Summary
Ce protocole décrit comment évaluer l'expression d'un large éventail de gènes au niveau clonal. Unicellulaire RT-qPCR produit des résultats très fiables avec une forte sensibilité pour des centaines d'échantillons et les gènes.
Abstract
L'expression des gènes hétérogénéité est une caractéristique intéressante pour enquêter dans les populations lymphoïdes. L'expression des gènes dans ces cellules varie au cours de l'activation cellulaire, le stress, ou la stimulation. L' expression du gène de multiplexage unicellulaire permet l'évaluation simultanée de plusieurs dizaines de gènes 1, 2, 3. Au niveau d'une seule cellule, l' expression des gènes multiplex détermine la population hétérogénéité 4, 5. Il permet la distinction de l'hétérogénéité de la population en déterminant à la fois le mélange probable de stades précurseurs diverses entre les cellules matures et aussi la diversité des réponses cellulaires à des stimuli.
Cellules lymphoïdes innées (CIT) ont récemment été décrit comme une population de effecteurs innées de la réponse immunitaire 6, 7. Dans ce protocole, l'hétérogénéité des cellules de la CIT, ilcompartiment Patic est étudiée au cours de l'homéostasie.
Actuellement, la technique la plus largement utilisée pour évaluer l'expression du gène est RT-qPCR. Cette expression génétique méthode mesure seul gène à la fois. En outre, cette méthode ne permet pas d'estimer l'hétérogénéité de l'expression génique, étant donné que plusieurs cellules sont nécessaires pour un test. Cela conduit à la mesure de l'expression du gène moyen de la population. Lors de l'évaluation grand nombre de gènes, RT-qPCR devient une durée de vie, et la méthode d'échantillonnage consommant reagent-. Par conséquent, les compromis limitent le nombre de gènes ou de populations de cellules qui peuvent être évalués, ce qui augmente le risque de manquer l'image globale.
Ce mémoire décrit multiplex unicellulaire par RT-PCR quantitative peut être utilisée pour surmonter ces limitations. Cette technique a bénéficié de récentes avancées technologiques microfluidique 1, 2. Les réactions qui se produisent dans les puces multiplex RT-qPCR ne sont pas excEED niveau-nanolitre. Par conséquent, l'expression des gènes de cellules isolées, ainsi que l'expression des gènes multiples simultanées peuvent être effectuées dans un reagent-, échantillon-, et d'une manière rentable. Il est possible de tester le gène cellulaire signature hétérogénéité au niveau clonal entre les sous - ensembles de cellules dans une population à différents stades de développement ou dans des conditions différentes de 4, 5. Travailler sur les populations rares avec un grand nombre de conditions au niveau d'une seule cellule est plus une restriction.
Introduction
Au cours des dernières années, les cellules lymphoïdes innées (de ILC) ont été de plus en plus étudié. En dépit de leur manque de récepteurs spécifiques d'un antigène, ils appartiennent à la lignée lymphoïde et représentent des sentinelles importantes pour l'homéostasie tissulaire et une inflammation. CVA sont actuellement classés en trois groupes en fonction de leur expression de combinaisons spécifiques de facteurs de transcription ainsi que sur leur capacité à produire des cytokines 6, 7.
ILC contribuent à de nombreuses situations homéostatiques et physiopathologiques dans divers organes via la production de cytokines spécifiques 8, 9. Pour être en mesure de comprendre le rôle de ces cellules, il est important de déterminer les différentes sous-populations de la CDI par organe et d'identifier leurs relations de développement. En outre, des phénomènes de plasticité entre les différents sous-ensembles ont été liés. En étudiant l'hétérogénéitédes cellules présentes dans un organe, il est possible de délimiter leur stade de maturation et de distinguer leurs fonctions spécifiques.
Pour illustrer la technique de multiplexage à cellule unique RT-qPCR, ILC hépatiques ont été choisis, avec un accent particulier sur leur hétérogénéité au sein du même groupe CIT (type 1 ILC) 10. Tout d'abord, grâce à l'utilisation de la cytométrie de flux, trois populations distinctes de la CDI ont été caractérisées dans le foie. Groupe 1 CIT représente environ 80% des effecteurs innés, tandis que les deux autres populations sont les populations ILC hépatiques rares (moins de 5% des effecteurs innés). Ces populations ont été triés à l'aide largement exprimées marqueurs de surface cellulaire des populations ILC. En conséquence, les populations triées ILC dans le foie semblent largement semblables l'un à l'autre.
