Introduction
Polyploïdie waargenomen niet alleen in gespecialiseerde weefsels van zoogdieren maar ook in een verscheidenheid van pathologische aandoeningen, zoals kanker en degeneratieve ziekten. Polyploïde (meestal tetraploïde) cellen worden vaak waargenomen in preneoplastische laesies van menselijke weefsels, zoals de oesophagus of 1,2 squameuze intra-epitheliale laesies van de cervix 3,4 Barrett's en werden beschouwd als de bron van kwaadaardige aneuploïde cellen in deze weefsels 5 , 6. Ofschoon wordt voorgesteld omzetting van tetraploïde tot aneuploïde cellen een belangrijke gebeurtenis in de vroege stadia van tumorigenese kan zijn, worden de hierbij betrokken mechanisme niet volledig begrepen. Dit komt deels omdat er geen in vitro model beschikbaar is geweest, waar niet-getransformeerde polyploïde menselijke cellen kunnen voortplanten.
Sommige onderzoekers hebben veroorzaakt tetraploidy in niet-getransformeerde humane epitheelcellen door de generatie van binucleaire cellen door inhibiting cytokinese 7-9. Bij deze werkwijze echter onnodig diploïde cellen geëlimineerd worden door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 7,8 of kloneren door beperkende verdunning 9. Omdat deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren, eenvoudigere methoden voor het vaststellen getransformeerde tetraploïde cellen gewenst voor onderzoek op dit gebied.
In dit rapport beschrijven we een protocol om proliferatieve tetraploïde cellen uit normale menselijke fibroblasten of-telomerase onsterfelijk gemaakte humane fibroblasten vast te stellen door een relatief eenvoudige procedures. De procedures spil poison demecolcine (DC) aan diploïde cellen in mitose, en mitotische cellen door afschudden worden verder behandeld met DC verzameld arresteren. Diploïde mitotische cellen behandeld met DC voor langere tijd om te zetten in tetraploïde G1 cellen en deze cellen zich vermenigvuldigen als tetraploïde cellen na groeistop voor enkele dagen na verwijdering drug. Dit protocol biedteen efficiënte methode voor het maken van een bruikbaar model om de relatie tussen chromosomale instabiliteit en het oncogene potentieel van polyploïde menselijke cellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur van de Cel
- Het verkrijgen van de cellen om tetraploidy induceren. Tot op heden is het bevestigd dat deze techniek kan worden toegepast op de humane fibroblast cellijnen TIG-1, BJ, IMR-90 en telomerase-geïmmortaliseerde TIG-1 (TIG-HT).
- Groeien cellen in minimaal essentieel medium met α wijziging of enig ander celkweekmedium geschikt voor het celtype te onderzoeken aangevuld met 10% (v / v) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) door incubatie in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Passage cellen elke 3 of 4 dagen niet subconfluente dichtheid overschrijden.
OPMERKING: populatieverdubbelingstijd level (PDL) wordt berekend telkens bij passage om celgroei en leeftijd evalueren. PDL kan worden berekend uit het aantal cellen gezaaid in een schaal (N1) en het aantal cellen geoogst bij de volgende passage (N2) met de volgende formule (X is de eerste PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. Inductie en Establishment van Tetraploïde Cellen uit diploïde fibroblasten
- Induceren tetraploidy zonder shake-off.
LET OP: Sommige mobiele stammen (bijv TIG-1) kan bijna volledig tetraploïde door continue behandeling worden met demecolcine (DC) als volgt.- Passage cellen in één of twee 100 mm schalen op de dag vóór de behandeling induceren tetraploidy. Meestal, voor te bereiden 5 x 10 5 tot 1 x 10 6 cellen per schotel voor inductie van tetraploïde cellen.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen.
- Vervang DC-bevattend medium met drug-vrij medium en incubeer cellen in een 5% (v / v) CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Cellen meestal hervatten proliferatie binnen 1 week.
