Abstract
면역 반응의 자극 효과와 면역 메커니즘을 조사하기 무척추 동물 연구에서 일반적인 도구입니다. 입자는 면역 시스템에 의해 감지되고 면역 이펙터의 생산을 유도하므로 본 자극, 곤충에 비병원성 입자의 주사에 기초한다. 우리는 모기 아노 펠 레스 gambiae에서 melanization 반응의 자극에 여기에 초점을 맞추고있다. 멜라닌의 어두운 층 이물질과 기생충의 캡슐화의 melanization 응답 결과. 이 반응을 자극하기 위해, 모기 유리 마이크로 모세관 튜브를 사용 흉강 구슬로 접종된다. 그 후, 24 시간 후, 모기 비드를 검색하는 해부된다. 비드 melanization의 정도는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 비즈의 병원성 기생충 효과가 없거나 능력이 회피 또는 면역 반응을 억제. 이러한 주사 measu하는 방법면역 효능 및 생산력이나 장수 등의 생활사 특성에 면역 자극의 영향을 다시. 정확히 직접 호스트 기생충 상호 작용을 연구와 같은 것은 아니지만 면역 및 생태 진화 연구 흥미로운 도구이다.
Introduction
자신의 표피 또는 중장 상피 (4)를 통해 위반 3 - 곤충 기생충과 병원균 일에 대해 자신을 보호하는 면역 반응에 의존한다. 모기, 이러한 반응은 박테리아 5, 바이러스 6, filarial 선충 (7), 말라리아 기생충 1,8,9에 대한 효율적입니다. 12 - 모기에서 중요한 면역 반응 멜라닌 10 이물질이 밀봉된다. (12) -이 캡슐은 중장 또는 시스템 (10)을 순환 체액에 발생할 수 있습니다. 이 melanization 응답 친 phenoloxidase 결과 10 캐스케이드 - (12), 그리고 기생충의 사망 또는 식세포 작용을 초래할 수있다. 혈구 세포의 수를 제한 성인 모기에 melanization은 말라리아 기생충 또는 filarial 선충 7에 대해 같은 체액 성 반응이다.다른 곤충에서는 직접 7 melanize하는 기생충의 주위에 모이는 혈구 세포입니다. 또한, 멜라닌은 계란 생산 및 표피의 상처는 7 치유와 같은 여러 가지 다른 생리 학적 과정에 필수적이다.
18 - 면역 반응의 자극은 여러 농업과 공중 보건 모델 시스템 (13)에 곤충 내성을 연구하는 도구로 사용된다. 16, 19 -이 호스트 기생충 상호 작용 (14)를 공부 아노 펠 레스의 gambiae 모기, 아프리카에서 말라리아의 주요 벡터를 사용한다. 이러한 기술들은 패턴 인식 수용체 (PRR) 2 기생충을 검출하는 곤충의 용량에 기초한다. 모기는 또한 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 그들의 생물학을 방해하는 다른 분자를 검출하거나, 콜라겐과 핵산의 출시로 인해 자신의 손상된 세포를 검출 할 수있다. 모기 면역 세포23 - 등의 혈구 세포 등의 검출 (20)에 사용됩니다. 주요 면역 신호 전달 경로는 IMD, 수신자, JAK / STAT (24)과 리보 핵산 간섭 (RNAi의) 25, 26. 유료 및 IMD 경로 모두 melanization 응답에 영향을 미치는와 프로 phenoloxidase와 상호 작용하는 10 계단식 - 12.
melanization 반응을 촉진하는 데 사용되는 표준 도구 흉강의 체액에 작은 비드 모기 접종이다. 멜라닌 캡슐화도는 모기의 절개를 통해 검색 한 후 비드 (19)를 측정 할 수있다. 대부분의 연구에서, 하나의 비드 모기 15,16,27 당 주입하지만, 더 비드를 주입하면 melanization 응답 (19)의 한계를 연구하기 위해 가능하다. 이러한 비드 모기 생리 방해를 제한하기 위해 주입 용액 (생리적 혈청)를 사용하여 주입되고모기 15,16,27의 탈수. 염료는 비드 선택을 쉽게하기 위해이 용액에 첨가된다. 이 비드 15,16,27을 검색하는 데 사용되는 박리 액에 대해 동일하다.
비병원성 자극 곤충 접종의 장점은 면역 반응에 대한 직접적인 효과에 집중하는 능력이다. 31, 또는 면역 회피 - 31 - 34 인해 기생충 병원성 (28), 면역 억제 (29)을 더 복잡하게 효과가 없습니다. 또한, 이러한 수명이나 생식력과 같은 다른 생활 역사 특성,에 자극의 결과도 연구 할 수있다. 따라서, 진화 생태학을 공부하는 연구자들은 이러한 도구 2,35,36이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 면역 도전 땅벌은 기아에서 단축 된 수명을 가지고있다. 면역 자극 및 배포 유사 부정적인 영향은 종종 짧은 결과, 다른 무척추 동물 모델에서 관찰되었다어 수명 이하 생식 성공 13,27,37. 이러한 연구는 다양한 환경 2,4,38에서 수행 될 수있다. 면역을 자극하면 면역 병리 (39, 40)에 직접 초점을 맞추고 그 관심이다.