Multiplex unique cellule RT-qPCR a émergé comme l' une des meilleures techniques pour enquêter rapidement sur l'hétérogénéité de ces populations 11
Ensuite, en triant toutes les cellules avec un phénotype ILC global, un large aperçu de l'expression multiple gène du foie populations ILC est obtenue, même si elles représentent des populations extrêmement rares. Une puce à base de microfluidique permet l'expérimentation de mêmeune petite quantité de matériau cellulaire. En conséquence, les profils d'expression génétique des populations de cellules rares peuvent être obtenus. Grâce à un logiciel en ligne de signature génétique d'analyse, les grappes de la population cellulaire et les relations cellulaires potentiels peut être étudiée. Par conséquent, les tests fonctionnels peuvent être effectués pour valider les données de classification au niveau in vivo.
Des dizaines d'expressions de gènes pourraient être évalués de manière concomitante sur des centaines ou des cellules plus simples sur la même puce 3, 11, 12. Conception de l'essai est la partie la plus longue et la plus importante de l'expérience. La détermination des gènes pertinents à l'hypothèse à tester est essentielle pour obtenir des résultats pertinents. Deuxièmement, le contrôle interne (tels que des marqueurs de surface connus utilisés pour le tri) et des contrôles spécifiques sont nécessaires. Ceci est crucial pour tester la spécificité amorce d'amplification, l'efficacité de l'amplification, et til absence de concurrence de l'amorce. Par conséquent, en travaillant avec une seule cellule multiplex RT-PCR quantitative est une technique qui fait gagner du temps, car l'expression de multiples gènes d'une cellule est évaluée en même temps.
En utilisant la même puce et la combinaison de réactifs pour toutes les cellules limite les éventuelles erreurs de manipulation et permet la reproductibilité entre les échantillons. Au total, les différents aspects de multiplex à cellule unique RT-qPCR permet la production de résultats très fiables au niveau clonal, avec un grand niveau de sensibilité pour une grande variété d'échantillons et de gènes. Les résultats obtenus offrent des données puissants et robustes pour les tests biostatistiques.
Ceci peut être réalisé en raison de l'aspect microfluidique du procédé, ce qui permet de travailler sur de très petites quantités de matériau et conduit à des résultats exhaustifs. Enfin, en utilisant un logiciel en ligne, il est possible de comparer les populations désirées.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité de sécurité Institut Pasteur en accord avec le ministère français de l'Agriculture et des lignes directrices de l'UE.
1. Préparer une unique cellule Plate Tri 96 puits
- Préparer préamplification mélange dans un tube de 1,5 ml par addition de 5,0 pi de tampon spécifique rétrotranscription, 1,3 ul de faible teneur en acide éthylènediaminetétra-tampon (EDTA) TE (solution à 10 mM de TE, pH 8, et d'une solution 0,1 mM d'EDTA, 0,2 uM filtrée ) et 0,2 ul d'ADN polymerase Taq par puits (figure 1a).
- Sur une plaque à 96 puits, distribuer 6,5 pi de mélange de pré-amplification dans chaque puits (à 48 puits). Cette plaque est la seule cellule plaque de tri de 96 puits.
REMARQUE: L'utilisation d'une pipette électronique est recommandé pour ce protocole. Il permet des mesures de volume précis et reproductibles et un gain de temps.
2. Single cellulaire Dissociation 3. Single-cellule Fluorescence-tri cellulaire activé (FACS) 4. Pré-amplification 5. Préparer une plaque d'échantillon de 96 puits 6. Préparer une plaque de dosage à 96 puits 7. unicellulaire Gene expression Chip 8. Exécutez la puce Analyse 9. Données 
NOTE: Le volume final dans chaque puits de la plaque d'échantillon de 96 puits devrait être de 9 pi.
