Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التعبير عن مجموعة كبيرة من الجينات على مستوى نسيلي. وحيدة الخلية RT-QPCR يؤدي إلى نتائج موثوق بها للغاية مع حساسية قوية لمئات العينات والجينات.
Abstract
التعبير الجيني عدم التجانس هو ميزة مثيرة للاهتمام للتحقيق في السكان اللمفاوية. التعبير الجيني في هذه الخلايا تختلف خلال تنشيط الخلايا، والإجهاد، أو التحفيز. وحيدة الخلية التعبير الجيني تعدد الإرسال يمكن تقييم في وقت واحد من عشرات الجينات 1، 2، 3. على مستوى خلية واحدة، التعبير الجيني تعدد الإرسال يحدد التجانس السكاني 4، 5. انها تسمح للتمييز من عدم التجانس السكاني عن طريق تحديد كل من مزيج محتمل من مراحل السلائف متنوعة بين خلايا ناضجة وأيضا تنوع استجابات الخلايا للمحفزات.
وقد وصفت الخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) في الآونة الأخيرة كما يبلغ عدد سكانها المستجيبات الفطرية الاستجابة المناعية 6 و 7. في هذا البروتوكول، وعدم التجانس الخلية لمؤتمر العمل الدولي انهوالتحقيق في مقصورة patic خلال التوازن.
حاليا، هذه التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع لتقييم التعبير الجيني هو RT-QPCR. هذا التعبير الجيني التدابير الطريقة فقط جين واحد في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة لا يمكن تقدير التباين في التعبير الجيني، وأن هناك حاجة إلى خلايا متعددة للاختبار واحد. وهذا يؤدي إلى قياس متوسط التعبير الجيني للسكان. عند تقييم أعداد كبيرة من الجينات، يصبح RT-QPCR وقت-، reagent-، وطريقة تستغرق العينة. وبالتالي، فإن المفاضلة تحد من عدد الجينات أو السكان الخلية التي يمكن تقييمها، مما يزيد من خطر المفقودين الصورة العالمية.
توضح هذه المخطوطة كيف حيدة الخلية متعدد RT-QPCR يمكن استخدامها للتغلب على هذه القيود. وقد استفادت هذه التقنية من على microfluidics مؤخرا التقدم التكنولوجي 1 و 2. ردود الفعل التي تحدث في متعدد رقائق RT-QPCR لا غير شاملالعيدين المستوى نانولتر. وبالتالي، التعبير الجيني وحيدة الخلية، وكذلك التعبير الجيني متعددة في وقت واحد، لا يمكن أن يؤديها في reagent-، sample-، وبطريقة فعالة من حيث التكلفة. فمن الممكن لاختبار الجينات الخلوية توقيع التجانس على مستوى نسيلي بين مجموعات فرعية خلية ضمن مجموعة من السكان في مراحل النمو المختلفة أو في ظل ظروف مختلفة 4، 5. العمل على السكان نادر مع أعداد كبيرة من الشروط على مستوى خلية واحدة لم يعد قيدا.
Introduction
على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق على نحو متزايد الخلايا اللمفاوية الفطرية (الاستقصائية). وعلى الرغم من عدم وجود مستقبلات مستضد معين، وأنها تنتمي إلى سلالة اللمفاوية وتمثل حراس مهم لتوازن الأنسجة والالتهابات. وتنقسم الاستقصائية حاليا إلى ثلاث مجموعات على أساس التعبير عنها من مجموعات محددة عامل النسخ وعلى قدرتها على إنتاج السيتوكينات 6 و 7.
تساهم الاستقصائية إلى العديد من حالات التماثل الساكن والفيزيولوجية المرضية في أجهزة متنوعة عبر إنتاج السيتوكينات محددة 8 و 9. لتكون قادرة على فهم دور هذه الخلايا، فمن المهم تحديد مختلف المجموعات السكانية الفرعية مؤتمر العمل الدولي في الجهاز وتحديد العلاقات التنموية. وبالإضافة إلى ذلك، تم المتعلقة ظواهر اللدونة بين مجموعات فرعية مختلفة. من خلال دراسة التباينمن الخلايا الموجودة في الجهاز واحد، فمن الممكن لتحديد مراحلها من النضج وللتمييز وظائفها المحددة.
