Summary
Odling humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) med autologt serum, minskar risken för avstötning av xenogena material och andra negativa effekter. Det gör det också möjligt för återvinning av en delmängd av mesodermala stamceller, som kan leverera färska hMSCs. Bädda hMSCs i en autolog fibrinkoagel möjliggör enkel hantering och effektiv kirurgisk implantation.
Abstract
Humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) odlas in vitro med olika medier. Gränser för deras användning i kliniska situationer, dock främst bero på potentiella Biohazard och inflammation risker som utövas av xenogena näringsämnen för sin kultur. Mänskliga derivat eller rekombinanta material är förstahandsvalet kandidater för att minska dessa reaktioner. Därför, kultur kosttillskott och material autolog ursprung representerar de bästa näringsämnen och de säkraste produkterna.
Här beskriver vi ett nytt protokoll för isolering och odling av benmärgs hMSCs i autologa förhållanden - det vill säga, patient härlett serum som ett komplement för odlingsmedium och fibrin som en byggnadsställning för hMSC administration. I själva verket kunde hMSC / fibrinkoagel konstruktionerna vara ytterst användbart för flera kliniska tillämpningar. Framför allt fokuserar vi på deras användning i ortopedisk kirurgi, där fibrintromben härrör från givarens eget blod tillåtseffektiv cell leverans och närings / avfalls utbyten. För att säkerställa optimala säkerhetsförhållanden, är det av yttersta vikt för att undvika risken för hMSC omvandling och vävnads överväxt. Av dessa skäl, det tillvägagångssätt som beskrivs i detta dokument visar också en minimalt ex vivo hMSC expansion, för att minska cellåldrande och morfologiska förändringar, och på kort sikt osteo-differentiering före implantation, för att inducera osteogen härstamning specifikation, vilket minskar risken för okontrollerad spridning.
Introduction
Humana mesenkymala stromaceller celler (hMSCs) representerar en av de bästa cellkällor för användning i vävnadsteknik för främjande av osteogenes 1,2. De är lätt isoleras från benmärg och andra vuxna vävnader, och uttrycka typiska ytmarkörer såsom CD90, CD105, CD73 1. Dessutom kan de differentiera i flera celltyper, såsom osteoblaster, kondrocyter och adipocyter 3. Deras terapeutiska effekter tillskrivs deras regenerativ och trofiska egenskaper 4. hMSCs skulle kunna användas i ortopedisk kirurgi, såväl som i andra regenerativa kliniska tillämpningar. De är företrädesvis kombineras med byggnadsställningar, för att förbättra det kliniska resultatet 5.
Jämfört med andra material, visar fibringelen intressanta egenskaper, såsom vidhäftningsförmåga, resorption och effektiv transport av näringsämnen, som gör det mycket användbart för en mängd olika vävnadstekniska tillämpningar 6,7.
I vår metod, fibrin gel, som härrör från patientens eget blod, och autologt serum, för in vitro hMSCs kultur, användes som en möjlig terapeutisk lösning i det ortopediska området 8.
För kliniska ändamål är hMSCs vanligtvis administreras via två huvud förfaranden: (i) förfarandet (dvs minimal manipulation) "ett steg", som gör det möjligt att automatiskt transplantation av benmärg, antingen hela eller koncentrerad (dvs mononukleära celler), under kirurgi; och (ii) förfarandet (dvs omfattande manipulation) "två steg", som bygger på ex vivo expansion av hMSCs att öka deras avkastning före implantering, och kräver GMP faciliteter 9. Interestingly, odling av celler med humant vuxen serum istället för bovint kalvserum tillåter återhämtning tillsammans med hMSCs, av en underuppsättning av celler (1 - 10% i mononukleära kulturer) kallas mesodermala stamceller (MPCs), med förmåga att in vitro differentiering till färskt hMSCs 10,11. Sålunda kan hMPCs spela en betydande roll i den regenerativa processen i jämförelse med enbart 12,13 hMSCs. Slutligen skjuter kortsiktiga osteo-induktion hMSCs att starta sin differentiering i den osteogena linjen utan att förlora sin proliferativ potential och livskraft 12. Dessa resultat bekräftar tidigare studier som har rapporterat förstärkt in vivo benbildning genom hMSCs, följt av en förkultur i osteogen mediet 14. Dessutom kan en autolog plasmakoagel som en ställning för celladministrering med lätthet manipuleras av kirurgen och formas för att passa formen på benkaviteten 13.
therefore, kan denna metod vara mycket användbart för dessa forskare och kliniker som syftar till att översätta deras hMSC-baserad terapi från bänken till säng i ortopediska applikationer.