- Induceren tetraploidy met shake-off.
OPMERKING: De meeste cellen een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties als gevolg van de eenvoudige behandeling met DC hierboven (2.1) beschreven. Daarom enkele wijzigingen in de pROCEDURE te elimineren diploïde populatie nodig als volgt (figuur 1).- Passage cellen in meerdere T75 kolven op de dag vóór de behandeling te tetraploidy induceren. Meestal, voor te bereiden van ten minste 5 x 10 6 cellen (1 x 10 6 cellen per fles) voor de inductie van tetraploïde cellen.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met medium dat 0,1 ug / ml DC voor 16-18 uur om cellen te arresteren in mitose. De tijd die nodig is om cellen in mitose arrestatie kan afhangen van doelcellen en worden bepaald door voorafgaande experimenten zoveel mitotische cellen te krijgen. Zo zou langzamer groeiende cellen worden behandeld met gelijkstroom gedurende langere tijd dan sneller groeiende cellen.
OPMERKING: als cellen behandeld te lang in deze stap, kunnen ze mitotische slippen ondergaan en zich aan de schotel oppervlak, waardoor het onmogelijk mitotische cellen door opschudding op te vangen in de volgende stap. - Verzamel DC-gearresteerd mitotische cellen door de shake-off methode, in which losjes aangehouden mitotische cellen worden verzameld door zacht schudden kolven en wassen met medium, gevolgd door centrifugeren (300 x g, 5 min). Tellen aantal cellen in geschikte omstandigheden in deze stap.
- Reseed verzameld mitotische cellen in 60 mm kweekschalen en behandelen cellen met 0,1 ug / ml DC gedurende nog 3 dagen. Zaad meer dan 1 x 10 6 mitotische cellen per schaal, omdat minder dan 10% van de cellen deze behandeling kan overleven.
- Vervang DC-bevattend medium met een drug-vrij medium en wacht tot cellen proliferatie, die meestal optreedt binnen 1 week te hervatten.
- Passage cellen vergelijkbaar met originele diploïde cellen.
3. Onderzoek van DNA Ploïdie
LET OP: Dit is een gevestigde procedure en een technische handleiding moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid.
- Harvest-cellen (5 x 05-01 oktober x 10 6) door incubatie van cellen met een oplossing conbevattende 0,05% trypsine en 0,02% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 ° C en trypsine te neutraliseren door medium dat 10% FBS.
- Centrifugeer cellen in medium en wassen door resuspenderen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min).
- Bereid cellen voor DNA-analyse met één van de volgende twee methoden
- Werkwijze voor het analyseren van niet gefixeerde cellen 10
Opmerking: Deze methode kan worden uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare kit voor celcyclusanalyse. Monsters bereid met deze methode moeten onmiddellijk worden geanalyseerd, omdat de cellen niet in de procedure worden gefixeerd en gekleurd kernen zal beschadigd na verloop van tijd.- Was de cellen met 40 mM citraatbuffer met 250 mM sucrose. Vervolgens cellen te behandelen met 250 pl 0,1% (v / v) Nonidet P40 en 30 ug / ml trypsine in 200 ui 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 pl 0,5 ug / ml trypsine inwibitor en 0,1 ug / ml RNase A in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 ul van 0,4 mg / ml propidiumjodide (PI) in 40 mM citraatbuffer bevattende 250 mM sucrose en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur celkernen vlek.
- Werkwijze voor de analyse van gefixeerde cellen
- Fix cellen met 80% ethanol door het suspenderen van cellen in 1 ml PBS, het toevoegen van 4 ml 100% EtOH druppelsgewijs onder mengen de celsuspensie en laat het bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Cellen in dit fixeermiddel kan meerdere weken bewaard bij -20 ° C.