이 프로토콜은 melanization 반응을 자극하고 직접 멜라닌의 양을 측정하는 모기 비드의 접종에 기초한다. 이것은 다른 실험 설정에서 melanization 응답의 양적 및 질적 연구를 할 수 있습니다. 이러한 도구는 예하는 항균 응답 등의 다른 면역 반응의 자극을 연장 할 수있는 박테리아 (41)를 가열 킬드. 또한 많은 생태 설정에서 수행 될 수있다.
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Protocol
사출 및 해부 1. 생리 식염수
- pH는 6.8에서 1.3 밀리미터의 NaCl, 0.5 mM의 KCl을, 0.2 mM의 CaCl2를 얻기를 증류수에 염화나트륨, KCl을하고, CaCl2를 첨가하여 염 용액을 제조 하였다.
- 투명 구슬 색으로 식염수 99 ㎖의 0.1 % 메틸 그린 용액 1 ㎖를 추가한다. 이는 0.001 % 메틸 그린 "주사액"이다.
- 이어서, 생리 식염수 45 ㎖의 0.1 % 메틸 그린 용액 5 mL를 추가한다. 이 0.01 % 메틸 그린 "해부 솔루션은"해부 동안 구슬의 착색과 관찰을 용이하게하기 위해 10 배 더 집중 메틸 녹색이다.
주 : 필요한 경우, 필터 버퍼 살균.
2. 모세관 준비
- 열 풀 마이크로 캐 필러 유리 튜브는 작은 구슬 (φ = 40 μm의) (42)보다 약간 더 큰 아주 좋은 팁을 얻을 수있다.
- 열기와핀셋 팁을 파괴하거나 팁을 절단하여 각 모세관을 djust.
3. 모기 양육
- 26 ± 1 ° C에서 후면 A.의 gambiae, 70 ± 5 %의 상대 습도 및 12시 12분 시간 등 : 어두운주기. 성인 여성을 유지하고 그들에게 10 % 설탕 용액에 액세스 할 수 있습니다.
모세관 4. 비드 선택
- 5cm의 페트리 접시에 음전하 구슬 (직경 40 ~ 120 μm의)의 0.009 g을 붓고 미리 주사액 30 분 5 ㎖를 추가합니다.
주 : 목표 염료 쉽게 주입 비드 선택을 위해 비드를 색칠하게한다. 그들은 무균 항아리에 오지 않는 경우 구슬을 압력솥. - 모세관 피펫 벌브에 장착 된 모세관을 사용하여 시각적으로 쌍안 현미경 식염수 용액 0.1 μL의 작은 비드를 선택한다.
참고 : 동시에 여러 구슬을 접종하면, 0.1 μL의 총 볼륨에서 세 개의 구슬을 선택합니다.
5. 모기 취급 및 예방 접종
- 곤충 흡입기를 사용하여, 50 ML 튜브 각 모기를 놓습니다.
- 분쇄 된 얼음 (2-5 분)에 튜브를 배치하여 간단히 각 모기를 진정.
- 양안 현미경으로 우측으로 모기를 놓습니다.
- 실체 현미경 하에서 단단히 흉강 표피의 좌측을 관통하고 액체와 비드 주입 모세관과 모기 접종.
참고 : 가능한 한 모기에 같이 수직으로 모세관을 잡고 비행 근육이 손상되지 않도록주의하십시오. - 모세관을 제거합니다.
- 페더급 곤충학의 집게를 사용하여, 개별적으로 모기 그물로 덮여 180 ml의 플라스틱 컵에 각각의 여성을 배치; 그들에게 10 % 설탕 용액에 액세스 할 수 있습니다.
참고 : 모기가 설탕 용액 상품에 붙어받을 수 있으므로주의, 설탕 솔루션이 필요합니다.
6. 모기해부 및 구슬 사진
- 모기가 24 시간 접종 후 살아 있는지 확인합니다. 그렇다면, 자신의 상태를 확인하고 비행 할 수 있습니다 만 모기를 유지합니다.
- -20 ° C에서 이러한 모기를 고정.
참고 : 필요한 경우 그들은 해부하기 전에 달에 며칠을 유지할 수있다. - 32X 배율 쌍안 현미경 핀셋을 사용하여 모기 날개를 제거합니다. 투명 테이프와 유리 슬라이드에 날개를 고정합니다. 각 개별 모기에 사용되는 코드를 기록합니다.