Protocol
Det nuvarande protokollet har utvecklats i enlighet med World Medical Association Helsingforsdeklarationen om etiska av forskning som avser människor. Den godkändes av den etiska kommittén för Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana.
NOTERA:
Benmärg erhölls från patienter som genomgår rutin total höftledsplastik (enligt steg 1,1) 15; plasma för koagel beredning erhölls från autolog perifert blod 13; autologt serum, som ett komplement för odlingsmediet, uppsamlades från en autolog hel-blod aferes. Samtliga patienter fick detaljerad information om förfarandet och undertecknat ett skriftligt medgivande.
1. Insamling av den benmärgsprov
- Samla benmärg från lårbensmärgkanalen efter en total höftledsplastik (för studier). Kortfattat, under det kirurgiska beredningen av märgkanalen till house protesskaftet, samla märgen blodet som flödar över (ca 10 till 15 ml, beroende på protesens storlek) 15.
ELLER - Samla benmärgsaspirat från höftbenskammen under lokalbedövning, följande standard hematologisk förfarande omkring 20 - 30 d i förväg (för kliniska tillämpningar) 16.
OBS: I båda fallen hepariniserade sprutor (för att förhindra blodproppsbildning) måste användas för benmärgs återhämtning.
2. Framställning av autolog plasma
- Samla 20 ml perifert blod från patienten i vakuumblodinsamlings rör innehållande K3-EDTA (5,4 mg i 3 ml rör) och centrifugera vid 2400 x g under 15 min.
- Aspirera plasmakomponenten i en 15 ml rör och frys vid -20 ° C fram till användning.
3. Beredning av autolog serum
- Överför plasmaenhet i en överföringspåsen med hjälp av en spik. Koppla den fyllda säcken genom svetsning och Weigh påsen för att beräkna volymen av plasma (Figur 1A).
- Koagulera autolog plasma genom att injicera kalciumglukonat 100 mg / ml vid 10% vikt / volym genom porten kontakten (Figur 1B). Efter blandning påsen, placera den vid 4 ° CO / N utan skakning för att underlätta koagelbildning.
- Centrifugera påsen vid 4900 x g under 15 min vid RT. Ta centrifug hink ur centrifugen och ta bort påsen försiktigt (följ tillverkarens anvisningar för beredning av blodplättslysatet) (Figur 1C).
- Isolera koagel precis ovanför klämman för att underlätta filtrering. Ansluter filtrerings kit för att överföringspåsen med hjälp av en spik placerad i utloppsporten hos filtrerings kit.
- Hänga påsen och öppna den blå klämman att låta serumet flödet genom tyngdkraften. Tryck inte till filtret för att undvika överföring av fibrin i påsen. Efter filtrering, täta slangen och ta bort påsen (följ tillverkrens riktlinjer för framställning av blodplättslysat).
- Anslut en dedikerad linje till slutpåsen och överförings serum i 50 ml rör i dragskåp bänk för att undvika mikrobiell kontamination.
- Ta ett prov med en spruta för att testa frånvaro av fibrinogen och utföra ett sterilitetstest för aeroba och anaeroba bakterieodlingar 17. Märk rören på lämpligt sätt och frysa dem vid - 20 ° C fram till användning.
4. Framställning av expansions Medium
- Bered 500 ml av total spridning medium. Till Dulbeccos Modified Eagle Medium - Låg glukos (DMEM-LG), tillsätt 10% autologt serum (erhållen såsom beskrivs i avsnitt 3), 2 mM glutamin, 1% antibiotikalösning och 1% antimykotisk lösning. Sterilfilter hela spridningsmediet.
5. Isolering av hMSCs från benmärgen
- Överför benmärgsprov (5-10 ml) från sprutan i en 50 ml konisk tuvara och späda ut det med steril koksaltlösning (förhållande 1: 4). Vortex 50 ml rör i 30 s för att dela upp cellkluster.
- Värma densitetsgradient (densitet 1,077 g / L; se tabell of Materials) till RT före användning och lager den utspädda benmärgen försiktigt (för att förhindra blandning båda skikten) på densitetsgradienten genom att tillsätta 20 ml av provet till 15 ml av densitet lutning för varje 50 ml rör (Figur 2A).