- Was de cellen door ze te resuspenderen in 5 ml PBS, gevolgd door centrifugatie (300 x g, 5 min). Behandel de cellen met 0,5 mg / ml RNase A en vlekken ze met 50 ug / ml propidiumjodide (PI) (475 pl 0,5 mg / ml RNase A en 25 ui 1 mg / ml PI) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Werkwijze voor het analyseren van niet gefixeerde cellen 10
- Analyseer DNA-gehalte van thij cellen met behulp van een flowcytometer met een 488 nm laser en rode kanaal emissie-filter (lange pass> 610 nm). Analyseren van een referentiemonster bereid uit echte diploïde cellen tegelijk te ploïdie van de doelcellen te beoordelen.
- Alternatief voeg fluorescentie standaard kralen om de fluorescentie-intensiteit verhouding van diploïde cellen versus de korrels beoordelen. Gebruik de 'pulse hoogte versus pulsbreedte' optie van de flowcytometer om onderscheid te maken tussen enkele tetraploïde cellen en massa's van diploïde cellen 11.
4. Onderzoek van chromosoom Telt en Karyotype Analyse
LET OP: Dit zijn allemaal gevestigde procedures en een technische handleiding of protocollen van de fabrikant moet voor gedetailleerde procedures en technische tips worden aangeduid.
- Behandel exponentieel groeiende cellen met 0,1 ug / ml DC 4 uur om cellen te arresteren in metafase.
- Bereid chromosoom slides.
- Centrifugeer cellen in medium (300 xg, 5 min) en behandel met hypotone oplossing (5 ml 0,075 M KCl) bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Fix en te schorten cellen in fixatief Carnoy's (methanol: azijnzuur = 3: 1).
- Cellen uitgespreid op een glasplaatje druppelsgewijs een klein volume (25-35 pi) van celsuspensie. Aanvullende stappen zoals blootstelling aan hete stoom kan nodig zijn chromosoom verbeteren verspreiden.
- Chromosoom telt.
- Stain cellen met 5% Giemsa-oplossing (of 5 ug / ml PI bevattende 0,5 mg / ml RNase A fluorescentiemicroscopie) gedurende 15 - 20 min.
- Digitaal fotograferen ten minste 50 metafase.
- Tellen aantal chromosomen per cel met behulp van een beeldanalyse Software na handmatige scheiding van het aanraken en overlappende chromosomen met behulp van een foto-editing software. Hoewel chromosoom nummer handmatig kan worden gescoord, wordt geautomatiseerd scoren aanbevolen.
- karyotype analyse
LET OP: Deze analyse moet worden uitgevoerd door een vakman of een professioneel bedrijf.- Stain cellen volgens een standaard G-banding techniek 12.
- Analyseer chromosomen standaard karyograms 12 te maken.
- mFISH
OPMERKING: Deze stap is optioneel en moet worden uitgevoerd indien nodig.- Vlek cellen met behulp multicolor FISH probes voor menselijke chromosomen volgens het protocol van de 13 fabrikant.
