Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du vurdere uttrykk for et stort utvalg av gener ved klonal nivå. Encellede RT-qPCR produserer meget pålitelige resultater med en sterk følsomhet for hundrevis av prøver og gener.
Abstract
Genuttrykk heterogenitet er en interessant funksjon for å undersøke i lymfoide populasjoner. Genekspresjon i disse cellene varierer i løpet av celleaktivering, stress, eller stimulering. Enkeltcelle multipleks genekspresjon muliggjør samtidig vurdering av flere titalls gener 1, 2, 3. Ved enkelt-celle-nivå, bestemmer multipleks genekspresjon befolkning heterogenitet 4, 5. Det gir mulighet for æren av befolkningen heterogenitet ved å bestemme både sannsynlig blanding av ulike forløper etapper blant modne celler og også mangfoldet av celle responser på stimuli.
Medfødte lymfoide celler (ILC) har nylig blitt beskrevet som en befolkning på medfødte effektorer i immunresponsen 6, 7. I denne protokollen, celle heterogenitet av ILC hanpatic Rommet er undersøkt i løpet av homeostase.
Foreløpig er den mest brukte teknikken til å vurdere genekspresjon er RT-qPCR. Denne metoden måler genekspresjon bare ett gen om gangen. I tillegg kan denne fremgangsmåte ikke anslå heterogenitet av genekspresjon, ettersom multiple celler er nødvendig for en test. Dette fører til måling av den gjennomsnittlige genekspresjon av befolkningen. Ved vurdering av et stort antall gener, blir RT-qPCR en tids, reagens og prøve krevende metode. Derfor avveiningene begrense antallet gener eller cellepopulasjoner som kan evalueres, øker risikoen for mangler det globale bildet.
Dette manuskriptet beskriver hvordan enkeltcelle multipleks RT-qPCR kan anvendes for å overvinne disse begrensningene. Denne teknikken har dratt nytte av senere MicroFluidics teknologiske fremskritt 1, 2. Reaksjoner som opptrer hos multipleks RT-qPCR chips ikke exceed den nanoliter-nivå. Derfor, encellede genekspresjon, så vel som samtidig multippel genekspresjon, kan utføres i et reagens, prøve-, og kostnadseffektiv måte. Det er mulig å teste celle-genet signatur heterogenitet på den klonale nivå mellom celleundergrupper innenfor en befolkning på forskjellige utviklingsstadier eller under forskjellige forhold 4, 5. Arbeider på sjeldne populasjoner med et stort antall forhold på enkeltcellenivå er ikke lenger en begrensning.
Introduction
I løpet av de siste årene, har medfødte lymfoide celler (ILCs) blitt stadig mer etterforsket. Til tross for sin mangel på antigen-spesifikke reseptorer, de tilhører lymfoidlinjen og representerer viktige voktere for vev homeostase og betennelse. ILCs er i dag delt inn i tre grupper basert på deres uttrykk av spesifikke transkripsjonsfaktorkombinasjoner og på deres evne til å produsere cytokiner 6, 7.
ILCs bidra til en rekke homeostatiske og patofysiologiske situasjoner i ulike organer via spesifikk cytokinproduksjon 8, 9. For å være i stand til å forstå rollen til disse celler, er det viktig å bestemme de forskjellige ILC subpopulasjoner pr organ og for å identifisere deres utviklingsmessige relasjoner. I tillegg har fenomener av plastisitet mellom de forskjellige delsettene er relatert. Ved å studere den heterogenitetenav cellene som er tilstede i ett organ, er det mulig å avgrense deres stadium av modning og for å skille sine spesifikke funksjoner.