- Centrifugera vid 400 x g utan broms vid 25 ° C under 30 minuter, sedan samla mononukleära fraktionen vid vätske-vätske-gränssnitt och överföra den till en ny 50 ml tub med en steril 5 ml pipett.
- Tvätta den uppsamlade mononukleära fraktionen två gånger med komplett proliferation medium och centrifugera rören vid 400 xg under 10 min vid 25 ° C för att erhålla cellpellets.
- Kasta bort supernatanten och försiktigt återsuspendera varje cellpelleten i 5 ml komplett proliferation medium. Späd vid en 1: 100-förhållande för cellräkning.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer efter en 1: 1 utspädning med Trypan Blue-färgning för att utvärdera cellviabiliteten.
6. Kultur av hMSCs i närvaro av autologt serum
- Fylla två eller flera 75 cm 2 vävnadsodlings (TC) flaskor med 15 ml färskt fullständigt proliferation medium och överföra dem till en cellkultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 tills användning.
- utsäde 0,3 - 0,5 x 10 6 celler / cm 2 (37,5 x 10 6 celler / 15 ml av färskt fullständigt proliferation medium) och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 48 timmar.
- Samtidigt, utsädes 1 x 10 6 celler i en 25 cm 2 TC kolv med 5 ml färskt fullständigt proliferation medium för den kolonibildande enheten - Fibroblast (CFU-F) analys. Kultur för 2 veckor (för att fortsätta i avsnitt 12).
- Kasta medium och försiktigt tvätta flaskorna från steg 6,2 med fullständig spridning medium till remove ickeadherenta celler och rester. Lägg färskt medium till kolvarna och ersätta hälften av det två gånger i veckan, fram till 70-80% konfluens (primär kultur, Passage 0 (P0)) (Figur 2B).
- Återvinna cellerna med hjälp av en specifik rekombinant djur fri proteas (se tabell av material, använd 3 ml av lösningen per kolv som rekommenderas av tillverkaren) och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 10 minuter. Tillsätt 6 ml av total spridningsmedium per kolv och samla i en 50 ml tub. Upprepa steg 5,6.
OBS: VIKTIGT: Användningen av detta proteas i stället för trypsin medger återvinning av vissa mesodermala progenitorceller (MPC) som finns i kulturen, som är trypsin resistenta. - För ytterligare expansion, förnyad utbredning cellsuspensionen vid 2000 - 3000 celler / cm2 i ny 75 cm 2 TC kolvar (P1) (Figur 2C).
- Använd alikvoter av celler för att utvärdera differentierings potentialer MSCmot osteogen, adipogena och kondrogena linjer. Utför differentieringsanalyser enligt tillverkarens rekommendationer (figur 2D).
OBS: Olika färgningsmetoder kan användas för att bedöma multilineage differentiering.
7. Framställning av ett osteogent Medium med Pharmaceutical Kosttillskott
- Utspädd askorbinsyra (lösning 1A. Askorbinsyra 200 mg / ml (se tabell of Materials) 1:10 med DMEM-LG, för att erhålla en 20 mg / ml (lösning 1B, arbetslösning) Aktie portioner av lösningar 1A och 1B vid -20 ° C tills användning.
- Resuspendera 1 g hydrokortison i 10 ml sterilt vatten (lösning 2A: hydrokortison 100 mg / ml (se tabell of Materials) utspädd lösning 2A vid 1:. 1000 med DMEM-LG för att erhålla en 100 | j, g / ml lösning (lösning 2B, som arbetar lösning). Arkiv alikvoter av lösningar 2A och 2B vid -20 ° C fram till användning.
- Vid användning prepare färskt osteogen kultur på följande sätt: tillsätt DMEM-LG med 10% autologt serum, 50 | ig / ml askorbinsyra och 0,4 | ig / ml hydrokortison. Sterilfiltret osteogena mediet.
8. Osteogen Pre-induktion och återställning av hMSCs
- Helt ta bort spridning mediet och lägg osteogena medel 96 timmar före cellskörd (dvs 80 - är 90% sammanflödet vanligtvis nås på 7 d). Ge ytterligare osteogen mediumbyte 24 timmar före cell skörd.
- Lösgöra cellerna såsom beskrivs i steg 6,5 och försiktigt suspendera pelleten tillsätta 2 ml av komplett proliferation medium i ett 50 ml rör.
