несращения
HMSC / фибринового сгустка конструкции , полученные , как описано в этом методе (этап 1.1) были успешно применены для лечения тяжелых верхних конечностей несращения в 8 сострадательных случаях 13. Долгосрочный (максимум 7,6 мес) оценки подтвердили успешные клинические и функциональные результаты для всех пациентов, без признаков разрастания ткани или образования опухоли.
Рисунок 1. Получение аутологичной сыворотки.
(А) Устройство плазма переносится в сумке переноса с использованием шип; (В) Плазма коагулируют путем введения кальция глюконат через разъем порта; (C) гематоэнцефалический мешок центрифуга используется для отделения сыворотки./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. hMSC Изоляция, культуры и дифференцировка с использованием аутологичной сыворотки.
(A) мононуклеарных клеток слой (в окне синей линии) , полученные после того, как костный мозг центрифугирование с градиентом плотности; (В) культуры клеток , как представляется , в P1; (С) клеточной культуре , как это кажется на P0 (первичная культура); (B - C) Стрелки показывают наличие MPCs в культуре MSC. Шкала бар составляет 100 мкм; (D) Гистохимические результаты мультилинейной дифференциации анализов. Остеогенная дифференциация оценивается с использованием фон Косса окрашивания для нанесения минеральной матрицы в черном, адипогенной дифференциации проявляется наличием жировых вакуолей, окрашенных в черный цвет с помощью осмия tetroxiде, и хондрогенный дифференциация отображается наличием гликозаминогликанов, которые окрашивают в голубой цвет по альциановым голубым окрашиванием при рН 1. Шкала бар составляет 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Подготовка, Жизнеспособность и гистологические Характеристика MSC / фибринового сгустка конструктов.
(A) / фибринового сгустка hMSC построить , как он появляется после сшивания; (B) Результаты AB - анализ: MSCs являются жизнеспособными внутри фибринового сгустка, о чем свидетельствует изменение цвета жизнеспособность клеток красителя (T24), от синего (контроль без клеток, справа) до розового (cellularized тромб, на оставил). (C - D) Гистохимические результаты hMSC / фибринового сгустка конструкций. Шкала бар50 мкм. (С) гематоксилином и эозином окрашивания показывая жизнеспособных клеток , внедренных в матрицу фибринового; (D) Минеральная матрица осаждения окрашенных в черный цвет на фон Косса окрашивания, что подтверждает первоначальную остеогенез. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. CFU-F анализа.
Изображение колбе культивировали с hMSCs окрашивали методом May-Grunwald / Гимза. Увеличиваемую область представляет собой светло-микрофотография, показывающая морфологии колонии hMSC. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Применение hMSC / фибринового сгустка Построить в костном несращением.
(A) рентгенография верхней конечности пациента , пострадавших от псевдоартрозов; (B) hMSC / фибринового сгустка конструкцию непосредственно перед имплантацией; (C) Хирургический применение hMSC / фибринового сгустка конструкции; (D) рентгенография верхней конечности одного и того же пациента через 5 лет. Эта цифра переиздана из Джианнотти С. и др. с минимальными изменениями 13. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Критические шаги этого протокола касаются использования взрослого сыворотки человека и протеазы, которые позволяют получить BIOSAFE hMSC терапию. В частности, взрослого человека в сыворотке крови позволяет изоляции и технического обслуживания, в то время как протеаза обеспечивает урожай, ПДК. Эти незрелые клетки, присутствующие в костном мозге, которые могут привести к новым hMSCs, обеспечивая тем самым резервуар жизнеспособных hMSCs по времени культивирования. Не все ПДКп можно собирать, так как увеличение времени экспозиции к активности протеаз отрицательно сказывается на жизнеспособности hMSC. По этой причине инкубации протеазы в 10 мин был выбран в качестве оптимального компромисса между восстановлением и MPCs жизнеспособности hMSCs. Другим важным шагом является время osteodifferentiation. Действительно, обширная в пробирке osteodifferentiation бы значительно снизить жизнеспособность клеток, влияя таким образом на окончательное формирование костной ткани в естественных условиях. Последний важный шаг заключается в том, пользующимися из аутологичных биорезорбируемого эшафот, whicч получают путем встраивания клеток (hMSCs и MPCs) в виде геля фибрина из плазмы свертываемости.