For å illustrere teknikken av encellede multipleks RT-qPCR ble lever ILCs valgt, med særlig vekt på deres heterogenitet innenfor samme ILC gruppe (type 1 ILC) 10. Først, ved bruk av flowcytometri, ble tre distinkte populasjoner ILC karakterisert ved leveren. Gruppe 1 ILC representerer rundt 80% av de medfødte effektorer, mens de to andre bestander er sjeldne lever ILC populasjoner (mindre enn 5% av de medfødte effektorer). Disse bestandene ble sortert ved hjelp av allment uttrykt celleoverflatemarkører ILC populasjoner. Som et resultat, sortert ILC populasjoner i leveren ser stort sett lik en til en annen.
Encellede multipleks RT-qPCR har dukket opp som en av de beste teknikker for å komme til bunns i den heterogeniteten av disse populasjonene 11
Deretter ved å sortere alle cellene med en global ILC fenotype, er en bred oversikt over flere genekspresjon av leveren ILC populasjoner innhentet, selv om de representerer svært sjeldne populasjoner. En microfluidic-basert chip tillater eksperimentering med endaen liten mengde av cellemateriale. Som en konsekvens, kan genekspresjonsprofiler av sjeldne cellepopulasjoner oppnås. Ved hjelp av online-genet signaturanalyse programvare, cellebefolkningsgrupper og potensielle celle relasjoner kan bli undersøkt. Følgelig kan funksjonstester utføres for å validere clustering data på in vivo nivå.
Titalls genekspresjon kan bli vurdert samtidig på flere hundre eller flere enkeltceller på samme brikke 3, 11, 12. Utforming av analysen er den lengste og mest viktig del av forsøket. Bestemmelsen av de gener som er relevante for den hypotese som skal testes er av vesentlig betydning for å oppnå relevante resultater. Dernest er intern kontroll (for eksempel kjente overflatemarkører som brukes til sortering) og spesifikke kontroller nødvendig. Dette er avgjørende for å teste primer amplifikasjon spesifisitet, effektiviteten av forsterkningen, og than fravær av primer konkurranse. Derfor arbeider med enkelt-celle multipleks RT-qPCR er en tidsbesparende teknikk, som multippel-genekspresjon av en celle vurderes samtidig.
Ved å bruke den samme brikke og blanding av reagenser for alle celler som begrenser de mulige feil ved manipulering og muliggjør reproduserbarhet mellom prøver. Alt i alt har de forskjellige aspektene av enkelt-celle multipleks RT-qPCR muliggjør fremstilling av høyt pålitelige resultater på klonalt nivå, med en stor grad av følsomhet for et bredt spekter av prøver og gener. Resultatene gir kraftige og robuste data for biostatistiske tester.
Dette kan oppnås på grunn av den mikrofluid aspekt av fremgangsmåten, som gjør det mulig å arbeide med meget små mengder av materiale og fører til uttømmende resultater. Til slutt, ved hjelp av online programvare, er det mulig å sammenligne de ønskede populasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av ved Pasteur-instituttet Safety Committee i samsvar med det franske landbruksdepartementet og EU-retningslinjene.
1. Forbered en 96-brønns Single-celle sortering Plate
- Fremstille pre-amplifikasjon blandingen i et 1,5 ml rør ved tilsetning av 5,0 mL av spesifikk retro-transkripsjon-buffer, 1,3 ul av lavt etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) TE-buffer (10 mM TE-løsning, pH 8, og 0,1 mM EDTA-løsning; 0,2 pM filtrert ), og 0,2 ul Taq DNA-polymerase per brønn (Figur 1a).
- På en 96-brønners plate, fordele 6,5 ul pre-amplifikasjon blandingen i hver brønn (opp til 48 brønner). Denne platen er 96-brønners enkeltcellesortering plate.
MERK: Ved hjelp av en elektronisk pipette er anbefalt for denne protokollen. Det gir mulighet for presise og reproduserbare volummålinger og sparer tid.
2. Enkelt celledissosiasjon 3. Single-celle fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) 4. Pre-amplifikasjon 5. Forbered en 96-brønns Sample Plate 6. Utarbeide en 96-brønns analyseplate 7. encellede Gene-uttrykk Chip 8. Kjør Chip 9. Data Analysis 
NB: Det endelige volum i hver brønn av 96-brønns plate prøven bør være 9 pl.