OBS: Cellviabiliteten kan minskas (ca 10%) som ett resultat av osteoinduktion. Cellulära aggregat kan observeras. - Efter räkning, tvätta cellerna med komplett proliferation medium och centrifugera vid 300 x g under 5 min. Suspendera pelleten försiktigt vid 1-2 x 10 6 livskraftiga celler / 2ml autolog plasma (se avsnitt 2) per 50 ml rör.
9. Framställning av hMSC / fibrinkoagel konstruktioner
- Tillsätt 150 pl av kalciumglukonat vid 100 mg / ml till varje 50 ml rör erhållen från steg 8,3. och återsuspendera cellerna under försiktig skakning.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 15 - 30 minuter för att erhålla hMSC / fibrinkoagel konstruktionerna (figur 3a). Förbereda ett fibrinkoagel konstrukt utan celler som skall användas som en kontroll.
OBS: VIKTIGT: Det rekommenderas att förbereda denna kontroll koagulera åtminstone 2 timmar före cellviabilitet analysen, eftersom det tar 30 minuter eller mer för att tvärbinda.
10. Cell Viability Assay
- Avlägsna vätskan från 50 ml rör och tillsätt 1 ml komplett spridningsmedium innehållande 10% v / v cellviabiliteten reagens (AB; se tabell of Materials), enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera the rören vid 37 ° C och 5% CO2 under 3 h. Mät absorbansen vid 570 nm med en referensvåglängd av 600 nm (AB vid tiden 0; t0).
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 2 ml av färskt komplett spridningsmedium. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 O / N. Nästa dag (AB vid tidpunkten 24 h, t24), upprepa steg från 10,1 till 10,3 (Figur 3B).
11. Histologisk Utvärdering av cellviabilitet och Calcium Nedfallet i fibrinkoagel konstruktioner
- Fäst hMSC / fibrinkoagel Konstruktionerna i 4% vikt / volym neutral buffrad formalin O / N vid 4 ° C. Tvätta 4x i D-PBS under 15 minuter och förvara i 70% etanol.
- Dehydratisera proverna vid 40 ° C i en serie av graderad etanol: 80% en gång under 30 min, 95% två gånger under 45 min och 3x 100% under 1 timme. Klargöra två gånger i xylen i 45 minuter vid 40 ° C.
- Skölj proverna i flytande paraffin vid 60 ° C under 2 h och bädda in dem. Skär paraffin block med en mikrotom och montera than sektioner (5 pm) på objektglas.
- Färga avparaffinerades sektionerna med hjälp av standard Hematoxylin och Eosin (H & E) metoden (figur 3C).
- Utföra von Kossa-färgning genom behandling av sektionerna med en% silvernitrat i 15 min, 0,5% Pyrogallol under 2 min, och 5% natriumtiosulfat under 2 min. Motfärg sektionerna med 0,1% kärn fast red utspädd i en lösning innehållande 5 g aluminiumsulfat under 5 minuter och skölj dem i kranvatten i 5 min. Montera sektionerna med en monteringsmedel.
- Utvärdera mineralavsättning som svarta granuler under ljusmikroskop (400X förstoring) (Figur 3D).
12. CFU-F Assay
- Tvätta 25 cm 2-kolv (från steg 6,3.) Med D-PBS. Färga genom att använda standard maj-Grunwald / Giemsa-metoden. Visuellt kvantifiera hMSC nummer genom att göra individuella kolonier (Figur 4) under ett ljusmikroskop.
OBS: Ombenmärgen tas som i steg 1,2. och sektionerna 2-9 utförs i Good Manufacturing Practice (GMP) med de nödvändiga myndighetstillstånd, kan hMSC / fibrinkoagel konstruktioner implanteras för ortopediska tillämpningar.
Representative Results
Framställning av autologt serum
Plasma koagulation, som utförs genom att tillsätta kalciumglukonat till överföringspåsen tillåter återvinning av autologt serum i stora mängder, som erfordras för hMSC kultur. I själva verket, är det med denna teknik möjligt att uppnå upp till 200 ml av serum (figur 1).
