Introduction
多倍体已经观察到，不仅在哺乳动物物种的专门的组织，而且在各种病理状况，如癌症和变性疾病。多倍体（主要是四倍体）细胞通常在人体组织中，诸如Barrett食管1,2或鳞状子宫颈3,4上皮内病变的癌前病变观察到的，并已经被认为是恶性非整倍体细胞的来源在那些组织5 6。虽然有人建议，四倍体转化为异倍体细胞可以是在肿瘤发生的早期阶段的关键事件，参与这一过程的机制尚未完全了解。这部分是因为没有体外模型已经可以在那里未转化多倍体人体细胞可以传播。
一些研究人员已经通过代双核细胞通过异烟肼诱导四倍体在非转化人类上皮细胞ibiting胞质7-9。在该方法中，然而，不必要的二倍体细胞，必须通过荧光激活细胞分选（FACS）消除7,8- 或通过有限稀释9克隆。因为这些程序是艰苦和不易执行，简单的方法来建立非转化四倍体细胞被期望在这一领域的研究。
在本报告中，我们描述了一个协议，通过相对简单的程序，以建立正常的人类成纤维细胞或端粒酶永生化人成纤维细胞增殖四倍体细胞。该过程使用的主轴毒药demecolcine（DC）逮捕由摆脱与DC进一步处理收集在有丝分裂二倍体细胞，并有丝分裂细胞。与DC治疗时间延长二倍体有丝分裂细胞转化为四倍体G1期细胞，而这些细胞增殖生长停滞了以下药物清除几天后的四倍体细胞。该协议提供用于创建一个有用的模型来研究染色体的不稳定性和多倍体的人类细胞的致瘤潜力之间的关系的有效方法。
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Protocol
1.细胞培养
- 获得的细胞以诱导四倍体。迄今为止，已经证实，该技术可以应用到人类的成纤维细胞系的TIG-1，BJ，IMR-90和端粒酶永生TIG-1（TIG-HT）。
- 生长在基本培养基细胞用α修改或适合于细胞类型进行研究补充有10％（V / V）热灭活的胎牛血清（FBS）的通过，在5％孵育（体积/任何其他细胞培养基ⅴ） 的 CO 2气氛中于37℃。传代细胞每3天或4天不超过汇合密度。
注：群体倍增水平（PDL）应在传代每次评估细胞生长和细胞年龄计算。的PDL可以从接种到培养皿（N1），并在使用下述式（X是初始PDL）的下传代（N 2）收获细胞数量的细胞数来计算。 PDL = X +（日志N1 - 日志N2）/ 2日志
2.诱导和埃斯塔从二倍体成纤维细胞四倍体细胞blishment
- 诱导四倍体没有动摇过。
注意：某些细胞株（ 如 TIG-1）可与demecolcine（DC）的如下成为连续处理几乎完全四倍体。- 传代细胞插入每天一或两个100毫米培养皿治疗前以诱导四倍体。一般，准备每盘5×10 5到1×10 6个细胞用于四倍体细胞的诱导。
- 治疗指数生长的细胞含有0.1微克/毫升DC 4天网上平台。
- 替换包含直流介质与不含药物的培养基，并在37℃孵育，在5％（体积/体积） 的 CO 2气氛中的细胞。细胞通常在1周内恢复增殖。
- 诱导四倍体与摇断。
注意：大多数细胞成为上述（2.1）中描述的，与直流的简单处理的结果是二倍体和四倍体群体的混合物。因此，p的一些修改rocedure消除二倍体人口是必要的如下（ 图1）。- 传代细胞分为几个T75烧瓶一天治疗前诱导四倍体。通常，至少准备5×10 6个细胞（每烧瓶1×10 6个细胞）为四倍体细胞的诱导。
- 治疗指数生长的细胞含有0.1微克/毫升DC 16中 - 18小时逮捕细胞的有丝分裂。逮捕在有丝分裂细胞中所需要的时间可能取决于靶细胞，并应通过初步实验来确定，以获得尽可能多的有丝分裂细胞成为可能。例如，速度较慢的生长的细胞应与直流待处理的速度比生长细胞较长的时间。
注：如果细胞可用于本步骤太长治疗，他们可能会经历有丝分裂滑脱并附着在餐具表面，使得不可能以收集通过摇断丝分裂细胞中的下一个步骤。 - 收集DC-逮捕有丝分裂细胞通过摇动关方法，WHICH松散地粘附的有丝分裂的细胞由烧瓶中并用培养基洗涤后离心的轻轻摇动（300 XG，5分钟）收集。通过在这个步骤中的适当的方法计数细胞数目。
- 补种收集有丝分裂细胞成60个100mm培养菜肴和治疗与0.1微克/毫升的DC细胞额外3天。种子每盘大于1×10 6个有丝分裂的细胞，因为细胞的小于10％的可存活这种治疗。
- 含直流用不含药物的培养基介质更换和等待细胞恢复增殖，通常在1周内出现。