MERK: Når du bruker allment uttrykt ILC celleoverflatemarkører, er 3 populasjoner definert: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, og NKp46 - IL-7Rα +. Alle populasjonene er sortert avstamning - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
MERK: Forskjellige celletyper kan sorteres på den samme 96-brønners enkeltcellesortering platen (figur 2).
MERK: riktig plassering av hver celle på den 96-brønners enkeltcellesortering platen er viktig. En plate layout bør holdes på et regneark programvare. Platen layout vil bli brukt i de neste trinnene (figur 1b) 14. La en brønn inneholdende 0,2 x analyseblanding og pre-forsterkning blanding på 96-brønners plate prøven uten celler. Denne brønnen er brukt som en no-input-kontroll. Gitt to rader med 6 brønner for et cDNA fortynning. Disse brønner blir anvendt som kontroller for primer effektivitet (figur 1b). 
Figur 3: Pre-forsterkning program. For å kunne få nok materiale, er pre-amplifikasjon av spesifikke målgener for sorterte enkeltceller nødvendig. 96-brønners enkeltcellesortering platen er lastet på en termo å følge pre-amplifikasjon program. De pre-amplifiseringsprodukter blir deretter fortynnet med lav EDTA TE-buffer, og kan brukes umiddelbart eller fryses ved -20 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
MERK: For å unngå gjentatt frysing og tining av primere, distribuere primere for pre-forsterkning mix og for 96-well analyseplate på samme tid.
MERK: Ingen væske bør sølt over brikken. 
Figur 4: Single-celle multiplex gen-uttrykk chip lasting. Disse trinnene krever great presisjon, spesielt under overføringen av 96-brønns plate til encellede multiplex gen-uttrykk chip. For å unngå lasting feil og misplacements, er det sterkt anbefalt å jobbe sekvensielt. Volumet tatt for hver overføring bør kontrolleres under pipettering prosessen. Til slutt er det viktig å unngå eventuelle bobler og for å fjerne dem i tilfelle av formasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
NB: "Standard-10min-Hotstart.pcl" er den mest brukte program for encellede multipleks RT-qPCR.
ΔCt = Ct sample - Ct internkontroll
Brett Change = 2 - (ΔCtsample-ΔCtnegative kontroll)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfoide populasjoner viser stort mangfold i genuttrykk. I denne protokollen, ble leveren ILC rommet heterogenitet undersøkt ved hjelp av encellede multipleks RT-qPCR genekspresjon. I motsetning til andre genekspresjon teknikker, tillater encellede multipleks RT-qPCR-genekspresjon arbeid på flere populasjoner, selv de sjeldneste, samtidig. Dette spesifisitet, kombinert med høy følsomhet ved klonal nivå, åpner for etterforskningen av forskjeller i genet underskrifter innen en populasjon og mellom sjeldne populasjoner. Som et eksempel ble genet skriftene 3 ILC befolkninger fra leveren hos fire-ukers gamle mus vurdert. Én populasjon er hyppig nok til å være lett identifiseres, mens de to andre er sjeldne (mindre enn 1% av avstamning-negative celler) i leveren.
En 96-brønners enkeltcellesortering plate og en 96-brønn analyseplate ble fremstilt før leveren dissection og dissosiasjon (figur 1). Hver blanding ble utarbeidet under en steril hette og distribuert med en elektronisk pipette for volum presisjon og reproduserbarhet. Alle reagenser ble vortexet før pipettering til å opprettholde homogenitet. Etter fremstilling kan 96-brønners cellesortering platen fryses inntil cellesortering, og den 96-brønners celleanalyseplate kan fryses inntil IFC lasting.
