Abstract
Stimulering av immunsvar är ett gemensamt verktyg i ryggradslösa studier för att undersöka effekt och mekanismerna för immunitet. Denna stimulering är baserad på injektionen av icke-patogena partiklar in insekter, eftersom partiklarna kommer att detekteras av immunsystemet och kommer att inducera produktionen av immuneffektorer. Vi fokuserar här på stimulering av melanin svar i mygga Anopheles gambiae. De melanin respons resulterar i inkapsling av främmande partiklar och parasiter med en mörk lager av melanin. För att stimulera detta svar är myggor ympades med pärlor i brösthålan med hjälp microcapillary glasrör. Sedan, efter 24 h, är myggor dissekeras för att hämta pärlorna. Graden av melanin av pärlan mäts med hjälp av bildanalysmjukvara. Pärlor inte har patogena effekterna av parasiter, eller deras förmåga att undvika eller undertrycka immunsvaret. Dessa injektioner är ett sätt att measure immun effektivitet och effekterna av immun stimuleringar på andra livshistoriekaraktärer, såsom fruktsamhet eller livslängd. Det är inte exakt samma som direkt studera värd-parasit interaktioner, men det är ett intressant verktyg för att studera immunitet och evolutionär ekologi.
Introduction
Insekter är beroende av immunsvar för att skydda sig mot parasiter och patogener 1 - 3 som bryter igenom deras nagelband eller deras midgut epitel 4. I myggor, dessa svar är effektiva mot bakterier 5, virus 6, filarial nematoder 7, och malariaparasiter 1,8,9. I myggor, är en viktig immunsvar inkapsling av främmande partiklar med melanin 10-12. Denna inkapsling kan hända i midgut eller i hemolymfa cirkulationssystemet 10-12. Denna melanin svar är ett resultat av den pro-fenoloxidas kaskad 10-12, och det kan leda till döden för parasiterna eller till deras fagocytos. Hos vuxna myggor, där antalet hemocyter celler är begränsad, är melanin ett humoralt svar, som mot Plasmodium parasiter eller filarial nematoder 7.I vissa andra insekter, är det direkt de hemocyter celler som samlas kring parasiten att melanize dem 7. Dessutom är melanin också viktigt för flera andra fysiologisk process som äggproduktion och nagelband sår läker 7.
Stimulering av immunsvar används som ett verktyg för att studera insekts immunitet i flera jordbruks- och folkhälsomodellsystem 13 - 18. Det används i Anopheles gambiae myggor, huvud vektor av malaria i Afrika, för att studera värd-parasit interaktioner 14 - 16,19. Dessa tekniker är baserade på förmågan hos insekter för att upptäcka parasiter med sina mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) 2. Myggor kan också upptäcka andra molekyler som stör deras biologi såsom patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), eller upptäcka sina egna skadade celler på grund av frisättning av kollagen och nukleinsyror. Mygga immuncellers såsom de hemocyter används för detektion 20-23. De viktigaste immunsignalvägar är IMD Toll, JAK / STAT 24, och ribonukleinsyra interferens (RNAi) 25,26. Både Toll och IMD vägar påverkar melanin respons och interagera med pro-fenol kaskad 10-12.
Standardverktyget används för att stimulera melanin är ett inokulering av en mygga med en liten vulst i den hemolymfa av brösthålan. Graden av melanin inkapsling kan sedan mätas 19 efter att ha skaffat vulsten genom dissekering av mygga. I de flesta studier var bara en pärla injiceras per mygga 15,16,27, men injicera pärlor är möjligt för att studera gränserna för melanin svaret 19. Dessa pärlor injiceras med en injektionslösning (fysiologiskt serum) för att begränsa störning av mygga fysiologi ochuttorkningen av mygga 15,16,27. Ett färgämne sätts till denna lösning för att underlätta bead selektion. Det är samma för dissekering lösning som används för att hämta pärlan 15,16,27.
Fördelen med att ympa insekter med icke-patogena stimuli är förmågan att fokusera på den direkta effekten på immunsvaret. Det finns inga komplicerande effekter på grund av parasiten patogenicitet 28, immunosuppression 29-31, eller immun skatteflykt 31-34. Dessutom konsekvenserna av stimuli på andra livshistoriekaraktärer, såsom livslängd eller fruktsamhet, kan också studeras. Således kan forskare studera evolutionär ekologi kräver sådana verktyg 2,35,36. Till exempel, immun utmanade humlor har en förkortad livslängd i svält. Liknande negativa effekter av immun stimuli och installationer har observerats i olika ryggradslösa modeller, vilket ofta resulterar i en korter livslängd eller mindre reproduktiva framgång 13,27,37. Sådana studier kan utföras i varierande miljöer 2,4,38. Att stimulera immunitet är också av intresse för dem att fokusera direkt på immunpatologi 39,40.