HMSC isolering, kultur och differentiering med hjälp av autologa serum
Benmärgsmononukleära celler isoleras med användning av en densitetsgradient, vilket ger upphov till en mellanring skikt (Figur 2A). Genom att stryka ut dessa celler och undanröja de ickeadherenta kära med tvättning, är det möjligt att isolera hMSCs (figur 2b). Under autologa odlingsbetingelser, är en delmängd av celler, som kallas partnerländerna, upptäcks på P0 och i procent upp to 10%, beroende på patientens variabilitet (Figur 2B). Medelhavsländerna är fortfarande närvarande efter omstryka (dvs P1) om proteaset används för cell passage (Figur 2C). hMSCs isoleras och odlas i en autolog miljö behålla sin förmåga att differentiera mot de tre välkända mesodermala linjer (osteogena, adipogena och kondrogena). Differentieringen utfördes för att jämföra hMSC befolkningen identitet med de som erhölls med användning av standard (nonautologous) odlingsbetingelser. Funktionalitet analyser för detta protokoll, von Kossa färgning, osmiumtetroxid färgning och Alcian blue-färgning vid pH 1 valdes i stället för dem som föreslagits av differentiering media tillverkare (se tabell Materials) (Figur 2D).
Beredning, livskraft och histologisk karakterisering av MSC / fibrinkoagel konstruktioner
(figur 3A). Inuti dessa plasmaproppar, de hMSCs är livskraftiga, vilket framgår av färgförändringen hos cellviabiliteten färgämnet t24 från blått (kontroll utan celler) till rosa (cellularized koagulera) (figur 3B). Cellviabiliteten i tromben bekräftas av H & E-färgning, visar en välbevarad cellmorfologin (Figur 3C). Dessutom en minimal osteoinduktion strax före andra cellskörden ger upphov till preliminära kalcium nedfall av stimulerade hMSCs (Figur 3D).
Kolonibildande enhet
Närvaron av hMSC kolonier efter 2 veckor i kultur visas av CFU-F-analys (Figur 4).
s = "jove_step" fo: keep-together.within-page = "1"> Tillämpning av MSC / fibrinkoagel konstruera i ben icke-union
HMSC / fibrinkoagel-konstruktioner som erhållits såsom beskrivits i denna metod (steg 1,1) till framgångsrikt tillämpats för behandling av svåra övre extremiteten nonunions i 8 compassionate fall 13. Långtidsbehandling (högst 7,6 månader) bedömning bekräftades framgångsrika kliniska och funktionella resultat för alla patienter, utan tecken på vävnads överväxt eller tumörbildning.
Figur 1. Beredning av autologt serum.
(A) Plasmaenheten överförs i en överföringspåse genom att använda spetsen; (B) Plasma koaguleras genom att injicera kalciumglukonat genom porten kontaktdonet; (C) En blodpåse centrifug används för att separera serum./files/ftp_upload/54845/54845fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. hMSC Isolering, kultur och differentiering med hjälp av autologt serum.
(A) Det mononukleära cellskiktet (i det blå linje fönster) som erhölls efter benmärgscentrifugering med en densitetsgradient; (B) cellkultur som det verkar på P1; (C) cellkultur som det verkar på P0 (primär kultur); (B - C) Pilarna visar närvaro av Medelhavsländerna i MSC kultur. Skala bar är 100 pm; (D) Histokemiska resultaten av multilineage differentieringsanalyser. Osteogen differentiering bedöms med hjälp av von Kossa färgning för mineralmatrixdeposition i svart, adipogena differentiering framgår av förekomsten av fett vakuoler, färgas svart med osmium tetroxide, och kondrogen differentiering visas genom närvaron av sulfate glykosaminoglykaner, som färgats i cyan av Alcian blue-färgning vid pH 1. Skala bar är 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Beredning, livskraft och Histologisk karakterisering av MSC / fibrinkoagel konstruktioner.
(A) hMSC / fibrinkoagel konstruera som det visas efter tvärbindning; (B) Resultat av AB-analys: MSC är livskraftiga i fibrinkoagel, vilket framgår av den färgförändring av cellviabiliteten färgämne (T24), från blått (kontroll utan celler, till höger) till rosa (cellularized koagel, på vänster). (C - D) Histokemiska resultaten av hMSC / fibrinkoagel-konstruktioner. Skala bar är50 | j, m. (C) Hematoxylin och Eosin-färgning som visar viabla celler inbäddade i fibrinmatrisen; (D) Mineral matrixdeposition färgas svart med von Kossa färgning, vilket bekräftar en initial osteogenes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. CFU-F-analys.