- 传代细胞原二倍体细胞相类似。
3. DNA倍体的检查
注意：这是一个行之有效的方法和技术手册应提交详细的程序和技术技巧。
- 收获的细胞（5×10 5 - 1 10 6）通过用溶液CON培养细胞泰宁0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA的10分钟，在37℃，并用含10％FBS的培养基中和胰蛋白酶。
- 离心细胞介质和通过在5ml磷酸盐缓冲盐水的（PBS）然后离心（300 XG，5分钟）再悬浮清洗。
- 通过以下两种方法之一制备用于DNA分析的细胞
- 一种分析非固定细胞10方法
注意：可以使用用于细胞周期分析市售的试剂盒来进行此方法。用这种方法制备的样品应当立即进行分析，因为细胞不固定在过程和染色的核将随着时间的推移损坏。- 洗用含有250mM的蔗糖的40mM柠檬酸盐缓冲液的细胞。随后处理细胞用0.1％（体积/体积）的Nonidet P40和30微克/毫升胰蛋白酶250微升在含有250mM的蔗糖在室温下10分钟200 40微升mM柠檬酸盐缓冲液中。
- 加入0.5微克/毫升胰蛋白酶INH 200微升ibitor和0.1微克/毫升RNA酶A在含有250mM的蔗糖的40mM柠檬酸盐缓冲液，并温育细胞，在室温下10分钟。
- 加入200微升的0.4毫克/在含有250mM的蔗糖的40mM柠檬酸盐缓冲溶液的碘化丙啶（PI），并在室温下孵育10分钟的细胞进行染色细胞核。
- 一种分析固定的细胞的方法
- 修复用80％乙醇的细胞通过在1毫升的PBS悬浮细胞，加入4毫升100％乙醇的溶液，同时混合该细胞悬浮液，并离开它在室温下30分钟。在此固定剂的细胞可以储存在-20℃下几个星期。
- 通过在5mL PBS中重悬它们洗涤细胞，然后离心（300 XG，5分钟）。治疗细胞用0.5毫克/毫升RNA酶A并用50微克/毫升的碘化丙啶（PI）（0.5毫克/毫升RNA酶A 475微升和1毫克25微升/毫升，PI），在室温下30分钟染色它们。
- 一种分析非固定细胞10方法
- 分析的T DNA含量他用流式细胞仪用488 nm激光和红色通道排放过滤器网格（长传> 610纳米）。分析在同一时间从真正二倍体细胞制备来评估靶细胞的倍性的参比样品。
- 备选地，添加荧光标准珠以评估二倍体细胞对珠的荧光强度比。使用“脉冲高度与脉冲宽度”流选项仪单四倍体细胞和二倍体细胞11团块区别对待。
4.检查染色体计数及核型分析
注意：这些都是行之有效的程序和技术手册或制造商的协议应提交详细的程序和技术技巧。
- 治疗指数生长的细胞用0.1微克/毫升DC 4小时，逮捕细胞分裂中期。
- 准备染色体核型。
- 离心细胞在培养基（300 XG，5分钟），并用在37℃的低渗溶液（5mL，0.075M的KCl）10分钟治疗。
- 修复和暂停在卡诺固定液细胞（甲醇：乙酸= 3：1）。
- 细胞悬液 - （35微升25）通过删除一小体积散布细胞到载玻片。如暴露于热蒸汽附加步骤可能是必要的，以改善染色体蔓延。
- 染色体计数。
- 染色细胞用5％吉姆萨溶液（或含有荧光显微镜0.5毫克/毫升RNA酶A 5微克/毫升，PI）15 - 20分钟。
- 数字拍摄至少50中期细胞。
- 使用图像分析softwa计数每个细胞的染色体数目再接触并使用照片编辑软件重叠染色体手动分离后。虽然染色体数目可以手动进球，推荐电脑计分。
- 核型分析
注：本分析应该由经过培训的技术人员或专业的公司来进行。- 根据一个标准的G显带技术12染色的细胞。
- 分析染色体，使标准karyograms 12。
- 渔业部
注：该步骤是可选的，并且如果必要应进行。- 使用用于根据制造商的方案13的人染色体的多色FISH探针染色的细胞。
- 分析使用带有适当的滤波器荧光显微镜和渔业部分析13软件的染色体。
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Representative Results