Livers ble dissekert og dissosiert til encellede suspensjoner. Cellene ble farget og sortert på tinte 96-brønners encellede sorteringsplater. Ved hjelp av FACS, ble 3 ILC populasjoner sortert basert på allment uttrykt ILC markører (figur 2). Etter cellesortering, ble cDNA syntetisert, og spesifikke målgener ble amplifisert (Figur 3 og Tabell 2). Etter pre-forsterkningstrinn, ble cDNA fortynnet i lav EDTA TE-buffer. Grunning og cDNA fra enkeltceller ble lastet inn på IFC-brikke (Fitallene 4 og 5a). De oppnådde resultater (figur 7a) ble forenklet for lettere å lese og analyse (figur 7b). Eksempler på riktig eller feil lastet chips blir vist (figur 5). En FAM figur av et riktig lagt brikke (figur 6) med forskjellige forsterkningssignaler er vist.
Resultatene viser at etter riktig cellesortering, pre-forsterkning, og lasting, vises ILC populasjonen heterogen for genekspresjon i leveren hos voksne villtype-mus (figur 7). Ved hjelp av programvare, har celle-spesifikke genekspresjonssignaturer (figurene 7 og 8), og cellepopulasjonen forhold (figur 8) kunne identifiseres. Hver sortert befolkningen har et bestemt gen signatur beriket i genuttrykk. For eksempel, celler sorteres som NKp46 - IL-7Rα + har enriched uttrykk for Rorc, hovedtranskripsjonsfaktor i gruppe 3 ILCs; Rora, en Rorc -homologous transkripsjonsfaktor; og Il-23R og Cxcr6, to viktige reseptorer i gruppe 3 ILC levermarkører i leveren. De samme observasjonene kan gjøres med NKp46 + IL-7Rα - og NKp46 + IL-7Rα + populasjoner. Hver celle er sjekket for rengjøring genekspresjon (HPRT, loven og GAPDH) for å utelukke ugyldige brønner; minst to husholdningsgener skal oppgis å vurdere verdiene som gyldig.
Interessant, kan denne teknikken for definisjonen av to subpopulasjoner av NKp46 + IL-7Rα - basert på genet signaturer. Forskjeller mellom de to underskrifter må valideres av andre sett av ulike funksjonelle eksperimenter.
![Figur 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Figur 2: FACS-celle-strategi. Bilder er representative for isolerte leverceller fra 4-uker gamle mus. (A) FSC-A / SSC gating-A, (b) FSC-H / FSC-W dublett diskriminering, (c, d, og e) i live, avstamning-negative CD45.2 + CD4 - CD3 - celler gating. (F) Ved hjelp av allment uttrykt ILC celleoverflatemarkører, vi definert 3 populasjoner: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα +, og NKp46 - IL-7Rα +. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ROX figurer av riktig (en) Og feil (b) lastet chips. (A) Riktig lastet encellede multiplex gen-uttrykk chip skal vises med rette linjer og rader. Hvert reaksjonskammer er fylt og har samme dimensjon. (B) Feilaktig lastet encellede multiplex gen-uttrykk chip. Tomme linjer og rader av reaksjonskamrene vises (grønn firkant), samt bøyelinjer (blå firkant). Disse funksjonene kan være på grunn av feil "PRIME" eller "Load" trinn, samt gjenværende bobler i IFC brønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: FAM (Fluorescein amidite) figur av en ordentlig lastet chip. Etter noen få sykluser (avhengig av prøvene og på primeren s vurderes), bør forskjeller i reaksjonskammeret lysstyrke vises. Reaksjonskamrene med en forsterkning signalet skal vises lysere (blå firkant) enn reaksjonskamrene med ingen eller lav forsterkning signaler (grønn firkant). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Varme kart erholdt før (a) og etter (b) modifiseringer. (A) Direkte varmekart oppnådd uten analyse eller endring av analysen / sample rekkefølge. (B) Modifisert varmekartet oppnådd etter prøven og analyse navn definisjon. Ingen inngangs brønner (blå firkant) oppnås hvis ingen forsterkning oppstår. Ineffektiv primere (grønn firkant). cDNA fortynning test (lilla firkant). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Single-cellepopulasjon clustering. En dataanalyse programvare brukes til å bestemme clustering mellom populasjoner. Gratis clustering programvare er tilgjengelig på nettet. Ved å vurdere hele ekspresjonsprofilen av en enkelt celle, kan programvaren vise genet signaturer og cellepopulasjon relasjoner. Hver rute representerer en celle: blå er NKp46 + IL-7Rα -, rødt er NKp46 + IL-7Rα +, og grønt er NKp46- IL-7Rα +. Hver befolkningen har et bestemt gen signatur. Innenfor NKp46 + IL-7Rα - befolkningen, kan to signaturer bli sett, attesterer til befolkningen heterogenitet.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| primere | |
| ACTB | Il-23r |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| BCL2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| CD49b | Notch1 |
| Cxcr5 | Notch2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | Rorc |
| ETS1 | Runx3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| Gata3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| hprt | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| Il-22 | |
Tabell 1: Primer liste.