- Analyseer chromosomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte filters en software voor mFISH analyse 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze ervaring, kunnen TIG-1-cellen bijna volledig tetraploïde worden gemaakt door eenvoudige continue behandeling met 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen (Figuur 2A). Daarentegen andere fibroblast stammen, zoals BJ of IMR-90 en TIG-HT cellen, werd een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties na dezelfde behandeling, en isolatie van mitotische cellen door de schok uit staat moet in de loop DC behandeling (gewoonlijk 16-18 uur na de start van de behandeling) (figuur 2B, C). Na een aanvullende behandeling met gelijkstroom gedurende 3 dagen cellen ondergingen groeistop en vertoonde grote, afgeplatte morfologie gedurende enkele dagen. Binnen één week in het algemeen kleine prolifererende cellen voorkwam op de grote platte cellen (Figuur 3). Cellen werden bijna volledig tetraploïde in 2-3 weken na DC behandeling. Het modale aantal chromosomen in de gevestigde tetraploïde cellen was 92 in de meeste gevallen, except dat een van de gevestigde van TIG-HT tetraploïde cellen cellijnen had 91 chromosomen in de meeste cellen (figuur 4). Gevestigde tetraploïde cellen groeiden op bijna dezelfde snelheid als diploïde cellen (Figuur 5). Tetraploïde vastgesteld van niet-geïmmortaliseerde cellen cellijnen vertoonden een ongeveer gelijke replicatieve levensduur als de oorspronkelijke diploïde cellen, terwijl die van geïmmortaliseerde cellen leek ook onsterfelijk (figuur 5) zijn. Vastgesteld op basis van non-vereeuwigd TIG-1-cellen tetraploïde cellen vertoonden een normaal karyotype, behalve voor het hebben van een tetraploïde aantal chromosomen (Figuur 6 bovenste paneel), terwijl die van vereeuwigd TIG-1 (TIG-HT) cellen vertoonden nogal ingewikkeld klonale afwijkingen (figuur 6 middelste en onderste panelen). De frequentie van klonale afwijkingen in deze cellen (TIG-HT-4N) steeg van 2,5 afwijkingen per cel bij 255 populatieverdubbelingstijd niveaus (PDL) tot 5,2 afwijkingen per cel bij 450 PDLmet herhaalde subcultuur.
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol voor de inductie van Tetraploidy. Tetraploide cellen met minimale verontreiniging van diploïde cellen te verkrijgen, een combinatie van mitotische shake-off en DC behandeling nodig voor de meeste cellijnen (onderste afbeelding), terwijl sommige celstammen (bijvoorbeeld TIG-1) bijna volledig tetraploïde door continue behandeling kan veranderen met demecolcine (bovenste afbeelding). 1) behandelen cellen in T75 flessen (ten minste 5 x 10 6) met 0,1 ug / ml DC voor 16-18 uur (de tijd moet worden bepaald door voorafgaande experimenten) cellen arrestatie in mitose. 2) Verzamel mitotische cellen door de shake-off methode en reseed in 60 mm cultuur gerechten. 3) Behandel cellen met 0,1 ug / ml DC gedurende nog 3 dagen. 4) Incubeer cellen in drug-vrij medium (meestal cellen hervatten proliferation binnen 1 week). Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: DNA histogrammen van fibroblasten Voor en na behandelingen voor Inductie van Tetraploidy. (A) TIG-1 cellen. Deze cellijn wordt tetraploïde door eenvoudige continue behandeling met 0,1 ug / ml DC voor 4 dagen. (B) BJ-cellen. Omdat deze cellijn wordt een mengsel van diploïde en tetraploïde populaties volgende eenvoudige behandeling met DC (links panelen), isolatie van mitotische cellen door afschudden is nodig tijdens de DC behandeling om tetraploïde cellen (rechts panelen) vast te stellen. (C) TIG-HT (telomerase-geïmmortaliseerde TIG-1) cellen. Deze cellen moeten ook worden bereid door een kam zoek van DC behandeling en schud-off voor de oprichting van tetraploïde cellen. Cijfers in de histogrammen vertegenwoordigen de tijd (dagen) na het verwijderen van geneesmiddelen. De abscis DNA-gehalte (C, complement). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve Microfoto van BJ cellen behandeld met DC. (A) BJ cellen behandeld met 0,1 ug / ml DC voor 16 uur. Veel cellen gearresteerd in mitose kan worden gezien. (B) Het einde van de DC-behandeling. Bijna alle cellen zijn groei gearresteerd. (C) 7 dagen na DC behandeling. Kleine prolifererende cellen bij grote platte cellen zichtbaar. (D) 14 dagen na de behandeling DC. Cellen actief groeiende. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vertegenwoordiger Microfoto van chromosomen en Histogrammen van chromosoom nummer voor Tetraploïde Cellen Opgericht Van elke cel Strain. Top, middelste en onderste panelen vertegenwoordigen tetraploïde cellen vastgesteld op basis van TIG-1 (2 weken na de behandeling DC), BJ (2 weken na DC behandeling) en TIG-HT (7 weken na de DC behandeling) cellen respectievelijk. Chromosomen werden gescoord in ten minste 50 metafasen. Cijfers in histogrammen zijn modale chromosoom nummers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg "/>
Figuur 5: Representatieve Groei Profielen van Human fibroblasten (diploïde cellen) en Tetraploïde Cellen Opgericht van elke cel Strain. Links, midden en rechts panelen tonen groei profielen van originele TIG-1, BJ en TIG-HT-cellen (open markers) en die van tetraploïde cellen vastgesteld op basis van elke cel stam (gesloten markers). Cellen werden tweemaal per week gepasseerd en PDL's werden berekend uit celaantallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve Karyograms door G-banding en mFISH. Bovenste paneel toont een karyogram door G-banding van gevestigde van TIG-1 tetraploïde cellen (2 weken na de behandeling DC). Middelste en onderste panelen tonenkaryograms door mFISH voor gevestigde van TIG-HT-cellen (15 en 41 weken na de behandeling DC) tetraploïde cellen. Karyotypes waren gebaseerd op 10 cellen (TIG-1) of 20 cellen (TIG-HT). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een groot probleem bij inductie van tetraploidy uit diploïde cellen door chemische middelen, door cytokinese remmers of spindel remmers, is dat cellen vaak een mengsel van diploïde en tetraploïde bevolkingen en tetraploïde cellen moeten worden gescheiden van diploïde cellen. De meest voorkomende methoden voor het isoleren van een tetraploïde bevolking vrij van diploïde cellen gebruiken FACS of het klonen door beperkende verdunning. Echter, deze procedures zijn omslachtig en niet gemakkelijk uit te voeren. In dit rapport presenteren we een nieuw protocol bij proliferatieve tetraploïde cellen vrij is van een diploïde populatie van normale humane fibroblasten vast te stellen. Het protocol maakt gebruik van spindel gif DC voor het arresteren van diploïde cellen in mitose, en arresteerde mitotische cellen worden gescheiden door schudden-off van diploïde interfase cellen, die gehecht aan het gerecht oppervlak. Verzamelde cellen worden behandeld met DC gedurende nog 3 dagen en diploïde mitotische cellen omzetten G1 tetraploïde cellen door deze langdurige behandeling DC vermoedelijk by checkpoint aanpassing (ook wel mitotische slippen). Deze cellen herstart celgroei als tetraploïde cellen na groeistop voor een aantal dagen van verwijdering drug.
Een voordeel van deze werkwijze is dat de procedures relatief eenvoudig en haalbaar opzichte van die met FACS of klonen te isoleren tetraploïde cellen. Beperkingen van de methode zijn de volgende. Toepasbaarheid op andere dan fibroblasten celtypes zoals epitheelcellen, is onbekend. Dit moet worden bevestigd toekomstige studies. Een kleine diploïde populatie zou in sommige gevallen blijven. Echter, deze cellen hebben de neiging af te nemen met een seriële passage. Als een grotere diploïde populatie aanhoudt nadat DC behandeling, een hogere concentratie van DC (1,2-1,5 ug / ml) of langere behandeling met DC na schudden-off (4 dagen in plaats van 3 dagen) kan het resultaat te verbeteren.