根据我们的经验，TIG-1细胞可以几乎完全四倍体用0.1微克/毫升直流4天（ 图2A）制成由简单的连续治疗。与此相反，其他成纤维细胞株，如BJ或IMR-90，和TIG-HT细胞，成为由摇离方法二倍体和按照相同的治疗四倍体群体，和有丝分裂细胞的分离的混合物中的过程中是必要的的直流处理（通常为16 -治疗开始后18小时）（ 图2B，C）。与DC的额外治疗3天后，细胞发生生长停滞和呈现出巨大的，扁平的形态了好几天。内一般一周小增殖细胞出现的大扁平细胞之间（ 图3）。 DC治疗3周后 - 细胞成为2几乎完全四倍体。在建立四倍体细胞的模态染色体数目在大多数情况下92，EXCE角从TIG-HT细胞建立的四倍体细胞系中的一个有在大部分细胞91染色体（ 图4）。建立四倍体细胞生长以几乎相同的速率二倍体细胞（ 图5）。从非永生化细胞建立四倍体细胞系显示大致相等的复制寿命为原来的二倍体细胞，而来自无限增殖化细胞似乎也不朽（ 图5）。从非永生化TIG-1细胞建立的四倍体细胞显示正常的核型，除了具有四倍体染色体数目（ 图6上图），而那些由永生化的TIG-1（TIG-HT）的细胞显示相当复杂的克隆像差（ 图6中部和底部面板）。在后者的细胞克隆性像差的频率（TIG-HT-4N）从每个细胞2.5像差在255群体倍增水平（的PDL）在450的PDL增加到每细胞5.2像差反复传代。
图 1： 协议四倍体诱导的示意图。以得到四倍体细胞的二倍体细胞的最小污染，有丝分裂摇断和DC治疗的组合是必要的大多数细胞株（低级图示），而一些细胞株（ 如 TIG-1）可以成为连续处理几乎完全四倍体与demecolcine（上图）。 1）处理细胞T75烧瓶（至少5×10 6）与0.1微克/毫升的DC 16 - 18小时（此时应该由初步实验确定），以阻止细胞的有丝分裂。 2）收集由摇离方法有丝分裂细胞和补种成60个100mm培养菜肴。 3）治疗用0.1微克/毫升的DC细胞额外3天。 4）孵育不含药物的培养基细胞（通常是细胞恢复p1周内roliferation）。刻度条表示100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：成纤维细胞前和治疗后对四倍体的诱导DNA直方图。 （A）TIG-1细胞。此细胞株变得简单连续处理用0.1微克/毫升直流4天四倍体。 （B）的 BJ细胞。由于这种细胞株变得二倍体和四倍体种群在与DC（左图）简单处理混合物，通过摇落丝分裂细胞的隔离DC治疗期间要建立四倍体细胞（右图）。 （C）的 TIG-HT（端粒酶永生TIG-1）的细胞。这些细胞还需要由梳子来制备 DC治疗，动摇过设立四倍体细胞中萌发的。在直方图数字表示移除药物后的时间（天）。横轴为DNA含量（C，补充）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：与直流治疗BJ细胞的代表性显微照片。 （A）的 BJ细胞用0.1微克/毫升的DC处理16小时。在有丝分裂被捕许多细胞中可以看出。 （二）DC治疗结束。几乎所有的细胞生长逮捕。 （C）DC治疗后7天。大扁平细胞间小增殖细胞可以看到。 （D）的直流治疗后14天。细胞活跃生长。 e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 建立从每个细胞株四倍体细胞染色体和染色体数目的直方图的代表性显微照片。顶部，中部和底部面板代表从TIG-1成立四倍体细胞（2周直流处理之后），BJ（2周后的DC治疗）和TIG-HT（7周直流处理之后）分别细胞。染色体至少50个中期进行评分。直方图中的数字是模态染色体数目。 请点击此处查看该图的放大版本。
ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg“/>
图5： 人成纤维细胞（二倍体细胞），并从每个细胞株四倍体成立的细胞生长代表型材。左，中，右面板显示原始TIG-1的生长曲线，BJ和TIG-HT细胞（开放标记）以及四倍体细胞从每个细胞株建立（闭合标志）。细胞每周传代两次，并从细胞数目计算出的PDL。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 代表Karyograms G显带和渔业部。顶部面板显示由TIG-1建立四倍体细胞（2周DC治疗后）的G显带一个karyogram。中部和底部面板显示karyograms由渔业部从TIG-HT细胞（DC治疗后15和41周）建立了四倍体细胞。核型是基于10个细胞（TIG-1）或20个细胞（TIG-HT）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