Tabell 2: Pre-forsterkning program. Hvert trinn av pre-amplifikasjon programmet er vist med den fullstendig informasjon vedrørende den tid, temperatur, og antall sykluser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan du skaffer uttømmende genekspresjon informasjon på klonale nivå. Her undersøkte vi lever ILC rommet heterogenitet. Etter én enkelt celle sortering av ulike ILC populasjoner (basert på aner uttrykt ILC overflatemarkører), prøvene ble pre-amplifisert for spesifikke forhåndsvalgte gener. Deretter ble det oppnådde cDNA og primere applisert på en multipleks RT-qPCR mikrofluid chip. Til slutt, erholdt vi ekspresjon av 48 forskjellige gener fra 48 enkle celler. Genuttrykk resultatene ble analysert via en online programvare for å undersøke gen signatur og cellebefolknings relasjoner.
Hovedfordelen med denne teknikk er muligheten til å vurdere flere genekspresjon samtidig. Den gjør det også arbeidet ved klonal nivå og på svært sjeldne populasjoner. I motsetning til konvensjonelle RT-qPCR metoder, har encellede multipleks RT-qPCR ingen gjennomsnittseffekt, siden genekspresjon vurderes til klonale nivå. Dermed, Heterogenitet innen en populasjon kan oppdages og analyseres. Encellede RT-qPCR uttrykk tillater arbeid på svært sjeldne populasjoner, siden bare svært få celler er nødvendig for å oppnå bred informasjon om genuttrykk. Dessuten kan forskjellige populasjoner av celler som skal undersøkes på den samme platen. Dette muliggjør påvisning av forskjeller i genet signatur mellom populasjoner, og med elektroniske dataverktøy, vurdering av cellepopulasjon relasjoner. Denne teknikk viser også andre fordeler i tillegg. Encellede multipleks RT-qPCR har fordelen av de siste microfluidic fremskritt. Volumene som trengs i IFC kamrene ikke overstige nanoliter-nivå. Således er lavere mengder av reagenser som anvendes, noe som reduserer kostnadene ved eksperimenter. Til slutt blir det samlede antall pipetteringstrinn redusert, og dermed begrenser muligheten for pipettering feil. Trinnene er samtidig for alle cellene, og kan gjøres med en multikanal pipette, slik at arbeid på en rask og tidsbesparende måte. Resultatene påden klonale nivå er reproduserbare, pålitelige, og kan brukes til å utføre robust dataanalyser.