Ключевым шагом для повышения урожайности MPCs является семян мононуклеарных клеток при более высокой концентрации. С помощью процедуры Аферезная для получения плазмы и обработки его глюконата кальция позволяет достичь аутологичной сыворотки в больших количествах. Было установлено, что сыворотка крови человека в качестве среды добавка сопоставима с фетальной бычьей сыворотки (FBS) в hMSC культурах. Тем не менее, по нашему опыту, полная среда с добавлением FBS способствует более быстрому старению, чем у взрослого человека сыворотки. Важным шагом является то, что введение минимальной остеоиндукция к hMSCs. На самом деле, это лечение приводит клетки легко дифференцировать к остеогенной линии, таким образом , быть полезным , чтобы избежать дальнейшей трансформации клеток в живом организме . Для того, чтобы поддерживать хорошую жизнеспособность минимально osteoinduced hMSCs, рекомендуется тщательно соблюдать рекомендации, описанные в шагах 6.5.d 8.2., в том числе обработка, центрифугирование и средние суммы, которые будут добавлены. Если процедура афереза недоступна, это все еще возможно осуществить этот протокол, выполняя несколько кровь привлекает к пациенту или, в качестве альтернативы, при покупке Pooled AB сывороток. Очевидно, что для того, чтобы довести этот протокол от скамьи к постели больного, обязательно иметь фабрики клеток GMP, или их эквиваленты, освобождена.
Ограничения к применению этой методики касаются анемией, гематологического-онкология и ортопедических больных, пострадавших от остеомиелита., Drawing большое количество крови от пациентов с анемией, следует избегать. В онкологических больных, качество образцов клеток зависит от химиотерапии, в то время как у пациентов, остеомиелит инфекция может повлиять на конечный результат. Во всех случаях, в которых аутологичной сыворотки является недостаточным или неподходящим, объединяли мужчины AB сывороток представляют собой хорошую альтернативу.
Использование клеток / фибрина CLOт конструкции для возможных клинических применений важно , чтобы выпустить полностью аутологичных клеточную терапию, которая может быть простой в обращении и плесени во время операции, что приводит к отличным результатам для лечения костей , не являющиеся союзам 13. Для клинических целей hMSCs обычно вводят с помощью двух основных процедур: минимальные манипуляции и обширные манипуляции 9. Для преодоления проблем , связанных с обширной экс естественных условиях культуры, такие как аномалии в морфологии и размера 18 клеток, мы провели некоторое время экс расширения естественных клеток и костно-дифференцировки (только 4 г).
Протокол Зенона бесплатно описанный в этой статье, наряду с короткими расширения клеток и osteodifferentiation раз продемонстрировал свою актуальность в клиниках для того , чтобы получить быстрое производство костной ткани в естественных условиях, без признаков разрастания ткани и трансформации, подтвердив тем самым его эффективность и длительный -term безопасности в ремонте кости (рисунок 5) 13.
Методология , представленная в настоящем докладе , направлен на демонстрацию эффективности и безопасности hMSC в пробирке расширения в аутологичных условиях для возможного использования в ортопедической хирургии. Этот протокол использует hMSCs, выделенные из костного мозга и культивировали в среде, дополненной аутологичной сыворотки и заливали в аутологичной фибринового сгустка, обеспечивая тем самым полностью аутологичной клеточной терапии. Два раза остеогенной индукции, как раз перед вторым отрядом, улучшает способность hMSC дифференцироваться в остеобласты. В результате, этот способ особенно подходит для применения в костных дефектов, так как оно не ограничивается псевдоартрозов. Возможные будущие приложения могут включать в себя Talus кисту и управление потерей костной массы.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