从二倍体细胞通过化学试剂四倍体诱导的主要问题，无论是由胞质抑制剂或由主轴抑制剂，是细胞常成为二倍体和四倍体群体的混合物，和四倍体细胞必须从二倍体细胞中分离出来。免费二倍体细胞的四倍体种群隔离最常用的方法通过有限稀释使用FACS或克隆。然而，这些程序是费力和不容易执行。在这份报告中，我们提出了一个新的协议建立无正常人成纤维细胞二倍体人口增殖细胞四倍体。该协议采用主轴毒药直流对中有丝分裂拦阻二倍体细胞，并逮捕有丝分裂细胞通过从二倍体间期细胞，其附着到培养皿表面甩掉分离。收集的细胞用直流处理额外的3天，二倍体有丝分裂细胞通过该延长直流治疗想必b转换为四倍体G1期细胞Ÿ检查点调整（也称为有丝分裂滑脱）。这些细胞重新启动细胞生长生长停滞药物清除几天后，四倍体细胞。
这种方法的一个优点是，程序相对简单，并与那些使用FACS或克隆以分离四倍体细胞相比是可行的。该方法的局限性是以下内容。适用性比成纤维细胞的其它细胞类型，如上皮细胞，是目前未知的。这应该在今后的研究中得到证实。小二倍体人口可能会保持在某些情况下。但是，这些细胞趋向于连续传代减弱。如果直流治疗，直流的更高浓度后显著二倍体人口持续（1.2 - 1.5微克/毫升）或摇掉后，用直流更长的治疗（代替3天4天）可能会提高的结果。
在这个协议中最重要的步骤如下。首先，治疗时间与DC的摇断之前，在有丝分裂细胞rresting是至关重要的。虽然这个处理时间应足够长以收集尽可能多的有丝分裂细胞成为可能，处理时间过长会引起有丝分裂滑脱和粘附于培养皿表面，使它不可能通过摆脱收集有丝分裂的细胞。因为适当的时间对有丝分裂的细胞的最大恢复可能取决于靶细胞，它应该通过初步实验来确定。其次，摆脱步分离的细胞有丝分裂间期从细胞也很关键。在此步骤中，二倍体有丝分裂细胞，这是松散地附着在餐具表面，由烧瓶，随后通过离心轻轻摇动收集。这有丝分裂摇断分离粘附间期细胞可能由二倍体人口后来成为污染的来源由直流被捕有丝分裂的细胞。剧烈摇晃可能导致介质，这可能会破坏细胞，并且还间期细胞的脱离鼓泡河esulting在二倍体细胞的污染。可能影响该方法的成功的另一因素是培养基。因为健壮生长刺激似乎是必要的增殖的直流治疗后的恢复，如MEM-α营养丰富的介质应当被用来支持四倍体细胞的增殖。在四倍体细胞（2.2.5）的诱导的最后步骤中增加的FBS浓度为20％也可能会增加该方法的成功。
使用该协议，我们迄今从人成纤维细胞株TIG-1，BJ，IMR-90和端粒酶永生化TIG-1到现在14-16产生四倍体细胞。在这些细胞株，TIG-1是相当不寻常的，因为与DC连续处理时，没有动摇过，4天该细胞株变得几乎完全四倍体。为什么只有TIG-1细胞变得与直流简单处理的结果完全四倍体的原因是目前未知的。可能expla国家可能是在二倍体G1期其他类型逮捕细胞显著比例时与直流治疗和治疗后恢复增殖，而（1）的TIG-1细胞不于G1具有相同的治疗逮捕，或（2）一TIG-1细胞的不可逆的人口在逮捕G1同样的待遇下，此后没有恢复增殖。在任何情况下，G1期检查点的DC不同灵敏度可能负责的细胞与直流连续处理后的不同的行为。
当调查在肿瘤发生四倍体的病原意义，许多研究人员都了解在四倍体细胞中的p53基因的状态极大的关注，因为它已被提出，四倍体诱导p53依赖的生长停滞细胞，这被称为“四倍体检查点” 17-20。如果这个假设是正确的，在增殖细胞四倍体p53信号应该被灭活。然而，由我们的协议建立的四倍体细胞似乎具有功能性p53尽管在几乎相同的速率二倍体细胞15,16生长。这样做的原因差异目前尚未知的，并且在四倍体细胞的增殖的p53失活的意义应当在未来的研究精确地检测。事实上，四倍体检查点，通过p53基因功能的存在仍存在争议21-23。
虽然这可在体外繁殖非转化多倍体细胞是染色体的不稳定和多倍体细胞的致癌潜力的详细分析是必不可少的，这样的细胞具有迄今很少被使用。我们的协议提供了一个简单可行的方法从正常的人成纤维细胞，这可能是用于研究导致多倍体人类细胞的转化机制的有用模型建立增殖四倍体细胞。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
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