Detta protokoll är baserad på ympning av pärlor med myggor för att stimulera melanin respons och direkt mäter mängden melanin. Detta möjliggör kvantitativ och kvalitativ studie av melanin respons i olika experimentella inställningar. Ett sådant verktyg kan utökas till stimuleringen av andra immunsvar, såsom antibakteriella svaret på värmedödade bakterier 41. Det kan också utföras i många ekologiska inställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. saltlösning för injektion och Dissection
- Förbereda saltlösningen genom tillsats av NaCl, KCl och CaCl 2 till destillerat vatten för att erhålla 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl och 0,2 mM CaCl2 vid pH = 6,8.
- Tillsätt 1 ml 0,1% metylgrönt lösning till 99 ml av saltlösningen för att färga de genomskinliga pärlor. Detta är den 0,001% metylgrönt "injektionslösning".
- Sedan, tillsätt 5 ml 0,1% metylgrönt lösningen till 45 ml av saltlösningen. Detta 0,01% metylgrönt "dissektion lösning" är 10 gånger mer koncentrerad i metylgrönt för att underlätta färgning av pärlorna och deras observation under dissekering.
NOTERA: Filtersterilisera bufferten om nödvändigt.
2. Kapillär Framställning
- Värme-pull mikrokapillär glasrör att erhålla en mycket fin spets något större än de minsta pärlor (φ = 40 ^ m) 42.
- Öppna ochJ USTERA varje kapillär genom att bryta spetsen med pincett eller genom att såga av spetsen.
3. Mosquito Uppfödning
- Bakre A. gambiae vid 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relativ fuktighet och en 12:12 timmar ljus: mörker-cykel. Håll vuxna kvinnor och ge dem tillgång till en sockerlösning 10%.
4. Bead val med Kapillär
- Pour 0,009 g av negativt laddade kulor (40-120 | im i diameter) i en 5 cm petriskål och tillsätt 5 ml injektionslösning 30 min i förväg.
OBS: Målet är att låta färgämnet färga pärlor att göra pärla val för injektion lättare. Autoklavera pärlorna om de inte kommer i en steril burk. - Med användning av en kapillär monterad i en kapillärpipett glödlampa, visuellt väljer den minsta pärlan i 0,1 | il av saltlösningen under ett binokulärt mikroskop.
OBS: När ympning flera pärlor samtidigt väljer tre pärlor från en total volym av 0,1 pl.
5. Mosquito Hantering och Ympning
- Med hjälp av ett insekts aspirator, placera varje mygga i en 50 ml tub.
- Chill varje mygga kortfattat genom att placera röret i krossad is (2-5 min).
- Placera en mygga på sin högra sida under binokulärt mikroskop.
- Under ett stereomikroskop, ympa mygga med kapillären med fast piercing genom den vänstra sidan av brösthålan nagelband och sedan injicering av vätskan och vulsten.
OBS: Se till att inte skada flygmuskler genom att hålla kapillär som vinkelrätt mot mygga som möjligt. - Ta bort kapillär.
- Använda fjäderlätta entomologi pincett, placera varje hona individuellt i en 180 ml plastbägare täckt med myggnät; ge dem tillgång till en sockerlösning 10%.
OBS: Försiktighet krävs med sockerlösningen, som mygga kan fastna på socker lösning droppar.
6. MosquitoDissection och Bead fotografier
- Kontrollera om myggor lever 24 timmar efter ympning. Om så är fallet, kontrollera deras tillstånd och hålla endast de myggor som kan flyga.
- Frysa dessa myggor vid -20 ° C.
OBS: De kan hållas flera dagar till månader före dissekering, om det behövs. - Ta bort myggor vingar med hjälp av pincett under ett binokulärt mikroskop vid 32X förstoring. Fäst vingarna på objektglas med genomskinlig tejp. Skriv ner den kod som används för varje enskild mygga.
- Sätt glas i en skanner och skanna dem på 1200 dpi.
OBS: Kontrollera att koden är läsbar för varje individuell mygga. - På en glasmikroskopskiva och dissektion lösning, använder pincett för att separera bröstkorgen från huvudet och magen.
