Summary
유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.
Introduction
북미의 여성은 유방암이 개발의 ~ 12 %의 평생 위험이; 이 환자의 대다수는 수술을 통해 제거 된 원발 종양을 가지게되며, 암 부속 유형에 따라 보조제 세팅 3 에서 표적, 내분비, 화학 요법 및 / 또는 방사선 치료를 받게됩니다. 예를 들어, 항 - 에스트로겐 요법을받는 호르몬 수용체 양성 암 및 방사선 / 화학 요법으로 HER2 타겟 요법을받는 HER2 양성 종양이있는 여성으로 진단 된 여성은 삼중 음성 종양 3에 대한 표적 치료법이 아직 없습니다. 치료는 원격 장기에 전이 된 질병 퇴치에 크게 효과가 같은 수술 적 절제를 보완 방사선, 화학 요법, 개인 및 호르몬 기반 치료의 발전에도 불구하고, 질병을 포함, 단계 II 또는 III 질환 4 진단을 여성의 30~70%에 재발 폐, 뼈, b비 및 / 또는 간 5 . 이는 원발성 종양 재성장이없는 상태에서 전이성 질환이 발생했을 때 확진 된 수술 당시 파종 된 악성 세포가 이차 기관에 이미 존재했을 가능성이 높다는 것을 감안할 때 특히 중요합니다. 따라서 전이성 종양을 박멸하거나 성장을 지연시킬 수있는 치료법이 시급히 필요합니다.
유방 발암의 드 노보 마우스 모델, 종양 진행 한 조절 메커니즘을 드러내는 현저 정보되었지만 기존 모델은 몇 가지 제한이있다. 이들 중 하나는 de novo 형질 전환 모델이 일반적으로 원발성 종양 부담이 연구 기간을 제한하는 다중 유방 땀 샘에서 원발 종양을 발병한다는 사실입니다. 일차 종양 세포 탈출과 전이성 파종이이 모델에서 종양 진행의 초기에 일어날 가능성이 있지만, 전이성 종양의 솔직한 발달은 늦게 발생하며,n 마우스 모델 및 변형 배경은 종종 부분적으로 침투합니다 1 . 이것은 이차 장기에서의 전이를 조절하는 분자 발견을위한 de novo 모델의 유용성을 제한하고, 보조제 환경에서 치료제의 전임상 효능을 평가하기위한 것이다.
이러한 한계를 피하기 위해 우리는 폐에 유방암 종양 전이의 자동 신생 모델을 개발했습니다. 부모의 형질 전환 여성 (즉, MMTV-PyMT은 여기에 기술 연구에 대한 FVB / N 변형 배경에) 말기 베어링 드 노보 유방암이되는 자신의 차 종양은 외과 적 절제 및 효소로 분해되어 가리 ~ 백일 6 세되는 단일 세포 현탁액. 일시 정지 (1 x 10 6 세포)는 차례로 동종 이형 유방 종양이 38-60 일의 기간 동안 발병하는 6-7 주령의 수혜자 동족 암컷 생쥐 ( 3 )에서 수혜자 마우스를 마취시키고 원발 종양을 수술 부위에서 종양 재성장이 최소화되도록 외과 적으로 절제하여 여성의 수술과 일치시킵니다 ( 보충 그림 1 ). FVB / n 균주 배경에서 마우스는 수술 후 ~ 115 일까지 45 %의 침투율을 보이는 폐에서 조직 학적으로 검출 가능한 전이 초점을 발달시킵니다 ( 그림 1B ). 이 전이성 종양 성장 지연으로이 모델은 보조 요법 전달, 원발성 종양의 외과 적 제거 후 전이성 진행에 영향을 미치는 기초 생물학을 밝히고 평가하기위한 고유 한 위치에 있습니다.
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Protocol
다음 프로토콜에 사용 된 동물은 동물 복지 법 규정 및 보건 서비스 (PHS) 정책을 준수하도록 고안된 오리건 건강 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 적용을받습니다.
