Introduction
倍数性は、哺乳動物種の特殊な組織でも、癌や変性疾患のような病的状態の様々なだけでなく、観察されました。倍数体（主に四倍体）細胞は、しばしば、頸部3,4のバレット食道1,2または扁平上皮内病変のようなヒト組織の前癌病変において観察され、そしてそれらの組織5における悪性異数性細胞の供給源であると考えられています、6。それは異数体細胞への四倍の変換は腫瘍形成の初期段階において重要な事象である可能性が示唆されていますが、このプロセスに関与するメカニズムは完全には理解されていません。非形質転換倍数体ヒト細胞を伝播することができる場所ないin vitroモデルが利用できなかったので、これは部分的です。
一部の研究者は、INHによって二核細胞の生成を介して非形質転換ヒト上皮細胞に四倍を誘発しました細胞質分裂7-9 ibiting。しかし、この方法では、不要な二倍体細胞は、蛍光活性化細胞選別（FACS）7,8によって除去されなければなりません または希釈9を制限することによってクローニング。これらの手順が面倒で実行することは容易ではないので、非形質転換四倍体細胞を確立するための簡単な方法は、この分野の研究のために望まれています。
本報告書では、比較的簡単な手順で、正常ヒト線維芽細胞またはテロメラーゼ不死化ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を確立するためのプロトコルについて説明します。手順は、有糸分裂で二倍体細胞を逮捕するためにスピンドル毒デメコルチン（DC）を使用し、オフ振とうすることにより収集有糸分裂細胞は、更に、DCで処理されています。長時間DCで処理された二倍体有糸分裂細胞は、四倍体G1細胞に変換し、これらの細胞は、薬物除去後数日間増殖停止した後に四倍体細胞として増殖します。このプロトコルは、提供します染色体不安定性と倍数体ヒト細胞の発癌性との間の関係を研究するための有用なモデルを作成するための効率的な方法。
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Protocol
1.細胞培養
- 四倍を誘導するために細胞を得ます。現在までに、この技術は、ヒト線維芽細胞株TIG-1、BJ、IMR-90およびテロメラーゼ不死化TIG-1（TIG-HT）に適用できることが確認されました。
- α改変または/ 5％（Vでインキュベートすることにより、10％（v / v）の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充した研究する細胞型に適した任意の他の細胞培養培地で最小必須培地中で細胞を増殖させます37℃でのv）のCO 2雰囲気。継代細胞ごとに3〜4日には、サブコンフルエント密度を超えません。
注：集団倍加レベル（PDL）細胞増殖と細胞齢を評価するために、継代時に各時間を計算しなければなりません。 PDLは、細胞数から計算することができ、以下の式（X初期PDLである）を用いてディッシュ（N1）と次の継代（N2）で採取された細胞数に播種。 PDL = X +（N1を記録 - N2をログ）/ログ2
2.誘導とエスタ二倍体線維芽細胞から四倍細胞のblishment
- 振り切りなしで四倍誘導します。
注：次のようにいくつかの細胞株（ 例えば TIG-1）がデメコルチン（DC）で連続的に処理することにより、ほぼ完全に四倍になることができます。- 治療前の日に1または2 100mm皿に継代細胞は、四倍誘導しました。通常、四倍体細胞の誘導のために皿当たり5×10 5×10 6〜1細胞を調製。
- 4日間は0.1μg/ mLのDCを含む培地で指数関数的に増殖する細胞を扱います。
- 薬物を含まない培地でのDCを含む培地を交換し、37℃で5％（v / v）のCO 2雰囲気中で細胞をインキュベートします。細胞は通常、1週間以内に増殖を再開します。
- 振り切りで四倍誘導します。
注：ほとんどの細胞はDCとの単純な処理の結果として二倍体と四倍体集団の混合物は、上記（2.1）説明になります。 Pのため、いくつかの変更（ 図1）を次のように二倍体の集団を除去するrocedureが必要です。- いくつかのT75への継代細胞は、四倍を誘導するために、治療前の日をフラスコ。通常、四倍体細胞の誘導のために少なくとも5×10 6細胞（フラスコ当たり1×10 6細胞）を準備します。