REMARQUE: Lorsque vous utilisez les marqueurs de cellules de surface ILC largement exprimées, 3 populations sont définies: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + et NKp46 - IL-7Rα +. Toutes les populations triées sont lignée - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
REMARQUE: Différents types de cellules peuvent être triés sur le même 96 puits à cellule unique plaque de tri (Figure 2).
NOTE: Le positionnement correct de chaque cellule sur la plaque de tri de 96 puits à cellule unique est essentielle. Une disposition de la plaque doit être conservée sur un logiciel de tableur. La disposition de la plaque sera utilisée dans les prochaines étapes (figure 1b) 14. Laissez un puits contenant mélange d'essai de 0,2x et de pré-amplification mélange sur la plaque de l'échantillon de 96 puits sans cellules. Ce puits est utilisé comme témoin non-entrée. Laisser deux rangées de 6 puits pour une dilution d'ADNc. Ces puits sont utilisés comme témoins pour l' efficacité primaire (figure 1b). 
Figure 3: programme de pré-amplification. Afin d'obtenir suffisamment de matériel, de pré-amplification de gènes cibles spécifiques sur des cellules individuelles triées est nécessaire. La cellule unique plaque de tri de 96 puits est chargé sur un thermocycleur à suivre le programme de pré-amplification. Les produits de pré-amplification sont ensuite dilués avec du tampon TE faible EDTA et peuvent être utilisées immédiatement ou congelées à -20 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
NOTE: Pour éviter la congélation et la décongélation répétées des amorces, distribuer les amorces pour le mélange de pré-amplification et pour le 96-well plaque d'essai en même temps.
REMARQUE: Aucun liquide ne doit être déversé sur la puce. 
Figure 4: une seule cellule multiplex expression génique puce chargement. Ces étapes nécessitent gprécision reat, en particulier lors du transfert de la plaque de 96 puits au multiplex puce gène d'expression unique cellule. Pour éviter les erreurs de chargement et mauvais placement, il est fortement recommandé de travailler de manière séquentielle. Le volume prélevé pour chaque transfert doit être contrôlée pendant le processus de pipetage. Enfin, il est important d'éviter les bulles et pour les enlever en cas de formation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
NOTE: "Default-10min-Hotstart.pcl" est le programme le plus couramment utilisé pour les multiplex à cellule unique RT-qPCR.
ACt = échantillon Ct - contrôle interne Ct
Pliez Change = 2 - (contrôle ΔCtsample-ΔCtnegative)
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Representative Results
populations lymphoïdes présentent une grande diversité dans l'expression des gènes. Dans ce protocole, le foie compartiment ILC hétérogénéité a été étudiée en utilisant une seule cellule multiplex RT-qPCR expression génique. Contrairement à d'autres techniques d'expression génique, multiplex unicellulaire RT-qPCR expression génique permet de travailler sur plusieurs populations, même les plus rares, dans le même temps. Cette spécificité, associée à une sensibilité élevée au niveau clonal, permet d'enquêter sur les différences dans les signatures de gènes au sein d'une population et entre les populations rares. A titre d'exemple, les signatures génétiques de 3 populations ILC des foies de souris 4 semaines d'âge ont été évalués. Une population est assez fréquent pour être facilement identifiés, alors que les deux autres sont rares (moins de 1% des cellules de la lignée négative) dans le foie.
Une plaque de tri à cellule unique de 96 puits et une plaque essai de 96 puits ont été préparées avant dissectio du foien et de dissociation (figure 1). Chaque mélange a été préparé sous une hotte stérile et distribué avec une pipette électronique pour la précision du volume et de la reproductibilité. Tous les réactifs ont été agités par tourbillonnement avant de pipetage pour maintenir l'homogénéité. Après la préparation, la plaque de tri cellulaire 96 puits peut être congelé jusqu'à ce que le tri cellulaire, et la plaque d'essai de cellules de 96 puits peut être congelé jusqu'à ce que la SFI chargement.