멸균 조건의 유지 관리 : 멸균 된 도구를 마우스 사이에서 사용해야하며 멸균 거즈로 깨끗이 닦고 PBS로 헹구어 낸 다음 소독제 70 % 에탄올로 최소 15 분 동안 멸균해야합니다. 생존 수술을 위해서는 수술 용 모자, 안면 마스크, 가운 및 장갑을 착용해야합니다. 생존 수술을위한 동물의 수술 전 준비는 다음 프로토콜에 포함되어 있습니다. 시약 및 장비 목록은 표 1을 참조하십시오.
원발성 유방 종양으로부터 단일 세포 현탁액의 분리 및 제조
- Donative female 100 일 된 트랜스 제닉 MMTV-PyMT (FVB / n) 마우스를 마취시키고 c마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정 작용. 발 핀치 반사가 없으면 마우스가 올바르게 마취되었는지 확인하십시오.
- 멸균 설정에서 멸균 가위를 사용하여 피부와 주변 지방 조직 및 / 또는 림프절에서 유방 종양을 분리하여 100 일 된 트랜스 제닉 암 MMTV-PyMT (FVB / n) 생쥐의 원발성 유방 종양을 절제하십시오. 자궁 경관 탈구로 마취 쥐를 안락사.
- 멸균 가위 또는 메스를 사용하여 원발 종양을 수작업으로 작은 조각 (~ 1.0 mm 3 )으로 채 웁니다. 종양 조각을 3.0 mg / mL collagenase A 및 4.0 U / mL DNase I에 DMEM에 용해시킨다. 직경 1.0 cm의 종양 당 ~ 10 mL의 위의 소화 배지를 사용하십시오.
- ~ 125 RPM 및 37 ° C에서 40 분 동안 멸균 교반 막대를 사용하여 멸균 25 mL 병에서 소화를 수행하십시오.
- 태아 소 혈청 (FBS)을 최종 희석액 10 %에 첨가하여 소화를 중지하고 전체 혼합물을 w얼음이 유지됩니다.
- 0.7 ML 나일론 여과기를 통해 소화 종양 현탁액을 50 ML 원뿔 튜브로 필터링하고 여과기에 남아있는 종양을 폐기하십시오. 4 ℃에서 300xg로 뜨는 원심 분리기.
- 1.0 cm 종양 당 10 ML DMEM에 펠렛을 Resuspend하고 0.7 μm의 나일론 여과기를 통해 다시 필터링. 셀 농도를 세고 4 x 300xg로 원심 분리한다.
- 2 × 10 7 살아있는 세포 / ML의 농도 90 % FBS와 10 % dimethyl sulfoxide에 Resuspend 펠렛. -80 ° C에서 전체 원발 종양의 단일 세포 현탁액을 저장하십시오.
2. 유방 종양의 정위 주사
- 냉동 펠렛이 극저온 튜브에서 20 mL DMEM으로 방출되어 세포 수를 계산할 때까지 37 ° C에서 1 차 종양 현탁액을 부분적으로 해동합니다. 4 X 300 XG에서 원심 분리기와 1 : 1 DMEM에 resuspend 세포 : 성장 요소 - 감소 solubilized 지하 막 준비 전자1 × 107 세포의 농도 Engelbreth-Holm이 - 스웜 (EHS) 마우스 육종에서 xtracted / ㎖는 (재료의 도표 참조).
- 마취 된 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 마취 된 여성 동종 마우스의 복부 측면을 위로 놓고 계속 진정 작용을 유지하십시오.
- 에어로졸 70 % 에탄올을 사용하여 오른쪽 제 4 유선 선 주사 부위를 살균하고 무균 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) - 요오드를 적용합니다.
- 29 G 0.3 ML 인슐린 주사기를 사용하여 6 ~ 10 주 된 여성 FVB / n 마우스의 깨끗한 오른쪽 4 번째 유선에 100 μL (냉동 원발 종양 현탁액에서 1 x 10 6 살아있는 세포) 베벨 사이드를 주사.
3. 정위 유방 종양의 외과 적 절제술
- 종양 세포 주입 다음 38-60일는 쥐 부피 3mm 450-172 사이 [길이 x 징 동소 종양 부피를 나타내지 않는 안락사 (폭 2
- 마취 마스크를 통해 2 % isoflurane을 투여하여 지속적인 진정하에 적절한 종양 크기 복부 측면을 표시 마취 마우스를 배치하고 마우스가 결석 발 핀치 반사와 함께 적절하게 마취되었는지 확인합니다. 진정 작용이있는 동안 건조 방지를 위해 수의사에게 눈물을 채우십시오.