- 有糸分裂中の細胞を逮捕するために18時間 - 16のためには0.1μg/ mLのDCを含む培地で指数関数的に増殖する細胞を扱います。有糸分裂中の細胞を阻止するのに必要な時間は、標的細胞に依存してもよいし、可能な限り多くの有糸分裂細胞を得るために、予備実験によって決定されるべきです。例えば、遅い成長している細胞が速く増殖する細胞よりも長い時間DCで治療すべきです。
注：細胞が長すぎる、この段階での治療を受けている場合、彼らは分裂滑りを受ける可能性があり、それができなく次のステップで振り切りにより有糸分裂細胞を収集すること、皿表面に付着します。 - WHで、振り切り法によりDC-逮捕有糸分裂細胞を収集ICH緩く付着した有糸分裂細胞を遠心分離し、フラスコと培地での洗浄の穏やかに振盪（300×gで、5分間）によって収集されます。この段階での適切な方法により、細胞数をカウントします。
- 60mm培養皿に収集した有糸分裂細胞を再シードし、さらに3日間は0.1μg/ mLのDCで細胞を扱います。細胞の10％未満が、この処理に耐えることができるので、皿当たり以上、1×10 6個の有糸分裂細胞を播種。
- 薬物を含まない培地でのDCを含む培地を交換し、細胞は通常、1週間以内に発生した増殖を再開するのを待ちます。
- 同様に、元の二倍体細胞に継代細胞。
DNA倍数性の3.検討
注：これは、十分に確立された手順で、技術的なマニュアルは、詳細な手順と技術的なヒントについては、を参照されたいです。
- ソリューション詐欺で細胞をインキュベートすることにより-収穫細胞（1×10 6、5×10 5）37℃で10分間、0.05％トリプシンおよび0.02％EDTAをtaining、10％FBSを含む培地によりトリプシンを中和します。
- 培地中の遠心細胞及び遠心分離（300×gで、5分間）、続いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）5mLに再懸濁することにより、それらを洗浄します。
- 次の2つの方法のいずれかによってDNA分析のための細胞を調製します
- 未固定細胞10を分析するための方法
注：この方法は、細胞周期分析のために市販のキットを用いて行うことができます。細胞が手順で固定されていないと染色された核は時間をかけて破損しますので、この方法で調製した試料は、直ちに分析する必要があります。- 250mMのスクロースを含む40 mMのクエン酸緩衝液で細胞を洗浄。その後室温で10分間、250mMのスクロースを含有する200μLの40 mMのクエン酸緩衝液中の0.1％（v / v）のノニデットP40の30 / mlのトリプシンの250μLで細胞を治療します。
- 0.5μgの/ mLのトリプシンINHの200μLを追加ibitor及び250mMのスクロースを含む40mMのクエン酸緩衝液中の0.1 / mlのRNアーゼA、室温で10分間細胞をインキュベートします。
- 250mMのスクロースを含む40mMのクエン酸緩衝液中の0.4mg / mLのヨウ化プロピジウム（PI）の200μLを加え、細胞核を染色し、室温で10分間細胞をインキュベートします。
- 固定した細胞を分析するための方法
- 細胞懸濁液を混合し、室温で30分間そのままの100％EtOH滴下を4mLを加えて1mlのPBSに細胞を懸濁し、80％エタノールで細胞を固定。この固定液中の細胞は数週間-20℃で保存することができます。
- PBS 5mLにそれらを再懸濁することにより洗浄細胞を遠心分離（300×gで、5分間）しました。 0.5ミリグラム/ mLのRNase Aで細胞を処理し、室温で30分間、50μg/ mlのヨウ化プロピジウム（PI）（0.5ミリグラム/ mlのRNase Aおよび1mg / mLのPIの25μLの475μL）でそれらを染色します。
- 未固定細胞10を分析するための方法
- トンのDNA含有量を分析彼488 nmのレーザー、赤チャンネル発光フィルタ（ロングパス> 610 nm）を用いてフローサイトメーターを用いて細胞。標的細胞の倍数性を評価するために、同時に本物の二倍体細胞から調製された基準試料を分析します。
- 代替的に、二倍体細胞対ビーズの蛍光強度比を評価するために、蛍光標準ビーズを加えます。二倍体細胞11の単四倍体細胞と凝集塊とを区別するために、フローサイトメーターのオプション'パルス幅対パルス高さ'を使用します。
染色体の数および核型分析4.審査
注：これらはすべてが順調に確立された手法であり、技術マニュアルか、製造元のプロトコルが詳細な手順と技術的なヒントについては、を参照されたいです。