Livers ont été disséqués et dissociés en une seule cellule suspensions. Les cellules ont été colorées et triées sur décongelés plaques de tri monocellulaires à 96 puits. En utilisant FACS, 3 populations de la CDI ont été triés sur la base de marqueurs ILC largement exprimés (figure 2). Après le tri des cellules, on a synthétisé l' ADNc et les gènes cibles spécifiques ont été amplifiés (figure 3 et tableau 2). Après l'étape de pré-amplification, l'ADNc a été dilué dans du tampon TE faible EDTA. Amorces et l' ADNc à partir de cellules simples ont été chargés sur la puce IFC (Figures 4 et 5a). Les résultats obtenus (Figure 7a) ont été simplifiées pour faciliter la lecture et l' analyse (figure 7b). Des exemples de puces correctement ou mal chargées sont indiquées (Figure 5). Un chiffre FAM d'une puce correctement chargée (figure 6) avec des signaux d'amplification différents est représenté.
Les résultats montrent que , après le tri cellulaire approprié, de pré-amplification, et le chargement, la population CIT apparaît hétérogène pour l' expression génique dans le foie des souris de type sauvage adulte (Figure 7). En utilisant un logiciel en ligne, des signatures d'expression de gènes spécifiques des cellules (figures 7 et 8) et les relations de la population des cellules (figure 8) peut être identifiée. Chaque population triée a une signature de gène spécifique enrichi en l'expression génique. Par exemple, les cellules triées comme NKp46 - IL-7Rα + ont eexpression nriched de Rorc, le principal facteur de transcription du groupe 3 ILC; Rora, un Rorc facteur de transcription -homologous; et Il-23r et CXCR6, deux récepteurs importants du groupe 3 marqueurs hépatiques ILC dans le foie. Les mêmes observations peuvent être faites avec NKp46 + IL-7Rα - et les populations NKp46 + IL-7Rα +. Chaque cellule est cochée pour l' expression du gène de ménage (HPRT, Loi et Gapdh) pour exclure les puits non valides; au moins deux gènes de ménage doivent être exprimés de considérer les valeurs comme valide.
Fait intéressant, cette technique permet de définir deux sous - populations de NKp46 + IL-7Rα - sur la base de signatures génétiques. Les différences entre ces deux signatures doivent être validées par d'autres ensembles de différentes expériences fonctionnelles.
![Figure 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Figure 2: Stratégie de cellules FACS. Les images sont représentatives des cellules hépatiques isolées à partir de souris 4 semaines d'âge. (A) FSC-A / SSC-A gating, la discrimination doublet (b) FSC-H / FSC-W, (c, d et e) vivant, lignage négatif CD45.2 + CD4 - CD3 - cellules gating. (F) En utilisant des marqueurs de cellules de surface ILC largement exprimées, nous avons défini 3 populations: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + et NKp46 - IL-7Rα +. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Les chiffres ROX de bien (un) Et mal (b) chargé des puces. (A) une seule cellule puce multiplex gène d'expression correctement chargé devrait apparaître avec des lignes droites et des lignes. Chaque chambre de réaction est rempli et a la même dimension. (B) Improperly chargé multiplex puce gène d'expression unique cellule. Les lignes vides et des rangées de chambres de réaction apparaissent (carré vert), ainsi que les lignes de pliage (carré bleu). Ces caractéristiques peuvent être dues à une mauvaise "PRIME" ou pas "LOAD", ainsi que des bulles résiduelles dans les puits de la SFI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: FAM (fluorescéine amidite) figure d'une puce correctement chargé. Après quelques cycles (en fonction des échantillons et sur l'amorce s évalué), les différences dans la chambre de réaction de luminosité doivent apparaître. chambres de réaction avec un signal d'amplification doivent apparaître plus lumineux (carré bleu) que les chambres de réaction sans ou avec des signaux d'amplification faible (carré vert). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Carte de chaleur obtenue avant (a) et après (b) des modifications. (A) carte de chaleur directe obtenue sans analyse ou la modification de l' ordre test / échantillon. (B) la carte de chaleur modifiée obtenue après l' échantillon et le dosage nom définition. Aucun puits d'entrée (carré bleu) sont obtenus si aucune amplification se produit. amorces inefficientes (carré vert). Test d'ADNc de dilution (carré violet). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: le regroupement de la population mono-cellulaire. Un logiciel d'analyse de données est utilisé pour déterminer la classification entre les populations. logiciel de clustering gratuit sont disponibles en ligne. En évaluant l'ensemble du profil d'expression d'une cellule unique, le logiciel peut afficher les signatures génétiques et les relations de la population des cellules. Chaque carré représente une cellule: bleu sont NKp46 + IL-7Rα -, rouge sont NKp46 + IL-7Rα +, et le vert sont NKp46- IL-7Rα +. Chaque population a une signature génétique spécifique. Dans le NKp46 + IL-7Rα - population, deux signatures peuvent être vus, attestant de l' hétérogénéité de la population.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Amorces | |
| ACTB | Il-23r |
| Aes | Il-2ra |
| Ahr | Il-2RB |
| bcl2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| CBFB | LEF1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | NFIL3 |
| CD49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| CXCR6 | Rora |
| Eomes | Rorc |
| Ets1 | RUNX3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| Gapdh | Tcf3 |
| Gata3 | TCF7 |
| Gm-csf | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| Hprt | Tsc22d3 |
| Id2 | TNFRSF11A |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18R1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| Il-22 | |
Tableau 1: liste Primer.