- 원발 종양을 둘러싼 수술 부위를 멸균하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이 한 다음 멸균 된 면봉으로 폴리 (비닐 피 롤리 돈) -Iodine을 바르십시오.
참고 : 외과 수술 부위의 제모는 ~ 5 % 마우스의 피부 탈출 및 / 또는 감염을 유발 했으므로이 단계에서 제외되었습니다 (데이터는 표시되지 않음). - 그림 1C에 나타난 것처럼, 종양의 중앙 - 꼬리 부분에 무딘 가위를 사용하여 초기 피부 절개를하십시오.
- 다음으로, 종양의 중간에있는 피부 ( 그림 1C )의 우수한 절제를하십시오. 모든 혈관계를 소작 할 필요성에주의하십시오.절개를 연장하기 전에 피부에있는 종양을 eding.
- 옆으로 (종양의 후방) 피부 절개를 계속 한 다음 탁월한 피부 절제 (종양 측면)와 내과 적 절제 (종양보다 우수) ( 그림 1C )를하십시오.
- 피부가 종양 주위로 절제 된 후 ( 그림 1C ) 종양을 복부 벽 근육에서 멀리 해부하고 유선을 손상시키지 않으면 서 겸자를 사용하여 종양에 붙어있는 피부를 들어 올립니다.
- 4 번째 와 5 번째 유방 땀샘을 관통하는 대형 혈관을 (무딘 절개로) 확인하고 소작하십시오.
- 소작 부위에서 4 번째 및 5 번째 유방 땀샘의 약 절반을 잘라내어 종양, 피부, 그리고 유선의 일부분을 제거합니다 ( 그림 1C ).
- 출혈이있을 경우, 출혈을 적극적으로 식별하십시오.즉시 그들을 소작하십시오. 혈액 250 μL 이상이 손실되면 마우스를 연구에서 제외하고 안락사시킵니다.
- 상처 클립 applier ( 그림 1C )를 사용하여 상처 클립과 excision 사이트를 닫습니다.
참고 : 상처 클립 제거제로 수술 10 일 후 상처 클립을 제거하십시오. - 피하 (동물의 체중의 4 %) 따뜻한 멸균 식염수를 관리하고 열 램프로 동물을 따뜻하게 유지. 마취에서 회복되는 동안 매 5 ~ 10 분마다 동물을 확인하십시오.
주 : bupivacaine 또는 lidocaine 투여는 수술 후 사망률을 증가시켰다 (데이터는 나타내지 않음). 수술 후 1 시간 동안 통증의 징후를 보인 마우스 (사냥감, 움직이지 않으려 고 함, 손질에 실패 함)를 안락사시켰다.- 마우스가 완전히 회복되면 다른 마우스 회사에 반환하십시오.
4. 유동 세포 계측법 및 조직학을위한 혈액 및 폐의 분리 및 처리
<ol>참고 : 용해 된 bromodeoxyuridine의 냉동 보관은 준비 후 1 개월 이내에 사용됩니다.
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Representative Results
그레이터 MMTV-PyMT 마우스 유래의 기본 유방암에서 1 × 106 세포를 수신받는 마우스의 75 % 이상, 172에서 450mm 3 38-60 일 이내의 크기에 이르는 단일 유방 선암 개발 (데이터는 보이지 않음). 무작위 추출에 적합한 마우스는 그림 과 같이 원발 종양의 외과 적 절제 후 연구 그룹에 등록됩니다 ( 그림 1C ). 원발 종양의 외과 적 절제술을받은 생쥐의 2 % 미만에서만 원발성 종양 재성장이 확인되었다 ( 보충 그림 1 ). 이 프로토콜에 의해 평가받는 쥐의 45 %는 종양 절제 후 115 일까지 조직 학적으로 검출 가능한 전이성 초점을 개발했다 ( 그림 1B ). H & E 염색에 의한 전이 세포 포함 구역에서 전이 조직을 확인하기 위해 인접한 조직 절편을 PyMT PCR로 평가 하였다표시).