لتوضيح تقنية وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR، وقد تم اختيار الاستقصائية الكبدية، مع التركيز بشكل خاص على عدم التجانس في إطار المجموعة نفسها لجنة القانون الدولي (نوع 1 ILC) 10. أولا، من خلال استخدام التدفق الخلوي، وتميزت ثلاثة السكان لجنة القانون الدولي واضح في الكبد. تمثل مجموعة 1 مؤتمر العمل الدولي حوالي 80٪ من المستجيبات الفطرية، في حين أن اثنين من السكان الآخرين نادرة السكان لجنة القانون الدولي الكبدي (أقل من 5٪ من المستجيبات الفطرية). تم فرز هؤلاء السكان باستخدام أعرب على نطاق واسع علامات سطح الخلية من السكان لجنة القانون الدولي. ونتيجة لذلك، تم فرزها السكان لجنة القانون الدولي في الكبد تبدو واحدة مماثلة على نطاق واسع إلى آخر.
وقد ظهرت وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR باعتبارها واحدة من أفضل التقنيات لتحقيق على وجه السرعة عدم تجانس هؤلاء السكان 11
بعد ذلك، عن طريق فرز جميع الخلايا مع النمط الظاهري لجنة القانون الدولي العالمي، ويتم الحصول على نظرة واسعة للتعبير متعددة الجينات الكبد السكان لجنة القانون الدولي، على الرغم من أنها تمثل السكان نادرة للغاية. رقاقة القائم على ميكروفلويديك يسمح التجريب مع حتىكمية صغيرة من مادة الخلية. ونتيجة لذلك، فإن ملامح التعبير الجيني للسكان الخلية نادرة يمكن الحصول. استخدام الانترنت التوقيع الجيني برامج التحليل، مجموعات السكان الخلية والعلاقات المحتملة للخلايا يمكن التحقيق فيها. ونتيجة لذلك، الاختبارات الوظيفية لا يمكن أن يؤديها للتحقق من صحة البيانات التجميع على مستوى في الجسم الحي.
يمكن تقييم عشرات من تعبيرات الجين الوقت نفسه على مئات أو أكثر من الخلايا واحدة على الشريحة نفسها 3 و 11 و 12. تصميم الاختبار هو أطول وأهم جزء من التجربة. تحديد الجينات ذات الصلة لفرضية لفحصها هو الهدف الأسمى للحصول على نتائج ذات الصلة. ثانيا، هناك حاجة إلى الرقابة الداخلية (مثل علامات سطح معروفة تستخدم لفرز) وضوابط محددة. هذا أمر بالغ الأهمية لاختبار خصوصية التمهيدي التضخيم، وكفاءة التضخيم، وركان غياب المنافسة التمهيدي. لذلك، والعمل مع وحيد الخلية متعدد RT-QPCR هو أسلوب للوقت، كما يتم تقييم التعبير متعددة الجينات في خلية في نفس الوقت.
باستخدام نفس رقاقة ومزيج من المواد الكيميائية لجميع خلايا يحد من الأخطاء المحتملة من التلاعب ويسمح لاستنساخ بين العينات. وإجمالا، فإن جوانب مختلفة من وحيد الخلية متعدد RT-QPCR تسمح لإنتاج نتائج موثوق بها للغاية على مستوى نسيلي، مع مستوى كبير من الحساسية لمجموعة واسعة من العينات والجينات. النتائج التي تم الحصول عليها توفر بيانات قوية ومتينة للاختبارات الإحصاء الحيوية.
ويمكن تحقيق ذلك بسبب الجانب ميكروفلويديك من طريقة، والذي يسمح للعمل على كميات صغيرة جدا من المواد ويؤدي إلى نتائج شاملة. وأخيرا، وذلك باستخدام البرمجيات عبر الإنترنت، فمن الممكن المقارنة بين السكان المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة السلامة معهد باستور وفقا لوزارة الزراعة الفرنسية وإرشادات الاتحاد الأوروبي.