- Öppna bröstkorgen med pincett för att hämta pärlorna.
OBS: Pärlor som inte flyttar till buken, inte är i kontakt med varandra och de flesta av dem flyta fritt i than hemolymfa. Var noga med att inte bryta pärla med pincett, som en icke-melanized pärla kan vara svårt att hitta. Vänta i 1 till 5 min för pärlor för att erhålla färgen. - Överför pärlorna i en droppe av dissektion lösningen på en glasmikroskopskiva, innan du tar bilden.
OBS: Inget behov av att tvätta pärlorna. - Med hjälp av ett mikroskop utrustat med en kamera, ta en digital bild av varje kula i en standardbelysningsinställning och 400X förstoring.
OBS: Ändra inte belysningen mellan de olika bilderna för att möjliggöra deras jämförelse.
7. Bild Analys: Bead melanin
- Öppna bildanalysmjukvara. Klicka på "File" och sedan på "öppna" för att hitta en pärla bild.
- Klicka på "analysera". Klicka på "som mått." Markera "betyder grå värde" rutan i "Set mätningar" fönstret.
- Klicka på ikonen cirkelmarkeringsverktyget. Välj pärla omkrets; stanna kvar isida pärlan och undvika ljus gloria runt det.
- Klicka på menyn "analysera". Klicka på "åtgärd." Erhålla medelvärdet gråvärdet och storlek på tvärsnittsarean hos vulsten.
- För att erhålla melaninvärdet för varje pärla, utföra följande operation med hjälp av en miniräknare eller miniräknare programvara: "256 - menar grå värde." Den melanin åtgärden är ett värde mellan 0 och 256, där 0 representerar en helt vit bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myggor inte alla melanize pärlorna på samma sätt, som en del pärlor mindre täckta med melanin än andra (Figur 1). I själva verket förblev några pärlor blå på grund av en brist på melanin, medan andra var helt mörkt (Figur 1). Den melaninvärdet standardiserades genom linjär interpolering till ett värde mellan 0 (vilket motsvarade en blå och unmelanized bead) och 100 (motsvarande en mörk och kraftigt melanized bead) (Figur 2a och 2b). Dessa värden anger graden av melanin av pärlorna och sålunda styrkan i immunsvaret.
Vi kan jämföra pärlor till varandra genom att jämföra deras melanin värden. Den melanin svar följer i allmänhet en Gauss-fördelning, som gör det möjligt för klassiska statistiska analyser som ANOVA eller Gauss GLM.
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Vi studerade variationen av melanin svar med avseende på antalet kulor samtidigt ympats i en mygga Målet var att få en bättre förståelse för variationen och begränsningar. den melanin svar. storleken på pärlan inte har någon effekt.Det genomsnittliga vulsten melanin värde minskade från 71 till 50, när antalet kulor inokulerade ökade (F igure 2). Det finns vissa begränsningar för melanin svar i en mygga när immun utmaningen ökar. Dessutom minskade melanin svar för de minst melanized pärla i varje mygga, 71-35 för en till tre kulor, respektive. Men det melanin värdet på starkast melanized pärla stannade ungefär konstant. Variabiliteten av melanin ökade med antalet pärlor. Den melanin insats var inte enhetlig bland alla pärlor i en given mygga,som en pärla prioriterades framför andra. Denna injiceringsteknik är användbar för att studera variabiliteten av immunsvar i myggor.
Figur 1: Bild exempel på en icke-melanized, en delvis melanized och en mycket melanized pärla efter dissekering. På vänster, mitten och till höger är en icke-melanized pärla, en delvis melanized pärla, och en mycket melanized pärla, respektive.
Figur 2: Bead melanin som en funktion av antalet inokulerade pärlor. (A) Varje punkt visar melanin av en enda kula (med melanin värden som sträcker sig från 0 för icke-melanized pärlor till 100 för kraftigt melanized sådana) och varje kolumn av punkter representerar en enskild mygga. varje mosquito ympades med en, två, eller tre kulor. De fasta punkter representerar den högsta melaninvärdet per mygga, de korsade punkter representerar mellanmelanin värde, och de tomma punkter representerar lägsta melanin värde. De heldragna linjerna representerar medelvärdet melanin per pärla behandling, de streckade linjerna visar medelvärdet av de högsta melanin, och de streckade linjerna indikerar medelvärdet av det lägsta melanin. (B) Medelvärde och standardfel av melanin, den högsta melanin och lägsta melanin per pärla ympning behandling. Den svarta representerar medelvärdet vulsten melanin som en funktion av antalet strängar (med melanin värden som sträcker sig från 0 för icke-melanized pärlor till 100 för tungt melanized sådana). Den röda punkt representerar medelvärdet av högsta melanin. Den blå triangeln representerar medelvärdet av de lägsta melanin. Staplarna är standardfelen. Modifierad från referens 19. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna injektionstekniken är användbar för att stimulera och studera melanin svaret i myggor. Till exempel, här studerade vi effekten av immunstimuli belastning.