Tableau 2: programme de pré-amplification. Chaque étape du programme de pré-amplification est montrée avec l'ensemble des informations concernant le temps, la température, et le nombre de cycles.
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Discussion
Ce protocole décrit comment obtenir des informations d'expression génique exhaustive au niveau clonal. Ici, nous avons étudié le foie ILC compartiment hétérogénéité. Après un tri à cellule unique des différentes populations de la CIT (basées sur des marqueurs de surface ILC largement exprimés), les échantillons ont été pré-amplifiées pour les gènes présélectionnés spécifiques. Ensuite, l'ADNc obtenu et des amorces ont été chargées sur une RT-qPCR puce microfluidique multiplex. Enfin, nous avons obtenu l'expression de 48 gènes différents de 48 cellules individuelles. les résultats d'expression des gènes ont été analysés au moyen d'un logiciel en ligne pour rechercher la signature du gène et de la population cellulaire relations.
Le principal avantage de cette technique est la capacité d'évaluer l'expression des gènes multiples simultanément. Il permet également le travail au niveau clonale et sur les populations très rares. Contrairement aux méthodes RT-qPCR classiques, multiplex à cellule unique RT-qPCR n'a pas d'effet de la moyenne, étant donné que l'expression du gène est évalué au niveau clonal. AinsiHétérogénéité au sein d'une population peut être détectée et analysée. Unicellulaire RT-qPCR expression permet de travailler sur des populations très rares, puisque seuls très peu de cellules sont nécessaires pour obtenir l'information large sur l'expression génique. En outre, différentes populations de cellules peuvent être testées sur la même plaque. Cela permet de détecter des différences de signature génétique entre les populations et, avec des outils de données en ligne, l'évaluation des relations de la population cellulaire. Cette technique présente d'autres avantages. multiplex unique cellule RT-qPCR a l'avantage des progrès récents microfluidiques. Les volumes nécessaires dans les chambres de la SFI ne dépassent pas le niveau nanolitre. Ainsi, des quantités plus faibles de réactifs sont utilisés, ce qui réduit le coût des expériences. Enfin, le nombre total d'étapes de pipetage est réduite, limitant ainsi la possibilité d'erreurs de pipetage. Les étapes sont simultanées pour toutes les cellules et peut être fait avec une pipette multicanaux, permettant de travailler de manière rapide et gain de temps. Les résultats obtenus àle niveau clonal sont reproductibles, fiables, et peut être utilisé pour effectuer des analyses de données robustes.