1. إعداد 96-جيدا وحيدة الخلية الفرز لوحة
- تحضير مزيج ما قبل التضخيم في أنبوب 1.5 مل بإضافة 5.0 ميكرولتر من العازلة محدد الرجعية النسخ، 1.3 ميكرولتر من ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل المنخفض (EDTA) TE العازلة (10 ملي TE الحل، ودرجة الحموضة 8، والحل 0.1 ملي EDTA؛ 0.2 ميكرومتر تصفيتها )، و 0.2 ميكرولتر من طق الحمض النووي بوليميريز لكل بئر (الشكل 1A).
- في لوحة 96-جيدا، وتوزيع 6.5 ميكرولتر من مزيج ما قبل التضخيم في كل بئر (تصل إلى 48 بئرا). هذه اللوحة هي 96-جيدا خلية واحدة لوحة الفرز.
ملاحظة: استخدام ماصة الالكترونية يوصى به لهذا البروتوكول. انها تسمح لقياس حجم دقيقة وقابلة للتكرار ويوفر الوقت.
2. تفكك خلية واحدة 3. وحيدة الخلية مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 4. قبل التضخيم 5. إعداد لوحة عينة 96-جيدا 6. إعداد لوحة الفحص جيدا 96 7. وحيدة الخلية الجينات التعبير رقاقة 8. تشغيل رقاقة تحليل 9. البيانات 
ملاحظة: الحجم النهائي في كل بئر من لوحة عينة 96-جيدا ينبغي أن يكون 9 ميكرولتر.
ملاحظة: عند استخدام علامات سطح الخلية لجنة القانون الدولي أعرب على نطاق واسع، يتم تعريف 3 السكان: NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +، وNKp46 - IL-7Rα +. يتم فرز جميع السكان النسب - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
ملاحظة: يمكن فرز أنواع الخلايا المختلفة على نفس 96-جيدا لوحة الفرز وحيدة الخلية (الشكل 2).
ملاحظة: تحديد المواقع المناسبة من كل خلية على لوحة فرز 96-جيدا خلية واحدة أمر ضروري. يجب أن تبقى هناك تخطيط لوحة على برنامج جداول البيانات. سيتم استخدام تخطيط لوحة في الخطوات القليلة القادمة (الشكل 1B) 14. ترك واحدة تحتوي على مزيج جيد 0.2x فحص ومزيج ما قبل التضخيم على لوحة عينة 96-جيدا دون الخلايا. ويستخدم هذا فضلا عن سيطرة أي من المدخلات. ترك صفين من 6 آبار لتخفيف كدنا]. وتستخدم هذه الآبار والضوابط للكفاءة التمهيدي (الشكل 1B). 
الشكل (3): برنامج ما قبل التضخيم. من أجل الحصول على ما يكفي من المواد، مطلوب قبل التضخيم من الجينات المستهدفة المحددة على الخلايا وحيدة تم فرزها. يتم تحميل 96-جيدا خلية واحدة لوحة الفرز على thermocycler لمتابعة برنامج ما قبل التضخيم. ثم يتم تخفيفه المنتجات قبل التضخيم مع العازلة TE منخفضة EDTA ويمكن استخدامها على الفور أو تجميدها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: لتجنب تجميد المتكررة وذوبان الاشعال وتوزيع الاشعال لمزيج قبل التضخيم ول-أهلا وسهلا 96ل لوحة فحص في نفس الوقت.
ملاحظة: يجب أن يكون تسرب السائل لا على رقاقة. 
الشكل (4): وحيدة الخلية تعدد الإرسال الجينات التعبير رقاقة التحميل. تتطلب هذه الخطوات زالدقة ريت، خصوصا أثناء نقل لوحة 96-جيدا إلى خلية واحدة تعدد الإرسال رقاقة الجينات التعبير. لتجنب الأخطاء التحميل وmisplacements، فإنه ينصح بشدة على العمل بالتتابع. يجب السيطرة على حجم اتخاذها من أجل كل نقل أثناء عملية pipetting ل. وأخيرا، من المهم تجنب أي فقاعات ولإزالتها في حال تشكيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملاحظة: "الافتراضي-10min-Hotstart.pcl" هو برنامج الأكثر استخداما لوحيدة الخلية متعدد RT-QPCR.