그림 1 : 원발 종양의 수술 후 절제와 새로운 폐 전이 발달 ( A ) 마우스 mammary adenocarcinoma 전이 모델의 실험 스키마. †은 안락사 당일에 모든 마우스에게 심장 관류가 이루어지고 BrdU가 주입 된 것을 의미합니다. ( B ) 대표적인 H & E로 전엽의 분리가 분열 된 FFPE 폐 조직의 연속 절편에 의해 전이성 병소의 검출이 평가되었다. 전이성 초점 (> 5 세포)은 조직의 1,300 μm를 반영하는 매 100 μm의 H & E 얼룩에 의해 결정되었다. 11 마리 생쥐의 폐를 분석했습니다. 원발성 유방 종양의 외과 적 절제술의 스키마 ( C ). 빨간색 숫자와 화살표는 피부 절개의 순서와 방향을 나타냅니다.원발 종양 경계 (왼쪽). 주요 혈관이있는 오른쪽 4 번째 및 5 번째 유선은 원발 종양 (중간)에 붙어 있으며 상처 클립 (오른쪽)으로 상처 봉합이 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 폐의 격리, 재관류 및 고정. 그림 (왼쪽)과 해당 만화 (오른쪽)는 폐 격리, 관류 및 고정이 표시됩니다. ( A ) 정중선 절개는 오른쪽 4 번째 및 5 번째 유방 땀샘 (화살표)을 드러내는 수축 된 피부를 표시하는 삽입 된 이미지로 표시됩니다. ( B ) 복벽이 횡격막에 열리는 것으로 보여진다. ( C ) 철회 후f 장, 복부 대동맥 (화살촉)이 확인되고 열려 있습니다. ( D ) 흉곽의 횡경막과 측면이 절단되어 흉강을 노출시킨다. ( E ) 폐가 완전히 우울해질 때까지 심장의 우심실을 통해 폐가 관류된다 ( F ). ( G ) 노출 된 기관을 확인한 다음 폐가 확장 될 때까지 기관에 포르말린 ( H )을 주입합니다 ( I ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 수술 부위의 일차 종양 재성장. 우측 4 번째 와 5 번째 유선의 수술 후 H & E (위)와 총 (아래) 이미지의 대표적인 이미지로 tu가 없음을 보여줍니다.림프절 ( AB ) 및 원발 종양 재성장 ( CE )이있는 유선. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
수정 및 문제 해결 :
복부 벽에서 종양을 절제 할 때 종양이 복부 벽에 부착 된 채로 남아있을 수 있습니다. 이것은 종양이 주입 된 마우스의 5 % 미만에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 복벽에 부착 된 종양이있는 마우스의 경우 원발 종양 재성장 없이는 절제가 어렵 기 때문에 마우스를 안락사해야합니다.
모델 / 기술의 한계 :
다른 연구자들은 폐를 제외하고 MMTV-PyMT 마우스 7 에서 유래 한 유방 말단 봉우리를 재 주입 한 후 폐뿐만 아니라 간, 신장, 비장 및 뇌에 확산 된 형광 표지 단일 전이 세포의 존재를보고했지만, 간에서 전이 병소가있는 마우스. 이의 침투는 아직 결정되지 않았다. 림프절과 같은 잠재적 인 전이성 부하의 다른 부위비장, 뼈 및 뇌는 평가되지 않았습니다. 이 기술의 한계는 또한 수술 부위를 면도 할 때 수술 후 excoriations과 피부의 감염을 포함했습니다. 이 때문에 외과 수술 부위의 무균 성은 폴리 (비닐 피 롤리 돈) - 요오드가 뒤 따르는 70 % 에탄올의 도포로 제한되었습니다.
프로토콜 내 중요 단계 :
복벽으로부터 종양을 무딘 절개하는 것은 유방 내에서 혈관을 피하는 중요한 단계입니다 (단계 3.7). 3.8 및 3.9 단계는 통제되지 않은 출혈의 위험이 가장 큰 중요한 단계입니다. 혈관의 근위부와 근위부는 출혈의 원인을 쉽게 시각화 할 수 있도록 소작동 후 확인되어야합니다.
