Summary
Präklinische Modelle, die eine adjuvante Therapie mit Brustkrebs-Metastase auswerten, fehlen. Um dies zu lösen, entwickelten wir ein murines Modell der de novo pulmonalen Mamma-Adenokarzinom-Metastase, wobei Therapien, die in der adjuvanten Einstellung (postchirurgische Resektion von Primärtumoren) verabreicht werden, auf die Wirksamkeit bei der Auswirkung von zuvor gesäten pulmonalen Metastasen untersucht werden können.
Introduction
Frauen in Nordamerika haben ein ~ 12% lebenslanges Risiko der Entwicklung von Brustkrebs 2 ; Eine Mehrheit dieser Personen wird primäre Tumore über die Operation entfernt haben, und je nach Krebs Subtyp, wird dann erhalten gezielte, endokrine, Chemo- und / oder Strahlentherapie in der adjuvanten Einstellung 3 . Beispiele umfassen, mit Hormonrezeptor-positiven Tumoren diagnostizierten Frauen HER2-zielgerichteten Therapien mit Bestrahlung / Chemotherapie, während keine zielgerichteten Therapien noch verfügbar sind für triple negative Tumoren 3 Empfangen anti-Östrogen - Therapien und Frauen mit HER2-positiven Tumoren erhalten. Trotz Fortschritten in der Strahlung, Chemotherapie, personalisierte und Hormon-basierte Therapien, die chirurgische Resektion ergänzen, wiederholt sich die Krankheit bei 30-70% der Frauen, die mit der Stufe II oder III-Krankheit 4 diagnostiziert wurden, da Therapien bei der Beseitigung der metastatischen Erkrankung in entfernten Organen weitgehend unwirksam sind Lunge, Knochen, bRegen und / oder Leber 5 . Dies ist besonders bedeutsam, da bei der Metastasierung in Abwesenheit eines primären Tumorwachstums dies impliziert, dass disseminierte maligne Zellen wahrscheinlich bereits in sekundären Organen zum Zeitpunkt der endgültigen Operation vorhanden waren. So sind dringend Therapien erforderlich, um das Wachstum von metastatischen Tumoren zu beseitigen oder zu verlangsamen.
Während de novo Mausmodelle der Brustkarzinogenese bemerkenswert informativ bei der Aufdeckung von Mechanismen zur Regulierung der neoplastischen Progression 1 sind , haben bestehende Modelle auch mehrere Einschränkungen. Eines davon ist die Tatsache, dass de novo transgene Modelle typischerweise Primärtumore in multiplen Brustdrüsen entwickeln, wobei die primäre Tumorbelastung die Dauer der Studien begrenzt. Während primäre Tumorzell-Flucht und metastatische Seeding wahrscheinlich früh in der neoplastischen Progression in diesen Modellen auftreten, entsteht eine offene Entwicklung von metastatischen Tumoren spät, und je nach oN der Maus Modell und Belastung Hintergrund, ist oft teilweise durchdringend 1 . Dies begrenzt den Nutzen der de novo- Modelle zur Entdeckung von Molekülen, die die Metastasierung in sekundären Organen regulieren, und zur Bewertung der präklinischen Wirksamkeit von Therapeutika in der adjuvanten Umgebung.
Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelten wir ein de novo autochthones Modell der Mamma-Karzinom-Metastase in die Lunge. Parentale transgene Weibchen ( dh MMTV-PyMT auf dem FVB / n-Stammhintergrund für hierin beschriebene Studien), die Spätstadium de novo Mamma-Tumoren tragen, sind bis zu 100 Tage 6 gealtert, wobei zu diesem Zeitpunkt ihre primären Tumoren chirurgisch reseziert und enzymatisch dissoziiert werden Einzelzelle Suspensionen. Suspensionen (1 x 10 6 Zellen) werden wiederum orthotopisch in 6-7-wöchige Empfänger-syngene weibliche Mäuse explantiert, wo sich einzelne primäre Mamma-Tumoren über einen Zeitraum von 38 bis 60 Tagen entwickeln ( 3 ) werden Empfängermäuse anästhesiert und Primärtumoren werden chirurgisch reseziert, so dass das Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle minimiert wird, im Einklang mit der Operation bei Frauen ( Ergänzende Abbildung 1 ). Auf dem FVB / n-Stamm-Hintergrund entwickeln Mäuse histologisch nachweisbare metastatische Herde in der Lunge mit 45% Penetrance um ~ 115 Tage nach der Operation ( Abbildung 1B ). Mit dieser verlängerten Latenz des metastatischen Tumorwachstums ist das Modell eindeutig für die adjuvante Therapieabgabe positioniert und zur Aufklärung und Bewertung der zugrunde liegenden Biologie, die die metastatische Progression nach chirurgischer Entfernung von Primärtumoren beeinflusst.
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Protocol
Tiere, die in dem folgenden Protokoll verwendet werden, werden vom Oregon Health & Science University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) abgedeckt, das so konzipiert ist, dass es mit dem Tierschutzgesetz und dem Public Health Service (PHS) -Politik übereinstimmt.
Aufrechterhaltung der sterilen Bedingungen: Sterilisierte Instrumente sollten verwendet werden und zwischen Mäusen, sollte mit steriler Gaze abgewischt werden, in PBS gespült, gefolgt von Sterilisation mit Desinfektionsmittel 70% Ethanol für mindestens 15 Minuten. Eine chirurgische Kappe, Gesichtsmaske, Kleid und Handschuhe sollten für Überlebensoperationen getragen werden. Die präoperative Vorbereitung des Tieres für Überlebensoperationen ist in dem folgenden Protokoll enthalten. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Reagenzien und Geräten.
1. Isolierung und Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus primären Mamma-Tumoren
- Anästhesieren Sie Spender weibliche 100 Tage alte transgene MMTV-PyMT (FVB / n) Mäuse und pflegen unter cKontinuierliche Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske. Vergewissern Sie sich, dass die Maus mit einem abwesenden Fußrastenreflex richtig betäubt wird.
- In einer sterilen Umgebung resezieren primäre Mamma-Tumoren von 100-Tage alten transgenen weiblichen MMTV-PyMT (FVB / n) Mäusen durch Trennen des Brusttumors von der darüber liegenden Haut und dem umgebenden Fettgewebe und / oder Lymphknoten mit steriler Schere. Euthanisieren der anästhesierten Mäuse durch zervikale Versetzung.
- Mit sterilen Scheren oder einem Skalpell, primäre Primärtumoren manuell in kleine Stücke (~ 1,0 mm 3 ). Platzieren Sie Tumorstücke in 3,0 mg / ml Kollagenase A und 4,0 U / ml DNase I, gelöst in DMEM. Verwenden Sie ~ 10 ml des oben genannten Verdauungsmediums pro 1,0 cm Durchmesser Tumor.
- Führen Sie die Verdauung in einer sterilen 25 ml-Flasche mit einem sterilen Rührstab bei ~ 125 U / min und 37 ° C für 40 min.
- Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von fötalem Rinderserum (FBS) zu einer Endverdünnung von 10% und legen Sie die gesamte Mischung auf wEt ice wo es beibehalten wird.
- Filtriere die verdaute Tumorsuspension durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb in ein 50 mL konisches Röhrchen und verwirre jeden im Sieb verbleibenden Tumor. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 xg bei 4 ° C.
- Das Pellet in 10 ml DMEM pro 1,0 cm Tumor resuspendieren und durch ein 0,7 μm Nylon-Sieb filtrieren. Zählzellkonzentration, dann bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren.
- Pellet in 10% Dimethylsulfoxid mit 90% FBS in einer Konzentration von 2 x 10 7 lebenden Zellen / ml resuspendieren. Spezielle Suspensionen des ganzen Primärtumors bei -80 ° C aufbewahren.