ΔCt = ط م عينة - الرقابة الداخلية ط م
أضعاف تغيير = 2 - (مراقبة ΔCtsample-ΔCtnegative)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السكان اللمفاوية عرض تنوع كبير في التعبير الجيني. في هذا البروتوكول، وكان التحقيق عدم التجانس الكبد مقصورة لجنة القانون الدولي باستخدام وحيدة الخلية متعدد التعبير الجيني RT-QPCR. وخلافا للتقنيات التعبير الجيني أخرى، وحيدة الخلية متعدد التعبير الجيني RT-QPCR يسمح العمل على العديد من السكان، حتى أندر، في نفس الوقت. هذه الخصوصية، إلى جانب وجود حساسية عالية على مستوى نسيلي، تتيح للتحقيق في الاختلافات في التواقيع الجينات بين السكان وبين السكان نادرة. وكمثال على ذلك، تم تقييم التوقيعات الجينات من 3 السكان لجنة القانون الدولي من أكباد فئران عمرها 4 أسابيع. السكان واحد هو كثرة ما يكفي لتحديدها بسهولة، في حين أن اثنين آخرين نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا النسب السلبية) في الكبد.
تم إعداد فرز 96 لوحة جيدا وحيدة الخلية ولوحة 96-جيدا الفحص قبل dissectio الكبدن والتفكك (الشكل 1). وقد أعد كل مزيج تحت غطاء العقيمة وتوزيعها مع ماصة الالكترونية لحجم الدقة والتكاثر. تم vortexed جميع الكواشف قبل pipetting لللحفاظ على التجانس. بعد إعداد، لوحة فرز خلية 96-جيدا يمكن تجميدها حتى الخلية الفرز، و96-جيدا لوحة خلية الفحص يمكن تجميدها حتى مؤسسة التمويل الدولية التحميل.
تم تشريح الكبد وفصلها إلى وحيدة الخلية تعليق. كانت ملطخة الخلايا وفرزها على إذابة وحات الفرز وحيدة الخلية 96-جيدا. باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، تم فرز 3 السكان لجنة القانون الدولي على أساس علامات لجنة القانون الدولي أعرب على نطاق واسع (الشكل 2). بعد فرز الخلايا، تم تصنيعه [كدنا]، ووتضخمت الجينات المستهدفة المحددة (الشكل 3 والجدول 2). بعد الخطوة ما قبل التضخيم، والمخفف [كدنا في انخفاض عازلة EDTA TE. تم تحميل الترب و كدنا] من خلايا مفردة على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية (فايgures 4 و 5A). تم تبسيط النتائج التي تم الحصول عليها (الشكل 7A) لتسهيل القراءة والتحليل (7B الشكل). وترد أمثلة من رقائق تحميل بشكل صحيح أو غير صحيح (الشكل 5). ويرد الرقم FAM من شريحة تحميلها بشكل صحيح (الشكل 6) مع إشارات التضخيم مختلفة.
وأظهرت النتائج أنه بعد فرز الصحيح الخلية، قبل التضخيم، والتحميل، يظهر سكان لجنة القانون الدولي غير المتجانس للتعبير الجينات في كبد الفئران من النوع البري الكبار (الشكل 7). استخدام البرمجيات عبر الإنترنت، والتوقيعات التعبير الجيني خلية محددة (أرقام 7 و 8) وعلاقات السكان الخلية (الشكل 8) يمكن تحديدها. كل سكان مرتبة لديه توقيع جين معين المخصب في التعبير الجيني. على سبيل المثال، خلايا فرزها كما NKp46 - IL-7Rα + ديك هالتعبير nriched من Rorc، عامل النسخ الرئيسي للمجموعة 3 الاستقصائية. RORA، Rorc عامل النسخ -homologous. وايل 23R وCxcr6، واثنين من مستقبلات مهمة لمجموعة 3 علامات الكبد لجنة القانون الدولي في الكبد. الملاحظات نفسها يمكن أن تكون مع NKp46 + IL-7Rα - وNKp46 + IL-7Rα + السكان. يتم فحص كل خلية للتعبير التدبير المنزلي الجينات (Hprt، قانون، وGAPDH) لاستبعاد الآبار غير صالحة. يجب التعبير عن اثنين على الأقل من الجينات التدبير المنزلي للنظر في القيم صحيحا.