기존 방법에 대한 중요성 :
질병의 단계를 모방 한 인간 암의 마우스 모델진행, 동역학 및 조직 병리학은 치료를위한 새로운 표적뿐만 아니라 그 분자 / 경로를 표적으로하는 새로운 치료제의 잠재적 효능을 확인하고 평가할 수있는 귀중한 도구를 제공합니다. 확립 된 암 세포주의 꼬리 정맥 및 / 또는 심장 주사는 종종 전이의 실험 모델로 사용되지만, 전이 과정에서 중요한 단계를 반복하지 못하고 대신 종양 세포 생존의 측면을 평가할 수있는 이소성 장기 집락 분석을 반영합니다 8 . 더욱이, 새로운 유방암 발달의 기존 트랜스 제닉 마우스 모델은 전이와 관련된 단계를 연구 할 수있는 모델 시스템을 제공하지만 상당한 일차적 인 종양 부담은 일반적으로 연구 기간을 제한합니다. 따라서 그룹은 MMTV-PyMT 원발 종양에서 파생 된 신생 종양 세포를 주입하여 수술 절제술 9 을 허용합니다. 우리의 방법은 이러한 기술을 does 는 생체 외에서 종양 으로 성장한 종양 세포주를 선택하지 않고 수혜 쥐에게 완전하고 이질적인 원발 종양을 직접 도입합니다. 또한 우리 모델에서 폐전이 형성의 긴 대기 시간은 다양한 치료 연구를위한 더 나은 치료 창을 허용합니다.
향후 응용 프로그램 :
이 모델에서 치료제의 효능을 평가하는 것과 관련하여 원발성 종양은 일반적으로 모든 유선에서 발생하기 때문에 모든 원발 종양의 외과 적 절제와 전이성 콜로니의 성장을 최소화하기위한 보조제 평가는 불가능합니다. 이러한 문제로 인해 우리는 종양 세포의 전이성 보급이 새롭게 발생하고 원발 종양의 외과 적 절제술 후 폐의 전이를 확인할 수있는 확장 된 대기 시간이 설정되는 전이성 보급 모델을 개발했습니다. 따라서,이 모델인간의 유방암 전이를 반영하고 IACUC 가이드 라인에 따라 정의 된 종점으로 무병 생존 및 / 또는 전체 생존을 조절하는 데 미치는 영향에 대한 보조 전달 요법의 효능을 평가할 수있는 독특한 시스템을 제공합니다.
유방암 여성의 큰 비율을 차 종양 (10), 이후 원위부 전이를 개발 진척 것들의 수술 적 절제에 의해 처리되기 때문에,이 보급 및 시드 전에 수술 적 절제에 일어난 것을 의미한다. 원위부 기관의 미세 환경은 전이 세포의 생존 및 / 또는 증식을위한 고유 한 틈새를 제공합니다 11 . 따라서, 모델 시스템이 일차 종양과는 별개의 이차 부위에서 작용하는 분자 및 경로가 확인되고 연구되고, 이들을 표적으로하는 치료법이 효능에 대해 정확하게 평가되도록 이러한 측면을 모방하는 것이 필수적이다. 여기에서 개발 된 모델은 연구를위한 이러한 측면을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 여기에 제시된 데이터와의 충돌에 대해 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
저자들은 조직 병리학 지원을 담당 한 Jo Hill, 수술 기술 교육을 담당 한 John Gleysteen 박사, 비디오 촬영 지원을 담당 한 Tessa Diebel, 중요한 통찰력과 토론을위한 Wong and Coussens 연구소의 모든 구성원 및 재정 지원을위한 OHSU 기사 암 연구소에 감사드립니다. 저자는 T32GM071388-10 및 T32CA106195-11에서 CEG, NCI / NIH, 국방부 유방암 연구 프로그램, 수잔 G 코멘 재단, 유방암 연구 재단 및 스탠드 업 암 - 루스 가르겐 재단에 대한 지원을 인정합니다. 췌장암 수렴 팀 드림 팀 번역 연구 보조금 (SU2C-AACR-DT14-14)을 LMC, 여성 건강 단체 인 MHW에게, 그리고 Brenden-Colson 췌장 건강 센터를 MHW 및 LMC에 제공했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer (Version 3.2014). , Accessed November 25. http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
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