2. Orthotopische Injektion von Mamma-Tumor
- Teilweise aufgetaute gefrorene primäre Tumorsuspensionen bei 37 ° C, bis das gefrorene Pellet aus dem Kryogenrohr in 20 mL DMEM freigesetzt werden kann und die Zellen zählt. Bei 300 xg bei 4 ° C zentrifugieren und Zellen in einem 1: 1 DMEM resuspendieren: Wachstumsfaktor-reduzierte solubilisierte Basalmembranpräparation eXtrahiert aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml (siehe Tabelle der Materialien ).
- Legen Sie die anästhesierte Empfänger weibliche syngene Maus ventrale Seite nach oben und pflegen unter kontinuierlichen Sedierung durch die Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesie-Maske.
- Sterilisieren Sie die rechte 4. Brustdrüsen-Injektionsstelle mit aerosolisiertem 70% Ethanol und applizieren Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen.
- 100 μl (1 x 10 6 lebende Zellen aus gefrorenen primären Tumorsuspensionen) in die ungekürzte rechte 4. Brustdrüse der 6 bis 10 Wochen alten weiblichen FVB / n-Maus mit einer 29 g 0,3 mL Insulinspritze injizieren.
3. Chirurgische Resektion des Orthotopischen Mamma-Tumors
- 38-60 Tage nach der Tumorzellinjektion, Euthanisierungsmäuse, die keine orthotopen Tumorvolumina im Bereich von 172 bis 450 mm 3 Volumen aufweisen (Länge x (Breite 2)
- Legen Sie anästhesierte Mäuse, die die richtige Tumorgröße ventral nach oben unter kontinuierlicher Sedierung durch Verabreichung von 2% Isofluran über eine Anästhesiemaske und bestätigen Sie, dass die Maus korrekt mit einem abwesenden Fußquetschreflex betäubt wird. Tragen Sie Tierarzneimittel auf die Augen zur Verhinderung der Trockenheit, während unter Sedierung.
- Spray 70% Ethanol zur Sterilisation der chirurgischen Bereich um den primären Tumor, dann wenden Poly (vinylpyrrolidon) -Iod mit einem sterilen Wattestäbchen.
HINWEIS: Die Haarentfernung an der chirurgischen Stelle führte zu Hautausschnitten und / oder Infektionen für ~ 5% Mäuse und wurde daher von diesem Schritt ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt). - Wie in Abbildung 1C gezeigt , machen Sie einen anfänglichen Hautschnitt mit stumpfen Scheren medial-kaudal zum Tumor.
- Als nächstes machen Sie eine überlegene Exzision der Haut ( Abbildung 1C ) medial zum Tumor. Achten Sie auf die Notwendigkeit, jede Vaskulatur fe zu kauterisierenDen auf der Haut befindlichen Tumor vor dem Ausbau des Einschnitts.
- Setzen Sie den Hautschnitt seitlich fort (hinter dem Tumor), dann machen Sie eine überlegene Hautexzision (lateral to tumor) und mediale Exzision (überlegen zum Tumor) ( Abbildung 1C ).
- Nachdem die Haut in Umfangsrichtung um den Tumor herausgeschnitten worden ist ( Abbildung 1C ), heben Sie die überliegende Haut an den Tumor mit Pinzette, während stumpfes Sezieren der Tumor weg von der Bauchwand Muskulatur und halten die Brustdrüsen intakt.
- Identifizieren (durch stumpfes Präparieren) und große Gefäße kauterisieren Laufen durch die 4. und 5. Brustdrüsen.
- Verbrauch etwa die Hälfte der 4. und 5. Brustdrüsen am Kauterisation Ort des Tumors zu befreien, darüber liegende Haut und Segmente der Brustdrüsen (1C).
- Im Falle von Blutungen, identifizieren aktiv BlutungenSchiffe und sofort kauterisieren. Wenn mehr als 250 μl Blut verloren gehen, schließen Sie die Maus aus dem Studium und euthanisieren Sie es.