ومن المثير للاهتمام، وهذا الأسلوب يسمح للتعريف اثنين من القطعان من NKp46 + IL-7Rα - بناء على التوقيعات الجينات. الاختلافات بين تلك التوقيعات لهما أن التصديق عليها من قبل مجموعات أخرى من التجارب وظيفية مختلفة.
![الشكل 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
الشكل 2: استراتيجية خلية FACS. الصور هي تمثيلية من خلايا الكبد المعزولة من فئران عمرها 4 أسابيع. (أ) FSC-A / SSC-A النابضة والتمييز صدرة (ب) FSC-H / FSC-W، (ج، د، ه) على قيد الحياة،-نسب سلبي CD45.2 + CD4 - CD3 - الخلايا النابضة. (و) استخدام علامات سطح الخلية لجنة القانون الدولي أعرب على نطاق واسع، حددنا 3 السكان: NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +، وNKp46 - IL-7Rα +. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: أرقام ROX بشكل سليم (أ) وغير صحيح (ب) تحميل رقائق البطاطس. (أ) يجب أن تظهر تحميلها بشكل صحيح وحيدة الخلية تعدد الإرسال الجينات التعبير رقاقة مع خطوط مستقيمة والصفوف. شغل في كل دائرة رد الفعل، ولها نفس البعد. (ب) محملة بشكل غير صحيح وحيدة الخلية تعدد الإرسال رقاقة الجينات التعبير. تظهر خطوط فارغة وصفوف من غرف رد فعل (الساحة الخضراء)، فضلا عن خطوط منحنية (المربع الأزرق). هذه الميزات يمكن أن يكون راجعا إلى "نخبة" غير لائق أو الخطوات "التحميل"، وكذلك لفقاعات المتبقية في الآبار مؤسسة التمويل الدولية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: FAM (فلوريسئين amidite) شخصية من شريحة تحميل بشكل صحيح. بعد بضع دورات (اعتمادا على العينات وعلى التمهيدي ق تقييمها)، يجب أن تظهر الاختلافات في سطوع دائرة رد الفعل. يجب أن تظهر غرف رد فعل مع إشارة التضخيم أكثر إشراقا (المربع الأزرق) من غرف رد فعل أو مع أي اشارات التضخيم منخفضة (الساحة الخضراء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: خريطة الحرارة التي تم الحصول عليها من قبل (أ) وبعد (ب) التعديلات. (أ) خريطة الحرارة المباشرة التي تم الحصول عليها من دون تحليل أو تعديل نظام الفحص / عينة. (ب) خريطة الحرارة التعديل التي تم الحصول عليها بعد عينة وفحص تعريف الاسم. ويتم الحصول على أي الآبار الإدخال (المربع الأزرق) إذا لم يحدث التضخيم. الاشعال عدم كفاءة (الساحة الخضراء). اختبار كدنا] تخفيف (مربع الأرجواني). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: وحيدة الخلية تجميع السكان. يتم استخدام برنامج تحليل البيانات لتحديد تجمع بين السكان. برنامج تجميع مجانية متاحة على الانترنت. من خلال تقييم الشخصية التعبير كاملة من خلية واحدة، يمكن للبرنامج عرض التوقيعات الجينات والعلاقات السكان الخلية. يمثل كل مربع خلية: الأزرق وNKp46 + IL-7Rα - الأحمر هي NKp46 + IL-7Rα + والأخضر وNKp46- IL-7Rα +. كل السكان لديه توقيع جين معين. ضمن NKp46 + IL-7Rα - عدد السكان، وهما التوقيعات يمكن أن ينظر إليه، مما يدل على عدم تجانس السكان.4858 / 54858fig8large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الاشعال | |
| Actb | ايل 23R |
| AES | ايل 2ra |
| AHR | ايل 2RB |
| Bcl2 | II-7RA |
| ج-MYC | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| Cxcr5 | Notch2 |
| Cxcr6 | RORA |
| Eomes | Rorc |
| Ets1 | Runx3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| Gata3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| Hprt | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| ايل 12rb2 | توكس |
| ايل 18r1 | Zbtb16 |
| ايل 1rl1 | Zbtb7b |
| ايل 22 | |
الجدول 1: قائمة التمهيدي.