De meest kritische stappen in dit protocol zijn de volgende. Ten eerste behandelingstijd met DC voor eenrresting cellen in mitose voordat shake-off is van cruciaal belang. Hoewel deze behandeling lang genoeg moet zijn om zoveel mitotische cellen te verzamelen mogelijke behandeling te lang kan leiden mitotische slippen en hechting aan de schotel oppervlak, waardoor het onmogelijk wordt de mitotische cellen te verzamelen door afschudden. Omdat een geschikte tijd voor de maximale terugwinning van mitotische cellen kan afhangen van de doelcellen, dient te worden vastgesteld door voorafgaande experimenten. Ten tweede, het afschudden stap om mitotische cellen te scheiden van interfase cellen is ook kritisch. In deze stap, diploïde mitotische cellen die losjes gehecht aan het schaaloppervlak, verzameld door voorzichtig schudden van de flessen, gevolgd door centrifugatie. Deze mitotische shake-off scheidt mitotische cellen gearresteerd door DC uit gehandeld interfase cellen die de oorsprong van de besmetting later zou kunnen zijn door de diploïde bevolking. Schudden extreem kunnen borrelen van het medium, welke cellen loslaten van interfase cellen kunnen beschadigen, en kan leiden, resulting verontreinigd diploïde cellen. Een andere factor die het succes van deze werkwijze kan beïnvloeden is het kweekmedium. Omdat robuuste groei stimulatie lijkt noodzakelijk voor het herstel van proliferatie na DC behandeling te zijn, moet voedselrijke medium zoals MEM-α worden gebruikt om de proliferatie van tetraploïde cellen te ondersteunen. FBS toenemende concentratie 20% bij de laatste stap van inductie van tetraploïde cellen (2.2.5) kan verhogen ook het succes van deze werkwijze.
Met dit protocol, we zijn tot dusver geproduceerd tetraploïde cellen van de humane fibroblast stammen TIG-1, BJ, IMR-90 en telomerase-geïmmortaliseerde TIG-1 tot nu 14-16. Van deze cellijnen, TIG-1 is vrij ongebruikelijk omdat deze cellijn wordt bijna volledig tetraploïde bij voortdurende behandeling met gelijkstroom zonder schok-off, voor 4 dagen. De reden waarom alleen TIG-1 cellen volledig tetraploïde als gevolg van eenvoudige behandeling met DC is onbekend. mogelijke TOELICHTInaties kan zijn dat een aanzienlijk deel van de cellen van andere arrestaties diploïde G1 fase bij behandeling met DC en hervat proliferatie na behandeling, terwijl (1) TIG-1 cellen niet G1 arrest met dezelfde behandeling, of (2) een populatie van TIG-1-cellen arresteert onomkeerbaar bij G1 onder dezelfde behandeling en doet proliferatie daarna niet meer te hervatten. In elk geval kunnen verschillende gevoeligheden van de G1 controle punt DC verantwoordelijk voor de verschillende gedragingen van de cellen na continue behandeling met gelijkstroom.
Bij het onderzoeken van de etiologische betekenis van tetraploidy in tumorigenese, veel onderzoekers hebben grote bezorgdheid over de status van het p53-gen in tetraploïde cellen, omdat is voorgesteld dat tetraploidy induceert p53-afhankelijke groeistop van cellen, welke genoemd de "tetraploidy checkpoint" 17-20. Als deze hypothese klopt, moet p53 signalering in prolifererende tetraploïde cellen worden geïnactiveerd. Echter,opgericht door onze protocol tetraploïde cellen lijken functioneel p53 ondanks groeit op bijna dezelfde snelheid als diploïde cellen 15,16. De reden voor deze discrepantie is momenteel niet bekend, en het belang van p53 inactivatie in de proliferatie van tetraploïde cellen moeten juist toekomstige studies onderzocht. In feite is de aanwezigheid van een tetraploidy controlepost met p53 functioneert blijft controversieel 21-23.
Hoewel niet-getransformeerde polyploïde cellen die kunnen voortplanten in vitro zijn onmisbaar voor een gedetailleerde analyse van de chromosomale instabiliteit en de oncogene potentieel van polyploïde cellen, zoals cellen hebben tot nu toe zelden beschikbaar zijn. Ons protocol een eenvoudige en werkbare methode proliferatieve tetraploïde cellen richten van normale humane fibroblasten, die een bruikbaar model voor het bestuderen van de mechanismen die leiden tot transformatie van polyploïde menselijke cellen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financieel belang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M.
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D.
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