- Schließen Sie Exzisionsstellen mit Wundklammern mit einem Wundklammerapplikator ( Abbildung 1C ).
HINWEIS: Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation mit einem Wundclip-Entferner. - Verabreichung von warmer steriler Kochsalzlösung subkutan (4% des Körpergewichts des Tieres) und halten das Tier mit einer Wärmelampe warm. Überprüfe die Tiere alle 5-10 Minuten bei der Erholung von der Anästhesie.
HINWEIS: Die Verabreichung von entweder Bupivacain oder Lidocain erhöhte die postoperative Mortalität (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die Anzeichen von Schmerzen zeigten (Knicken, unfreiwillig zu bewegen, Bruchlosigkeit) 1 h nach der Operation wurden euthanasiert.- Sobald die Maus vollständig erholt ist, bringen Sie sie an die Gesellschaft anderer Mäuse zurück.
4. Isolierung und Verarbeitung von Blut und Lunge für Durchflusszytometrie und Histologie
<Ol>ANMERKUNG: Gefrorene Bestandteile von gelöstem Bromodeoxyuridin werden innerhalb von 1 Monat nach der Herstellung verwendet.
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Representative Results
Größer als 75% der Empfängermäuse, die 1 x 10 6 Zellen aus primären Mamma-Tumoren erhalten, die von MMTV-PyMT-Mäusen abgeleitet sind, entwickeln einzelne Mamma-Adenokarzinome im Bereich von 172 bis 450 mm 3 innerhalb von 38-60 Tagen (Daten nicht gezeigt). Mäuse, die für eine Randomisierung in Frage kommen, werden dann nach der chirurgischen Resektion von Primärtumoren in die Studiengruppen eingeschrieben ( Abbildung 1C ). Primärer Tumorwachstum wurde bei weniger als 2% der Mäuse identifiziert, die eine chirurgische Resektion des Primärtumors durchmachten ( Ergänzende Abbildung 1 ). 45% der Empfängermäuse, die durch dieses Protokoll ausgewertet wurden, entwickelten histologisch nachweisbare metastatische Herde bis zum Tag 115 post-Tumor-Resektion ( Abbildung 1B ). Um die Histologie von Metastasen in Gebieten zu identifizieren, die mit metastatischen Zellen durch H & E-Färbung identifiziert wurden, wurden benachbarte Gewebeabschnitte durch PyMT-PCR ausgewertet (Daten nichtgezeigt).
Abbildung 1 : postoperative Resektion von Primärtumoren und Entwicklung der de novo pulmonalen Metastase. ( A ) Experimentelles Schema des murinen Mamma-Adenokarzinom-Metastasierungsmodells. † bedeutet, dass alle Mäuse kardial perfundiert und mit BrdU am Tag der Euthanasie injiziert wurden. ( B ) Repräsentatives H & E, bei dem der Nachweis von metastatischen Herden durch serielle Sektion von FFPE-Lungengewebe mit abgetrennten Lappen bestimmt wurde. Metastatische Foci (> 5 Zellen) wurden durch H & E-Färbung alle 100 μm, die 1300 μm Gewebe reflektierten, bestimmt. Lungen von 11 Mäusen wurden analysiert. ( C ) Schema der chirurgischen Resektion des primären Mamma-Tumors. Rote Zahlen und Pfeile bezeichnen die Reihenfolge und die Richtung der HautinzisionenAngrenzend an den primären tumor (links). Die rechten 4. und 5. Brustdrüsen mit großen Gefäße sind an dem Primärtumor (Mitte) von Wundverschluss mit Wundklammern (rechts) , gefolgt gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Isolierung, Perfusion und Fixierung der Lunge. Bild (links) und entsprechende Karikatur (rechts) sind von Lungenisolation, Perfusion und Fixierung gezeigt. (A) ein Mittellinienschnitt gezeigt , mit eingelassenem Bild eingezogene Haut Anzeigen der rechten 4. und 5.e Brustdrüsen aussetzt (Pfeil). ( B ) Die Bauchwand ist zum Zwerchfell geöffnet. ( C ) Nach dem Rückzug oDarm, die Bauchaorta (Pfeilspitze) wird identifiziert und aufgeschnitten. ( D ) Die Membran- und Seitenwände des Brustkorbes werden geschnitten, um die Thoraxhöhle freizulegen. ( E ) Die Lunge wird durch den rechten Ventrikel des Herzens perfundiert, bis die Lungen ganz weiß ( F ) sind. ( G ) Die exponierte Trachea wird identifiziert, gefolgt von der Injektion von Formalin ( H ) in die Trachea, bis sich die Lungen erweitert haben ( I ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1 : Primäres Tumorwachstum an der chirurgischen Stelle. Repräsentative H & E (oben) und grobe (unten) Bilder der verbleibenden rechten 4. und 5. Brustdrüse post-Operation zeigt Abwesenheit von tuNachwachsen mit Leisten-Lymphknoten ( AB ) und Brustdrüse mit primärem Tumor-Nachwachsen ( CE ). Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