الجدول 2: برنامج ما قبل التضخيم. يظهر كل خطوة من خطوات برنامج ما قبل التضخيم مع معلومات كاملة عن الوقت ودرجة الحرارة وعدد من الدورات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول كيفية الحصول على معلومات شاملة التعبير الجيني على مستوى نسيلي. هنا، ونحن التحقيق الكبد لجنة القانون الدولي عدم التجانس المقصورة. بعد الفرز وحيدة الخلية من السكان لجنة القانون الدولي مختلف (على أساس علامات سطح مؤتمر العمل الدولي أعرب على نطاق واسع)، وعينات تم قبل تضخيم للجينات محددة مسبقا محددة. ثم، تم تحميل كدنا] والاشعال الحصول على وRT-QPCR رقاقة ميكروفلويديك متعددة. وأخيرا، حصلنا على التعبير من 48 جينات مختلفة من 48 خلايا مفردة. وقد تم تحليل النتائج التعبير الجيني عن طريق البرمجيات عبر الإنترنت للتحقيق علاقات توقيع الجينات والسكان الخلية.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تقييم التعبير الجيني متعددة في وقت واحد. كما أنه يتيح العمل على مستوى نسيلي وعلى السكان نادرة جدا. خلافا لأساليب RT-QPCR التقليدية، وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR له تأثير المتوسط، حيث يتم تقييم التعبير الجيني على مستوى نسيلي. وهكذا، عدم التجانس بين السكان يمكن الكشف عن وتحليلها. وحيدة الخلية RT-QPCR التعبير يسمح العمل على السكان نادر جدا، لأن هناك حاجة إلى خلايا قليلة جدا فقط للحصول على معلومات واسعة على التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، مجموعات مختلفة من الخلايا يمكن اختبارها على نفس اللوحة. هذا يمكن من اكتشاف اختلافات في التوقيع الجيني بين السكان و، مع أدوات البيانات على الانترنت، وتقييم العلاقات السكان الخلية. تقدم هذه التقنية المزايا الأخرى كذلك. وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR له فائدة من التقدم الموائع الدقيقة الأخيرة. أحجام المطلوبة في الدوائر مؤسسة التمويل الدولية لا تتجاوز المستوى نانولتر. وبالتالي، يتم استخدام كميات أقل من المواد الكيميائية، وتقليل التكلفة من التجارب. وأخيرا، يتم تقليل العدد الإجمالي من الخطوات pipetting ل، مما يحد من احتمال وجود أخطاء pipetting ل. والخطوات هي في وقت واحد لجميع الخلايا ويمكن القيام به مع ماصة الأقنية، تمكن من العمل بطريقة سريعة وموفرة للوقت. النتائج التي تم الحصول عليها فيمستوى نسيلي واستنساخه وموثوق بها، ويمكن استخدامها لأداء قوي تحليل البيانات.
وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR لا، ومع ذلك، تقديم بعض القيود. أولا، هذه التقنية تستدعي معدات باهظة الثمن ومحددة، مثل شريحة ميكروفلويديك، وحدة تحكم رقاقة ميكروفلويديك، وthermocycler محددة. خلافا لأساليب RT-QPCR التقليدية، وهذا الأسلوب هو زمنية والموفرة للكاشف، منذ ذلك الحين، مع التقليدي RT-QPCR، هناك حاجة إلى دراسات عديدة للحصول على مقارنات ذات دلالة إحصائية. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم إجراءات الحصول على التعبير الجيني لمدة 48 الجينات. تتوفر 96-96 متعددة RT-QPCR رقائق ميكروفلويديك. ويمكن لهذه الرقائق تقييم التعبير الجيني لمدة 96 الجينات من 96 خلايا في نفس الوقت. خلال فرز الخلايا، وهناك حاجة إلى الحد الأدنى لعدد خلايا البدء، منذ الدقة والنقاء الخلية يجب أن يكون الحد الأقصى. ومع ذلك، حتى مع وجود عدد قليل من الخلايا، فإنه لا يزال من الممكن لفرز لوحيدة الخلية متعدد RT-QPCR إكسب الجينression (الخطوة 3). وأخيرا، وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR هو طريقة حساسة. يجب إجراء اختبارات مختلفة قبل البدء في مثل هذه التجارب. على سبيل المثال، لخصوصية التمهيدي الهدف، ينبغي اختبار التمهيدي للكفاءة والتضخيم، وللمنافسة النسبية للهدف.