- 스캐너에서 유리 슬라이드를 넣고 1,200 dpi로를 검사합니다.
참고 : 코드는 각 개별 모기에 대한 읽을 수 있는지 확인합니다. - 유리 현미경 슬라이드와 해부 용액에, 머리와 복부에서 흉부를 분리하는 집게를 사용합니다.
- 구슬을 검색하기 위해 집게와 흉부를 엽니 다.
주 : 비즈 복부로 이동하지 않는, 서로 접촉하지 않으며 대부분은 t 자유롭게 떠그는 체액. 비 흑화 구슬을 찾기 힘들 수 있으므로, 포셉으로 구슬을 깰하지 않도록주의하십시오. 비즈 색상을 얻기 위해 1 ~ 5 분 동안 기다립니다. - 사진을 촬영하기 전에, 유리 현미경 슬라이드에 해부 솔루션의 방울에 구슬을 전송합니다.
참고 : 구슬을 세척 할 필요가 없습니다. - 카메라가 장착 된 현미경을 사용하여, 표준 조명 세팅 및 400X 배율로 각 입자의 디지털 이미지를 촬영.
참고 : 자신의 비교를 가능하게하기 위해 다른 사진 사이의 조명을 변경하지 마십시오.
7. 사진 분석 : 구슬 Melanization
- 이미지 분석 소프트웨어를 엽니 다. "파일"을 클릭 한 후 "열기"에 구슬 이미지를 찾을 수 있습니다.
- 를 클릭 "분석 할 수 있습니다." 를 클릭 "설정 측정." 은 "세트 측정"창에서 "회색 값을 의미한다"상자을 선택합니다.
- 원형 선택 도구 아이콘을 클릭합니다. 비드 둘레를 선택; 유지비드를 좌우하고 주변의 빛나는 후광을 피하십시오.
- 은 "분석"메뉴를 클릭합니다. 를 클릭 "측정." 비드의 단면적의 평균 그레이 값과 크기를 얻었다.
- "- 그레이 평균값 256."각 비드 melanization 값을 얻기 위해, 계산기 또는 계산 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 동작을 수행 melanization 측정 값 0은 완전히 흰색 이미지로 나타내는 0 ~ 256 사이의 값이다.
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Representative Results
일부 비드보다 작은 다른 멜라닌 (도 1)으로 피복 된 모기로 동일한 방식으로 비드 melanize 모든 않았다. 실제로, 일부 구슬 (그림 1) 다른 사람이 완전히 어두운했다 반면 때문에 melanization의 부족으로 푸른 남아 있었다. melanization 값 (파란색과 unmelanized 비드에 해당) 0-100 (어둡고 무겁게 흑화 비드에 상당) (도 2A 및 2B) 사이의 값을 선형 보간법에 의해 표준화되었다. 이 값들은, 따라서 비드 melanization 정도 및 면역 반응의 강도를 나타낸다.
우리는 melanization 값을 비교하여 서로 비드를 비교할 수있다. melanization 반응은 일반적 ANOVA 또는 가우시안 GLM 같은 고전 통계적 분석을 가능하게하는 가우스 분포를 따른다.
"fo를하면 : 킵 together.within 페이지를 ="1 "> 우리는 동시에 모기 식균 비드의 수에 대하여 melanization 반응의 변화를 조사 목표는 가변성의 범위의 더 나은 이해를 얻을 수 있었다. melanization 응답. 비드의 크기는 영향을주지 않았다.비드의 수 (F의 igure 2)를 접종하여 증가하면 평균 비드 melanization 값 (50) (71)로부터 감소되었다. 면역 과제는 증가하는 모기의 melanization 응답의 몇 가지 한계가있다. 또한, melanization 응답은 각각 1 내지 3 개의 비드 (35) (71)로부터 각 모기 최소 흑화 비드 감소 하였다. 그러나, 가장 강하게 흑화 비드 melanization 값에 대한 상수 머물렀다. melanization의 변화는 구슬의 수를 증가. melanization 노력 주어진 모기 모든 비드 사이에 균일하지 않았다하나의 구슬은 다른 것보다 우선 순위가되었을 때. 이 주입 기술은 모기에 면역 반응의 변화를 연구하는 데 유용합니다.
도 1 : 비 흑화 그림의 예는 부분적 흑화 및 높은 흑화 비드 절개 후. 좌측, 중간, 우측에 각각 비 흑화 비드 부분 흑화 비드 및 높은 흑화 비드이다.