multiplex unique cellule RT-qPCR ne présente cependant certaines limites. Tout d'abord, cette technique nécessite un équipement coûteux et spécifique, par exemple une puce microfluidique, d'un contrôleur de puce microfluidique, et un thermocycleur spécifique. A la différence des procédés classiques de RT-qPCR, cette technique exige beaucoup de temps et d'économie de réactif car, avec les classiques de RT-PCR quantitative, de nombreuses études sont nécessaires pour obtenir des comparaisons statistiquement significatives. Dans ce protocole, nous présentons une procédure pour obtenir l'expression des gènes pour 48 gènes. 96-96 multiplex puces microfluidiques RT-qPCR sont disponibles. Ces puces peuvent évaluer l'expression du gène pour 96 des gènes de 96 cellules en même temps. Au cours de tri cellulaire, un nombre minimum de cellules de départ sont nécessaires, étant donné que la précision et la pureté de la cellule doit être maximale. Cependant, même avec un petit nombre de cellules, il est encore possible de trier pour multiplex à cellule unique RT-qPCR gène expression (étape 3). Enfin, le multiplexage de cellules isolées par RT-PCR quantitative est une méthode sensible. Différents essais doivent être effectués avant de commencer ces expériences. Par exemple, pour la spécificité de cible d'amorces, les amorces doivent être testées pour l'efficacité de l'amplification et pour la compétition par rapport à la cible.
Plusieurs étapes du protocole doivent être effectuées avec prudence. Les manipulations de faibles volumes associés à un grand nombre d'échantillons et de tests en même temps, augmente le risque d'erreurs de pipetage (étapes 1, 4, 5, 6 et 7). Tous les réactifs et les mélanges doivent être vortexés avant l'agitation, afin d'assurer une solution homogène. L'évaporation lors de la pré-amplification (étape 4) peut également influer sur les résultats finaux. Les plaques doivent toujours être correctement scellées avec un film de couverture appropriée. Tri stratégie doit être très précis (étape 3) pour éviter les cellules mortes ou plusieurs cellules dans des puits dans les plaques. FACS machines de tri sont désormais équipés d'ind unicellulaire de triex logiciel qui peut enregistrer quelle cellule spécifique a été classée dans chaque puits. Ce nouvel outil sera d'intérêt pour déterminer si les signatures de gènes sont corrélés à l'intensité des marqueurs de surface cellulaire. positions d'échantillons et d'analyse sur les puces doivent être organisées méticuleusement, car cela est essentiel pour l'expérience (étapes 1, 5 et 6). Enfin, le choix des amorces (étape 1 et 6) est une étape critique. Chaque amorce doit être choisie en fonction des résultats décrits précédemment ou les résultats attendus. Un choix aléatoire d'amorces dans l'ensemble des gènes évalués pourrait nuire à la lecture finale de l'expérience. En outre, des amorces qui sont en corrélation avec le marqueur de surface cellulaire utilisée pour le tri cellulaire doivent être utilisés en tant que témoins des gènes de ménage.
Évaluation de l'expression des gènes multiplex au niveau clonal offre une meilleure caractérisation du foie compartiment hétérogène ILC que dans la recherche précédente. Cette technique fournie par le logiciel en ligne, décrit plus précisément la dsous-ensembles ifférents de l'ILC dans le foie à l'homéostasie que les études en utilisant uniquement des marqueurs de surface cellulaire. En outre, il est possible d'envisager des relations de la population de cellules et de construire des réseaux de différenciation. Les signatures de gènes, basé sur l'expression des gènes de cellules uniques, sont également des outils importants pour discerner les caractéristiques de la population des cellules et d'examiner les rôles potentiels. multiplexe unicellulaire RT-qPCR est l'une des meilleures techniques pour l'expression d'une analyse de gène pour obtenir des données fiables. Ces données sont faciles à gérer avec le logiciel de bioinformatique 15. En ce qui concerne d'autres techniques pour les études d'expression de gènes, tels que les puces à ADN ou des séquences d'ARN, multiplexe unicellulaire RT-qPCR offre une sensibilité élevée. D' autres approches de l' analyse unicellulaire ont été décrites et peuvent être utilisés comme techniques complémentaires pour multiplex à cellule unique RT-qPCR 15, 16. En outre, la technique peut être réalisée par une combinaison quelconque d'amorces, allowinutilisateurs g à regarder les signatures de gènes personnalisés. De nombreuses autres applications peuvent être utilisés avec cette technique. Par exemple, le décours temporel de l'expression des gènes des cellules au cours du développement peut être effectué pour évaluer la modification du profil moléculaire au cours du développement. Les effets des médicaments sur les cellules peuvent également être étudiés avec dilution de médicament pour déterminer le seuil de l'efficacité des médicaments sur l'expression génique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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