يجب إجراء العديد من الخطوات للبروتوكول بحذر. التلاعب في كميات صغيرة جنبا إلى جنب مع عدد كبير من العينات والمقايسات في نفس الوقت تزيد من خطر الأخطاء pipetting ل(الخطوات 1 و 4 و 5 و 6 و 7). وينبغي vortexed جميع الكواشف ويمزج قبل pipetting لمن أجل ضمان حل متجانسة. تبخر خلال مرحلة ما قبل التضخيم (الخطوة 4) ويمكن أيضا أن تؤثر على النتائج النهائية. ينبغي دائما لوحات تكون مختومة بشكل صحيح مع فيلم تغطية مناسبة. فرز استراتيجية يجب أن تكون دقيقة جدا (الخطوة 3) لتجنب الخلايا الميتة أو عدة خلايا في بئر في لوحات. وقد تم تجهيز نظام مراقبة الأصول الميدانية آلات فرز الآن مع وحيدة الخلية فرز دائرة الهجرة والجنسيةبرنامج السابقين التي يمكن أن تسجل أي خلية محددة تم فرزها في كل بئر. وهذه الأداة الجديدة ستكون من مصلحة لتحديد ما إذا كانت مرتبطة التوقيعات الجينات إلى سطح الخلية كثافة علامة. يجب تنظيم العينات وفحص وظائف على رقائق بدقة، وهذا أمر ضروري للتجربة (الخطوات من 1 و 5 و 6). وأخيرا، واختيار الاشعال (الخطوة 1 و 6) هو خطوة حاسمة. يجب تحديد كل التمهيدي بناء على النتائج المذكورة سابقا أو النتائج المتوقعة. وهناك خيار عشوائي من الاشعال في مجموعة من الجينات تقييم يمكن أن يؤثر سلبا على قراءات النهائية من التجربة. وعلاوة على ذلك، الاشعال التي ترتبط علامة على سطح الخلية المستخدمة في الفرز الخلية لا بد من استخدامها والضوابط مع الجينات التدبير المنزلي.
تقييم التعبير الجيني تعدد الإرسال على مستوى نسيلي يقدم توصيف أفضل من الكبد مقصورة غير متجانسة لجنة القانون الدولي من في البحوث السابقة. هذه التقنية، التي قدمتها البرمجيات عبر الإنترنت، ويصف على نحو أدق دفرعية ifferent من مؤتمر العمل الدولي في الكبد في التوازن من الدراسات التي تستخدم علامات سطح الخلية الوحيدة. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن النظر في العلاقات سكان الخلية وبناء شبكات التمايز. تواقيع الجينات، على أساس التعبير الجيني وحيدة الخلية، هي أيضا أدوات هامة لتمييز ملامح سكان الخلية ودراسة الأدوار المحتملة. وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR هو واحد من أفضل التقنيات للتعبير فحص الجينات للحصول على بيانات يمكن الاعتماد عليها. هذه البيانات يمكن التحكم فيها بسهولة مع المعلوماتية الحيوية البرنامج 15. وفيما يتعلق بتقنيات أخرى لدراسة التعبير الجيني، مثل ميكروأرس أو التسلسل RNA، وحيدة الخلية متعدد RT-QPCR تقدم حساسية عالية. وقد وصفت مناهج أخرى لتحليل وحيدة الخلية، ويمكن استخدامها التقنيات مكملة لوحيدة الخلية متعدد RT-QPCR 15 و 16. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية لا يمكن أن يؤديها مع أي مجموعة التمهيدي، allowinز المستخدمين للنظر في توقيع الجينات الشخصية. العديد من التطبيقات الأخرى يمكن استخدامها مع هذه التقنية. على سبيل المثال، التعبير الجيني الوقت طبعا من الخلايا في جميع أنحاء تطوير يمكن القيام به لتقييم وتعديل في المستوى الجزيئي خلال التنمية. ويمكن أيضا آثار المخدرات على خلايا يتم التحقيق مع تخفيف المخدرات لتحديد عتبة الكفاءة المخدرات على التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