Det kritiska steget i detta förfarande är att korrekt ympa mygga. Alla svåra skador på flygmuskler eller mygga själv kan förhindra mygga från utfodring eller kan döda den före dissekering. En andra nyckelsteg är att hålla myggor på is tillräckligt länge för att slå ut dem utan att döda dem. En liten behållare kommer att underlätta och påskynda processen, eftersom det möjliggör närmare kontakt med isen. Slutligen behövs särskild omsorg under dissekering, som pincett annars kan bryta pärlorna. Pärlor inbäddade i mygga vävnad kan ta längre tid att färgas av dissektion lösning.
Använda flera typer av pärlor (som neutralt, positivt eller negativt laddade pärlor eller glaspärlor) kommer att leda till olika resultat, eftersom de may inte alla vara melanized i samma grad 27,43. I själva verket, jämfört med neutralt laddade pärlor, negativt laddade pärlor leder till mer variation i melanin svar mellan myggor 27. Glaspärlor, å andra sidan, är inerta i myggor och inte utlösa melanin svar alls 27. Negativt laddade pärlorna kan således vara att föredra, men jämförelser mellan olika pärlor kan också vara relevant. Dock beroende på den typ av pärla, ett annat färgämne kan krävas för de injektion och dissektion lösningar; till exempel bör kresylviolett färgämne användas i stället för metylgrönt vid användning av glaspärlor 27.
Denna injektionsteknik är invasiv för mygga. Även om kan minimeras och kontrolleras och personskador, får alternativa verktyg vara ett bättre alternativ, beroende på experimentell design. Det är svårt att stimulera och samtidigt mäta flera immunsvar i samma mygga. Arbeteing på familjer eller grupper av myggor krävs när man tittar på sambanden mellan immunsvar 28. Dessutom, pärlor är endast delvis liknar den verkliga förekomsten av parasiter i en insekt.
Det första är den immunsvar stimuleras, och sedan den resulterande fenotypiska svaret, inkapslingen, mäts, men vad som händer i mellan är okänd. Kopplings injektioner med fysiologiska eller molekylära verktyg 10 - 12 kan förbättra vår förståelse av denna melanin svar. För att studera de bakomliggande mekanismerna för melanin svar kan uttrycket av nyckelenzymer eller molekyler som producerats under pro-fenol kaskad mätas 10-12. Men enbart fokusera på upp- eller nedreglering av dessa molekyler, utan att känna till de faktiska konsekvenserna av den slutliga inkapsling, kan leda till en felaktig bedömning av melaninprocessen. Därför studerar encapsulation och de molekylära mekanismer tillsammans skulle vara mycket informativt, trots det faktum att de är var och en giltig vetenskaplig teknik när de används separat.
Sammanfattningsvis är detta en teknik för att studera immunitet och utvecklingen av immunitet. Det finns till exempel ökande bevis för ett samband mellan insektsresistens och mygga mottaglighet för malariaparasiter. Denna injiceringsteknik skulle kunna användas i ett sådant sammanhang, såväl som i fältförsök. En andra arbets riktning skulle vara att kombinera immunstimulering med genen knockdowns för att studera immun vägar i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microcapillary glass tubes GB120TF-10 | science-products.com | GB120TF-10 | http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html |
| Microcaps Capillary pipette bulb | Drumond | 1-000-9000 | |
| negatively charged Sephadex CM C-25 beads | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | C25120 SIGMA | need few to start |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | 323829 ALDRICH | need few to start |
| Software ImageJ | opensource | Version 1.47f7 or later |
References
- Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
- Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P.
- Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
- Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
- Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
- Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
- Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
- Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
- Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
- Cerenius, L., Söderhäll, K.
- Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
- Moret, Y., Schmid-Hempel, P. Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).
- Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
- Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
- Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
- Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
- Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
- Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
- Lazzaro, B. P., Rolff, J.
- Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
- Michel, K., Kafatos, F. C.
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
- Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
- Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
- Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
- Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
- Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
- Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
- Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
- Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
- Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
- Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
- Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
- Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
- Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
- Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
- Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
- Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
- Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
- Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
- Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
- Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).