Bild av en kolv odlades med hMSCs färgade av May-Grunwald / Giemsa-metoden. Den zoomas in området är en ljusmikroskop visar morfologin hos en hMSC koloni. Skala bar är 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Tillämpning av hMSC / fibrinkoagel Konstruera i Bone Nonunion.
(A) X-ray i den övre delen av en patient som lider av pseudartros; (B) hMSC / fibrinkoagel konstruktion strax före implantation; (C) Kirurgisk tillämpning av hMSC / fibrinkoagel konstruktion; (D) X-ray av den övre delen av samma patient efter 5 år. Denna siffra publiceras från Giannotti S. et al. med minimala modifieringar 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De kritiska stegen i detta protokoll avser användning av vuxen människa serum och proteas, som gör det möjligt att erhålla en BioSafe hMSC terapi. I synnerhet möjliggör vuxen människa serum isolering och underhåll, medan proteas säkerställer skörden av Medelhavsländerna. Dessa är omogna celler som finns i benmärgen som kan ge upphov till färska hMSCs, vilket säkerställer en reservoar av viabla hMSCs längs odlingstiden. Inte alla MPCs kan samlas in, eftersom en ökning av exponeringstiden till proteasaktiviteten är till förfång för hMSC viabilitet. Av denna anledning var en 10 min proteas inkubation vald som optimal kompromiss mellan återvinning av Medelhavsländerna och livskraft hMSCs. En annan avgörande steg är osteodifferentiation tid. Faktum är att ett omfattande in vitro osteodifferentiation skulle avsevärt minska cellviabiliteten, vilket påverkar den slutliga benbildning in vivo. Den sista kritiska steget består i utnyttjar autolog bioresorberbar byggnadsställning, which erhålls genom att bädda in cellerna (hMSCs och partnerländerna) i en fibrin gel från plasma koagulering.
Ett viktigt steg för att öka utbytet av Medelhavsländerna är att ympa mononukleära celler vid högre koncentration. Genom att använda aferes för att erhålla plasma och behandla den med kalciumglukonat gör det möjligt att uppnå autologt serum i stora mängder. Det har observerats att humant serum som en mediumsupplement är jämförbar med fetalt bovint serum (FBS) i hMSC kulturer. Men i vår erfarenhet, en komplett medium kompletterat med FBS bidrar till snabbare åldrande än vuxen människa serum. Ett viktigt steg är att administrera en minimal osteoinduktion till hMSCs. I själva verket leder denna behandling cellerna att enkelt skilja mot den osteogena linjen, vilket är användbart för att undvika ytterligare celltransformation in vivo. För att upprätthålla en god lönsamhet för minimalt osteoinduced hMSCs, rekommenderas att följa noga rekommendationerna som beskrivs i steg 6,5. end 8,2., inklusive hantering, centrifugering och medel belopp som skall läggas till. Om ett förfarande aferes inte är tillgänglig, är det fortfarande möjligt att genomföra detta protokoll genom att utföra flera bloddragningar till patienten eller, i andra hand, genom att köpa poolade AB sera. Självklart, för att få detta protokoll från bänken till säng, är det obligatoriskt att ha GMP cellfabriker, eller motsvarande, tillgängliga.
Begränsningar för tillämpningen av denna teknik avser anemiska, hematologiska-onkologi och ortopediska patienter som drabbats av osteomyelit., Teckning stora mängder blod från anemiska patienter, bör undvikas. I onkologiska patienter, är kvaliteten på cellprover påverkas av cellgiftsbehandling, medan osteomyelit patienter infektion kan påverka slutresultatet. I samtliga fall där den autologa serum är otillräcklig eller olämpligt, poolade manliga AB sera utgör ett bra alternativ.
Använda cell / fibrin CLOt konstruktioner för eventuella kliniska tillämpningar är avgörande för att släppa en helt autologa cellterapi, som kan vara lätt att hantera och mögel under operation, vilket resulterar i utmärkta resultat för att behandla skelett icke-förbund 13. För kliniska ändamål är hMSCs vanligen administreras via två huvudförfaranden: minimal manipulation och omfattande manipulation 9. För att övervinna problemen i samband med en omfattande ex vivo kultur, såsom avvikelser i cellmorfologi och storlek 18, utförde vi en kort tid ex vivo cellexpansion och osteo-differentiering (endast 4 d).