- 中期で細胞を停止するために4時間を0.1μg/ mLのDCで、指数関数的に増殖する細胞を扱います。
- 染色体スライドを準備します。
- 培地中の遠心細胞（300×gで、5分間）し、10分間37℃で低張液（0.075 MのKCl 5 mL）で治療します。
- 修正し、カルノア固定液で細胞を懸濁（メタノール：酢酸= 3：1）。
- 細胞懸濁液の - （35μL25）、少量をドロップすることにより、スライドガラス上に細胞を広げました。このような高温の蒸気への暴露などの追加の手順が広がり、染色体を改善する必要があるかもしれません。
- 染色体数。
- 20分 - 5％ギムザ溶液（又は蛍光顕微鏡検査のために0.5mg / mlのRNase Aを含むに5μg/ mLのPI）15を有する染色細胞。
- デジタル少なくとも50中期細胞を撮影。
- 画像解析softwaを用いて細胞あたりの染色体数を数えます写真編集ソフトウェアを使用して染色体をタッチし、重複を手動で分離した後の再。染色体数を手動で採点することができますが、コンピュータ化されたスコアリングが推奨されます。
- 核型分析
注：この分析は、訓練を受けた技術者または専門の会社が行ってください。- 標準G-バンディング技術12に従って染色細胞。
- 標準karyograms 12を作るために染色体を分析します。
- mFISH
注：この手順はオプションであり、必要に応じて行われるべきです。- 製造業者のプロトコル13に記載のヒト染色体のための多色FISHプローブを使用して染色細胞。
- 適切なフィルターとmFISH分析13については、ソフトウェアに蛍光顕微鏡を用いて染色体を分析します。
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Representative Results
我々の経験では、TIG-1細胞を4日間は0.1μg/ mLのDC（ 図2A）との単純な連続処理によってほぼ完全に四倍にすることができます。これとは対照的に、このようなBJまたはIMR-90、およびTIG-HT細胞のような他の線維芽細胞株は、同じ治療後の二倍体と四倍体集団の混合物となり、振り切り法による有糸分裂細胞の単離はもちろん、中に必要ですDCの治療（通常は16から18時間、治療の開始後）（ 図2B、C）。 3日間のDCでの追加処理した後、細胞が増殖停止を受け、大規模な展示、数日間形態を平坦化。一般的には1週間以内に、小さな増殖細胞は、大規模な平坦化細胞（ 図3）の間に現れました。 DC処理後3週間 - 細胞は2でほぼ完全に四倍になりました。確立された四倍体細胞におけるモーダル染色体数は、ほとんどの場合、exce 92でしたPT TIG-HT細胞から確立された四倍体細胞株の一つは、細胞の大部分において91染色体（ 図4）を有していました。設立四倍体細胞は、二倍体細胞（ 図5）とほぼ同じ速度で成長しました。不死化細胞からのものも不滅（ 図5）のようだった一方で、非不死化細胞から樹立された四倍体細胞株は、元の二倍体細胞とほぼ同等の複製寿命を示しました。非不死化TIG-1細胞から樹立した四倍体細胞は、図6（細胞がかなり複雑クローン異常が認められた不死化TIG-1（TIG-HT）からのものに対し、四倍体染色体数（ 図6上部パネル）を有する以外は正常な核型を示しました。中・下のパネル）。後者の細胞（TIG-HT-4N）中のクローン異常の頻度は450 PDLでセル当たり5.2異常に255集団倍加レベル（PDLの）で、セルあたり2.5異常から増加しました継代培養を繰り返しています。
図1： 四倍の誘導のためのプロトコルの概略図。いくつかの細胞株（ 例えば TIG-1）は連続処理によってほぼ完全に四倍になることができますしながら、二倍体細胞の最小汚染と四倍体細胞を得るために、有糸分裂シェイクオフとDCの治療の組み合わせは、ほとんどの細胞株（下の図）のために必要ですデメコルチン（上図）と。有糸分裂中の細胞を逮捕するために18時間（この時間は予備実験によって決定されるべきである） - 1）16は0.1μg/ mLのDCでT75フラスコ（少なくとも5×10 6）で細胞を扱います。 2）振り切り法により有糸分裂細胞を収集し、60mm培養皿に再シード。 3）さらに3日間は0.1μg/ mLのDCで細胞を扱います。 4）通常、細胞は、pを再開（薬物を含まない培地中で細胞をインキュベート1週間以内roliferation）。スケールバーは100μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：線維芽細胞のDNAヒストグラム前と四倍の誘導のための治療後。 （A）TIG-1細胞。この細胞株は4日間は0.1μg/ mLのDCとの単純な連続処理によって四倍になります。 （B）BJ細胞。この細胞株はDC（左のパネル）を持つ単純な治療後の二倍体と四倍体集団の混合物となりますので、振り切りにより有糸分裂細胞の単離は四倍体細胞（右パネル）を確立するためにDCの治療中に必要です。 （C）TIG-HT細胞（TIG-1をテロメラーゼ不死化）。これらの細胞はまた、櫛によって調製される必要があります DC処理および四倍体細胞の樹立のための振り切りのネーション。ヒストグラム中の数字は、薬物除去後の時間（日）を表します。横軸はDNA量（C、補体）を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：DCで処理されたBJ細胞の代表的な顕微鏡写真。 （A）BJ細胞を16時間は0.1μg/ mLのDCで処置しました。有糸分裂で停止多くの細胞が見られます。 （B）DC処理の終了。ほとんどすべての細胞が増殖停止されています。 7日DC処理後（C）。大きな扁平細胞間の小さな増殖細胞を見ることができます。 14日DC処理後の（D）。細胞が活発に成長しています。 e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 各細胞株から確立された四倍体細胞のための染色体および染色体数のヒストグラムの代表的な顕微鏡写真。トップ、ミドル、および下のパネルは、それぞれ、TIG-1（DC処理後2週間）、BJ（DC処理後2週間）とTIG-HT（DC処理後7週間）細胞から樹立された四倍体細胞を表します。染色体は、少なくとも50の分裂中期で採点しました。ヒストグラム中の数字は、モーダル染色体数です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5： 各細胞株から樹立されたヒト線維芽細胞（二倍体細胞）と四倍体細胞の代表的な成長プロファイル。左、中央、右のパネルは、元のTIG-1、BJおよびTIG-HT細胞（オープンマーカー）と各細胞株（閉じたマーカー）から確立された四倍体細胞のそれらの成長プロファイルを示します。細胞を週に2回継代したとのPDLは、細胞数から計算しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：G- バンディングとmFISHによって代表Karyograms。トップパネルには、TIG-1から確立四倍体細胞（DC処理後2週間）のG-バンディングによってkaryogramを示しています。中間および下のパネルが表示さTIG-HT細胞（DC処理後15及び41週）から確立された四倍体細胞についてmFISHによってkaryograms。核型は、10細胞（TIG-1）または20細胞（TIG-HT）に基づいていました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
化学物質による、細胞質分裂阻害剤によるスピンドル阻害剤のいずれかによって二倍体細胞から四倍の誘導における主要な問題は、細胞がしばしば二倍体と四倍体集団の混合物となり、四倍体細胞は二倍体細胞から分離されなければならないということです。二倍体細胞の自由な四倍体の集団を単離するための最も一般的なアプローチは、希釈を制限することによって、FACSまたはクローニングを使用します。しかし、これらの手順は、面倒で実行することは容易ではありません。本稿では、正常なヒト線維芽細胞からの二倍体の人口の無料増殖性四倍体細胞を確立するための新しいプロトコルを提示します。プロトコルは、有糸分裂で二倍体細胞を停止するスピンドル毒のDCを使用し、皿表面に付着した二倍体間期細胞から振り切りで分離されている有糸分裂細胞を逮捕しました。回収した細胞をさらに3日間DCで処理され、そして二倍体有糸分裂細胞は、この長期のDC処理恐らくbで四倍体G1細胞に変換します（また、有糸分裂スリッページと呼ばれる）のyチェックポイント適応。これらの細胞は、薬物除去の数日間増殖停止後の四倍体細胞のような細胞増殖を再起動します。
この方法の利点は、手順は比較的単純でFACSを使用するか、四倍体細胞を単離するためのクローニングと比較可能であるということです。この方法の制限事項は、以下の通りです。例えば、上皮細胞などの線維芽細胞以外の細胞型への適用は、現時点では不明です。これは、今後の研究で確認する必要があります。小さな二倍体の人口は、いくつかの例に残っている可能性があります。しかしながら、これらの細胞は、連続継代して減少する傾向があります。重要な二倍体個体群は、DC処理した後持続する場合、DCの高濃度（1.2から1.5μgの/ ml）または振り切り後のDCでの長い治療（4日間の代わりに3日）は、結果を改善する可能性があります。