Encellede multipleks RT-qPCR gjør imidlertid presentere noen begrensninger. Først denne teknikken nødvendiggjør kostbart og spesielt utstyr, slik som en mikrofluid chip, en mikrofluid chip kontroller, og en spesifikk termosykler. I motsetning til konvensjonelle RT-qPCR fremgangsmåter, er denne teknikken tids- og reagens-sparende, ettersom, med konvensjonell RT-qPCR, er mange studier for å oppnå statistisk signifikante sammenligninger. I denne protokollen, presenterer vi en prosedyre for å få genuttrykk i 48 gener. 96-96 multipleks RT-qPCR microfluidic chips er tilgjengelige. Disse brikker kan vurdere genekspresjon i 96 gener fra 96 celler på samme tid. Under cellesortering, er et minimum antall starter celler nødvendig, ettersom presisjon og celle renhet må være maksimal. Imidlertid, selv med et lite antall celler, er det likevel mulig å sortere for enkelt-celle multipleks RT-qPCR-genet expression (trinn 3). Endelig er encellede multipleks RT-qPCR en følsom metode. Ulike undersøkelser må gjennomføres før slike eksperimenter. For eksempel, for primer-mål-spesifisiteten, primere bør testes for forsterkningsvirkningsgrad og for den relative konkurranse for målet.
Flere trinn i protokollen må utføres med forsiktighet. Manipulering av små volumer kombinert med et stort antall prøver og analyser samtidig øke risikoen for pipettering feil (trinn 1, 4, 5, 6 og 7). Alle reagensene og blandinger bør virvlet før pipettering for å sikre en homogen løsning. Fordampning under pre-forsterkning (trinn 4) kan også påvirke de endelige resultatene. Platene bør alltid være riktig forseglet med en passende dekkfilmen. Sortering strategien må være meget nøyaktig (trinn 3) for å unngå døde celler eller flere celler i brønner i platene. FACS sorteringsmaskiner er nå utstyrt med single-celle sortering index programvare som kan ta opp som bestemt celle ble sortert i hver brønn. Det nye verktøyet vil være av interesse for bestemmelse av hvorvidt genet signaturer er korrelert til celleoverflatemarkør intensitet. Prøve- og analyse posisjoner på chips må organiseres omhyggelig, da dette er viktig for eksperimentet (trinn 1, 5 og 6). Endelig valg av primere (trinn 1 og 6) er et kritisk punkt. Hver primer må velges basert på tidligere beskrevet resultater eller forventede resultater. En tilfeldig valg av primere i settet av undersøkte gener kan svekke den endelige avlesningen av forsøket. Videre primere som korrelerer med celleoverflatemarkør anvendt for cellesortering må brukes som kontroller med husholdningsgener.
Vurdere multiplex genekspresjon ved klonal nivå tilbyr en bedre karakterisering av leveren ILC heterogen rommet enn i tidligere forskning. Denne teknikken, som leveres av online programvare, beskriver mer presist different undergrupper av ILC i leveren ved homeostase enn studier med bare celleoverflatemarkører. Videre er det mulig å vurdere cellepopulasjon forhold og for å bygge differensieringsnettverk. Genet signaturer, basert på enkelt-celle genuttrykk, er også viktige verktøy for å skjelne celle befolknings funksjoner og for å undersøke mulige roller. Enkeltcelle multipleks RT-qPCR er en av de beste teknikker for et genekspresjon assay for å oppnå pålitelige data. Disse dataene er lett håndterlig med bioinformatikk programvare 15. enkeltcelle multipleks RT-qPCR i forhold til andre teknikker for genekspresjon studier, som mikromatriser eller RNA-sekvensering, gir høy følsomhet. Andre tilnærminger til enkelt-celle analyse er blitt beskrevet og kan anvendes som komplementære teknikker for å encellet multipleks RT-qPCR 15, 16. Videre kan teknikken utføres med en hvilken som helst kombinasjon primer, allowing brukere å se på personlige gen signaturer. Mange andre programmer kan brukes med denne teknikken. For eksempel kan tidsforløpet genekspresjon av celler i hele utvikling bli gjort for å vurdere den modifikasjon av den molekylære profil under utvikling. Medikament effekter på celler kan også bli undersøkt med medikament-fortynning for å bestemme terskelen for medikament effektivitet på genekspresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