도 2 : 접종 비드의 개수의 함수로서 비드 melanization. (가) 각 지점 (주로 흑화들에 대한 100 비 흑화 구슬 0에 이르기까지 melanization 값이) 하나의 구슬 및 포인트의 각 열의 melanization을 보여줍니다 개별 모기를 나타냅니다. 각 mosquito는 한 개, 두 개 또는 세 개의 구슬을 접종 하였다. 고체 포인트는 교차 지점 melanization 중간 값을 나타내는 모기 당 최고 melanization 값을 나타내고, 빈 점 melanization 낮은 값을 나타낸다. 실선은 평균 melanization 당 비드 처리를 나타내고, 점선은 가장 melanization의 평균을 표시하고, 점선은 최저 melanization의 평균을 나타낸다. (나) 평균과 melanization, 가장 높은 melanization 및 비드 접종 처리 당 가장 낮은 melanization의 표준 오류입니다. 검정은 (주로 흑화 사람에게 100 비 흑화 비드 0에서부터 melanization 값)와 비드의 개수의 함수로서 평균 비드 melanization를 나타낸다. 빨간 점은 가장 높은 melanization의 평균을 나타냅니다. 파란색 삼각형은 가장 낮은 melanization의 평균을 나타냅니다. 막대는 표준 오차이다. 참조 19에서 수정. </ P>
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Discussion
이 주입 기술은 자극하고 모기에 melanization 응답을 연구하는 데 유용합니다. 예를 들어, 우리가 면역 자극 부하의 효과를 연구 하였다.
이 절차의 중요한 단계가 제대로 모기을 접종하는 것입니다. 비행 근육 또는 모기 자체에 과도한 손상 공급에서 모기를 방지하거나 절개 전에 죽일 수 있습니다. 두 번째 중요한 단계 그들을 죽이지 않고 그들을 제압 할만큼 오래 얼음에 모기를 유지하는 것입니다. 작은 용기는 용이하고 얼음과 가까이 접촉 가능 같은 과정을 빠르게한다. 핀셋 그렇지 않으면 구슬을 깰 수 있습니다 마지막으로, 특별한주의가 해부하는 동안 필요합니다. 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다 모기 조직에 포함 된 구슬은 해부 솔루션에 의해 착색된다.
그들은 해요로 (같은 중립적, 긍정적으로 또는 부정적으로 충전 구슬, 유리 구슬), 다른 결과로 이어질 것입니다 구슬의 여러 종류를 사용하여바깥 모두 같은 정도 27,43에 흑화 할 수 없습니다. 사실, 중성 청구 구슬에 비해 음으로 대전 비즈 모기 (27) 사이의 melanization 응답에 더 많은 변화로 이어집니다. 유리 구슬, 다른 한편으로는, 모기 불활성 모든 27에서 melanization 반응을 유발하지 않는다. 음전하를 띤 구슬 따라서 바람직 할 수 있지만, 다른 비드 사이의 비교는 또한 관련 될 수있다. 그러나, 비드의 종류에 따라 다른 염료가 주입 박리 용액에 요구 될 수있다; 유리 비드 (27)를 사용하는 경우, 예를 들어, 크레 실 바이올렛 염료 대신 메틸 녹색 사용되어야한다.
이 주입 기술은 모기에 대한 침략이다. 손상 및 손상을 최소화하고 제어 할 수있다하더라도, 다른 도구는 실험 디자인에 따라 더 나은 선택 일 수있다. 동일한 모기 여러 면역 반응을 자극하고 동시에 측정하는 것이 곤란하다. 작업면역 반응 (28) 사이의 상관 관계를 볼 때 가족 또는 모기의 그룹에 보내고이 필요합니다. 게다가, 구슬은 곤충의 기생충의 실제 존재에 부분적으로 유사하다.
우선, 면역 반응을 자극하고 생성 된 표현형 반응 밀봉을 측정되지만 것 사이에서 발생하는 것은 알려져 있지 않다. 생리 학적 또는 분자 도구 (10)와 주사 커플 링 - (12)은이 melanization 응답에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 12 - melanization 반응의 기전을 연구하기 위해, 키 효소 또는 프로 phenoloxidase 캐스케이드 중에 생성 분자의 발현은 열을 측정 할 수있다. 그러나, 최종 캡슐화의 실제 결과를 모른 채, 위쪽 또는 아래쪽 규제 등의 분자에만 초점의 melanization 과정의 부정확 한 평가로 이어질 수있다. 따라서, 공부 ENCApsulation 함께 분자 메커니즘은 별도로 사용할 때마다 올바른 과학 기술되어 있다는 사실에도 불구하고, 매우 유익 할 것이다.
결론적으로,이 면역과 면역의 진화를 연구하는 기술이다. 말라리아 기생충 살충제 내성 모기 감수성 간의 링크에 대한 증거가 증가하고, 예를 들어있다. 이 주입 기술은 현장 시험뿐만 아니라, 그러한 환경에서 사용될 수있다. 두 번째 작업 방향은 자세히 면역 경로를 연구하기 위해 유전자 knockdowns와 면역 자극을 결합하는 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
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