このプロトコルの中で最も重要なステップは以下の通りです。まず、用DCでの処理時間振り切り前に、有糸分裂中の細胞をrrestingすることが重要です。この処理時間は、できるだけ多くの有糸分裂細胞を収集するのに十分な長さでなければならないが、あまりにも長い間治療することは不可能オフ振とうすることにより有糸分裂細胞を収集すること、皿表面に有糸分裂の滑りとの密着性を引き起こす可能性があります。有糸分裂細胞の最大回収のための適切な時間は、標的細胞に依存することができるので、予備実験によって決定されるべきです。第二に、間期細胞から有糸分裂細胞を分離するための振り切り工程も重要です。このステップでは、緩く皿表面に付着している二倍体有糸分裂細胞を、遠心分離し、フラスコを穏やかに振とうすることにより回収されます。この有糸分裂シェイクオフは、後に二倍体の集団による汚染の起源であるかもしれない付着した間期細胞からDCに逮捕された有糸分裂細胞を分離します。また、間期細胞の剥離を細胞に損傷を与え、そして可能性がある媒体のバブリングを引き起こす可能性が激しく振る、R二倍体細胞の汚染にesulting。この方法の成功に影響を及ぼし得る他の要因は、培地です。頑強な成長刺激がDC処理後の増殖の回復のために必要であると思われるので、このようなMEM-αなどの栄養豊富な培地は、四倍体細胞の増殖をサポートするために使用されるべきです。四倍体細胞（2.2.5）の誘導の最終段階で20％にFBS濃度を増加させることはまた、この方法の成功を増加させる可能性があります。
BJは現在、14から16まで、IMR-90とテロメラーゼ不死化TIG-1このプロトコルを使用して、我々はこれまでにヒト線維芽細胞株TIG-1から四倍体細胞を生産しています。 4日間、振り切りすることなく、DCで連続的に処理した場合、この細胞株は、ほぼ完全に四倍になるため、これらの細胞株のうち、TIG-1はかなり珍しいです。唯一のTIG-1細胞はDCとの単純な処理の結果として完全に四倍になった理由は現時点では不明です。可能なexpla国は二倍体G1期での他のタイプの逮捕の細胞のかなりの割合は、DCで処理し、（1）TIG-1細胞は、（2）A同じ処理でG1で逮捕、あるいはしないのに対し、治療後に増殖を再開したときということかもしれませんTIG-1細胞の集団は、不可逆的に同じ治療中のG1で逮捕し、その後増殖を再開しません。いずれの場合も、DCにG1チェックポイントの異なる感度は、DCでの連続処理後の細胞の異なる動作を担当する可能性があります。
腫瘍形成における四倍の病因的意義を調査すると、多くの研究者は、四倍は「四倍チェックポイント」と呼ばれる細胞のp53依存性の増殖停止を誘導することが提案されているので、四倍体細胞におけるp53遺伝子の状態について大きな懸念を持っています17-20。この仮説が正しければ、四倍体細胞増殖におけるp53シグナル伝達は、不活性化されるべきです。しかしながら、我々のプロトコルによって確立された四倍体細胞は二倍体細胞15,16とほぼ同じ速度で成長しているにもかかわらず、機能的p53を持っているようです。この矛盾の理由は現時点では知られていない、と四倍体細胞の増殖におけるp53の不活性化の重要性は今後の研究に正確に検討する必要があります。実際には、p53を介して機能四倍のチェックポイントの存在は21-23論争のまま。
試験管内で伝播することができる非形質転換倍数体細胞は染色体不安定性および倍数体細胞の発癌性の詳細な分析のために不可欠であるが、そのような細胞はこれまでめったに利用されていません。私たちのプロトコルは倍数体ヒト細胞の形質転換につながるメカニズムを研究するための有用なモデルである可能性があり、正常ヒト線維芽細胞から増殖性四倍体細胞を樹立するためのシンプルかつ実現可能な方法を提供します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利害関係を持っていないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
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