Xeno fria protokoll som beskrivs i detta dokument, tillsammans med de korta expansions- och osteodifferentiation cell gånger, visat sig vara relevant i kliniker för att erhålla snabb produktion ben in vivo, utan några tecken på vävnads överväxt och transformation, vilket bekräftar dess effektivitet och lång -term säkerhet i benreparation (Figur 5) 13.
Den metod som presenteras i denna rapport syftar till att visa effekt och säkerhet av hMSC in vitro expansion i autologa villkor för eventuell användning i ortopedisk kirurgi. Detta protokoll använder hMSCs isolerade från benmärg och odlas i ett medium kompletterat med autologt serum och bäddas in i autologa fibrinkoagel, vilket säkerställer en helt autolog cellterapi. Den två-faldig osteogen induktion, strax innan det andra lösgörande, förbättrar hMSC förmågan att differentiera till osteoblaster. Som ett resultat, är särskilt lämplig för applikationer i bendefekter denna teknik, eftersom det inte är begränsat till pseudartros. Möjliga framtida tillämpningar kan innebära talus cysta och benförlust hantering.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
| Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| DMEM-LG, no glutamine, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
| Glutamax (100x) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
| Penicillin/Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
| Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
| D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
| StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
| StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
| hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
| Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
| Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
| Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
| Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
| Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
| Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
| Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
| Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
| Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
| Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
| Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
| DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
| Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
| Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
| Microtome | Leika | histological assay | |
| May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
| Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
| Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
| Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
| Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
| Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
| Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
| Steryle Luer-Lok Syringe 50 mL | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
| Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
| SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |
References
- Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7, 393-395 (2005).
- Kassem, M., Abdallah, B. M. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential role in therapy of degenerative diseases. Cell Tissue Res. 331, 157-163 (2008).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Bonfield, T. L., Nolan Koloze, M. T., Lennon, D. P., Caplan, A. I. Defining human mesenchymal stem cells efficacy in vivo. J Inflamm. (Lond). 25 (7), 51 (2010).
- Pneumaticos, S. G., Triantafyllopoulos, G. K., Chatziioannou, S., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. Biomolecular strategies of bone augmentation in spinal surgery. Trends Mol. Med. 17 (4), 215-222 (2011).
- Amhed, T. A. E., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: A versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Engineering Part B. 14 (2), 199-215 (2008).
- Silbertein, L. E., Williams, L. J., Huglett, M. A., Magee, D. A., Weisman, R. A. An autologous fibrinogen-based adhesive for use in oncologic surgery. Transfusion. 28 (4), 319-321 (1988).
- Jockenhoevel, S., et al. Fibrin gel advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering. Eur. J. Cardiothorac Surg. 19 (4), 424-430 (2001).
- Veronesi, F., et al. Clinical use of bone marrow, bone marrow concentrate, and expanded bone marrow mesenchymal stem cells in cartilage disease. Stem Cells Dev. 22 (2), 181-192 (2013).
- Petrini, M., et al. Identification and purification of mesodermal progenitor cells from human adult bone marrow. Stem Cells Dev. 18 (6), 857-866 (2009).
- Trombi, L., et al. Selective culture of mesodermal progenitor cells. Stem Cells Dev. 18 (8), 1227-1234 (2009).
- Trombi, L., et al. Human autologous plasma-derived clot as a biological scaffold for mesenchymal stem cells in treatment of orthopedic healing. J. Orthop. Res. 26 (2), 176-183 (2008).
- Giannotti, S., et al. Use of autologous human mesenchymal stromal cell/fibrin clot constructs in upper limb non-unions: long term assessment. PlosOne. 8 (8), 73893 (2013).
- Castano-Izquierdo, H., et al. Pre-culture period of mesenchymal stem cells in osteogenic media influences their in vivo bone forming potential. J. Biomed. Mater. Res. A. 82 (1), 129-138 (2007).
- Malkani, A. L., Fitzgerald, R. H., Kaufer, H. Orthopaedics. , Mosby. St. Louis, MO. Chapters 86-87 (2002).
- Lee, S. H., et al. ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. Int J Lab Hematol. 30 (5), 349-364 (2008).
- Bugno, A., et al. Application of the BacT/ALERTR 3D system for sterility testingof injectable products. Braz J Microbiol. 46 (3), 743-747 (2015).
- Bonab, M. M., et al. Aging of mesenchymal stem cells in vitro. BMC Cell Biology. 7, 14 (2006).