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Discussion
Änderungen und Fehlersuche:
Wenn der stumpfe Sezierungs-Tumor von der Bauchwand entfernt ist, kann der Tumor an der Bauchwand haften bleiben. Dies wurde bei <5% der mit Tumoren injizierten Mäuse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Für Mäuse mit an der Bauchwand anhaftenden Tumoren sollte die Maus euthanasiert werden, da die Resektion ohne primärem Tumorwachstum schwierig ist.
Einschränkungen von Modell / Technik:
Während andere Forscher die Anwesenheit von fluoreszenzmarkierten einzelnen metastatischen Zellen, die an Leber, Niere, Milz und Gehirn verbreitet wurden, zusätzlich zur Lunge nach der Reimplantation von Mamma-terminalen Endknospen, die von MMTV-PyMT-Mäusen 7 abgeleitet wurden , abgesehen von der Lunge, beobachteten, beobachteten wir mehrere Mäuse mit metastatischen Herden in der Leber, deren Durchdringung noch bestimmt ist. Andere Orte der potentiellen metastatischen Belastung, wie LymphknotenS, Milz, Knochen und Gehirn, wurden nicht ausgewertet. Eine Einschränkung dieser Technik beinhaltete auch postoperative Exkorationen und Infektionen der Haut beim Rasieren der chirurgischen Stelle. Aus diesem Grund war die Sterilität der chirurgischen Stelle auf die Anwendung von 70% Ethanol, gefolgt von Poly (vinylpyrrolidon) -Iod beschränkt.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls:
Eine stumpfe Sezierung des Tumors von der Bauchwand ist ein kritischer Schritt (Schritt 3.7), wo die Vermeidung der Gefäße in der Brustdrüse durchgeführt werden sollte. Die Schritte 3.8 und 3.9 sind auch kritische Schritte, bei denen das größte Risiko für unkontrollierte Blutungen besteht. Die ungekrümmten proximalen und distalen Teile des Gefäßes sollten nach der Kauterisation identifiziert werden, um die Blutungsquellen leicht zu visualisieren.
Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden:
Mausmodelle von menschlichem Krebs imitieren Stufen der KrankheitProgression, Kinetik und Histopathologie bieten unschätzbare Instrumente, um neue Ziele für die Therapie zu identifizieren und zu bewerten sowie die potentielle Wirksamkeit neuer Therapeutika, die auf diese Moleküle / Wege hinweisen. Während Schwanzvene und / oder Herzinjektion von etablierten Krebszelllinien oft als experimentelle Modelle der Metastase verwendet werden, können diese nicht kritische Schritte im metastatischen Prozess rekapitulieren und stattdessen ektopische Organkolonisierungsassays reflektieren, bei denen Aspekte des Überlebens der Tumorzellen ausgewertet werden können 8 Darüber hinaus, während einige bestehende transgene Mausmodelle der de novo Mamma-Karzinogenese Entwicklung bieten Modell-Systeme ermöglichen die Untersuchung der Schritte in der Metastasierung beteiligt, erhebliche primäre Tumorbelastung in der Regel begrenzt die Dauer der Studie. So haben die Gruppen kultivierte neoplastische Zellen injiziert, die von MMTV-PyMT-Primärtumoren abgeleitet sind, um eine chirurgische Resektion zu ermöglichen. 9 Unsere Methode erweitert sich von diesen Techniken, wie es dNicht ausgewählt für neoplastische Zelllinien, die aus Tumoren in vitro gezüchtet werden, und führt direkt den vollständigen, heterogenen Primärtumor zu Empfängermäusen ein. Darüber hinaus ermöglicht die lange Latenz der Lungenmetastasenbildung in unserem Modell ein besseres therapeutisches Fenster für verschiedene Behandlungsstudien.
Zukünftige Anwendungen:
In Bezug auf die Bewertung der Wirksamkeit von Therapeutika in diesen Modellen, weil primäre Tumoren typischerweise in allen Brustdrüsen entwickeln, ist eine chirurgische Resektion aller Primärtumoren und eine adjuvante Bewertung von Therapien, die darauf abzielen, das Wachstum von metastatischen Kolonien zu minimieren, nicht möglich. Aufgrund dieser Probleme entwickelten wir ein autochthones Modell der metastatischen Verbreitung, bei dem die metastatische Verbreitung von Tumorzellen de novo auftritt und nach chirurgischer Resektion des Primärtumors eine ausgedehnte Latenzzeit festgestellt wird, die die Identifizierung der Metastase in der Lunge ermöglicht. Also dieses modellSpiegelt die menschliche Brustkrebs-Metastase und bietet ein einzigartiges System zur Bewertung der Wirksamkeit von Adjuvans-Therapien zur Auswirkung auf die Regulierung des krankheitsfreien Überlebens und / oder des Gesamtüberlebens mit definierten Endpunkten pro IACUC-Richtlinien.
Da ein großer Teil der Frauen mit Brustkrebs durch chirurgische Resektion von Primärtumoren 10 behandelt wird und diejenigen, die nachträglich eine distale Metastase entwickeln, impliziert, dass die Verbreitung und Aussaat vor der chirurgischen Resektion aufgetreten ist. Distale Orgelmikroumgebungen bieten einzigartige Nischen für überlebende und / oder vermehrende metastatische Zellen 11 . Daher ist es zwingend erforderlich, dass Modellsysteme diese Facetten imitieren, so dass Moleküle und Wege, die in sekundären Standorten operieren, die sich wahrscheinlich von Primärtumoren unterscheiden, identifiziert, untersucht und Therapien, die sie genau auf die Wirksamkeit ausrichten, Das hier entwickelte Modell liefert diese Aspekte für die Untersuchung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Offenlegung von Konflikten mit den hier dargestellten Daten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Jo Hill für die histopathologische Hilfe, Dr. John Gleysteen für den Unterricht in der chirurgischen Technik, Tessa Diebel für Videographie-Hilfe, alle Mitglieder der Wong- und Coussens-Labore für kritische Einblicke und Diskussionen und das OHSU Knight Cancer Institute für finanzielle Unterstützung. Die Autoren bestätigen die Unterstützung von T32GM071388-10 und T32CA106195-11 an CEG, das NCI / NIH, das Department of Defense Breast Cancer Research Program, die Susan G Komen Foundation, die Breast Cancer Research Foundation und eine Stand Up To Cancer - Lustgarten Foundation Pankreas-Krebs-Konvergenz-Traumteam Translationsforschungsstipendium (SU2C-AACR-DT14-14) an LMC, ein Frauengesundheitskreis der Stiftungspreis an MHW und das Brenden-Colson-Zentrum für Pankreasgesundheit an MHW und LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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- SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. Howlader, N. N. A., Krapcho, M. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. based on November 2010 SEER data submission, posted to the SEER web site. http://seer.cancer.gov/csr/1975_2008/ (2011).
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