Introduction
Poliploidia foi observada não só em tecidos especializados de espécies de mamífero, mas também de uma variedade de condições patológicas, como o cancro e doenças degenerativas. Células poliplóides (principalmente tetraplóides) são muitas vezes observada em lesões pré-neoplásicas de tecidos humanos, tais como esófago 1,2 ou lesões intra-epiteliais escamosas de Barrett, do colo do útero 3,4, e foram considerados para ser a fonte de células malignas aneuploides nesses tecidos 5 , 6. Embora seja sugerido que a conversão de células tetraplóides para aneuploides poderia ser um evento essencial nas fases iniciais de tumorigénese, os mecanismos envolvidos no presente processo não são completamente compreendidos. Isto é em parte porque nenhum modelo in vitro tem sido disponível onde as células humanas não transformadas poliplóides pode se propagar.
Alguns investigadores induziram tetraploidia em células epiteliais humanas não transformadas através da geração de células binucleadas por INHibiting citocinese 7-9. Neste método, no entanto, as células diplóides desnecessárias devem ser eliminadas por activadas por fluorescência de células (FACS) 7,8 ou clonagem por diluição limitante 9. Porque esses procedimentos são trabalhosos e não é fácil de realizar, métodos mais simples para estabelecer células tetraplóides não transformadas são desejados para a investigação neste domínio.
No presente relatório, nós descrevemos um protocolo para estabelecer células tetraplóides de proliferação de fibroblastos humanos normais ou fibroblastos humanos imortalizados-telomerase através de procedimentos relativamente simples. Os procedimentos usar fuso demecolcina veneno (DC) para prender células diplóides na mitose e células mitóticas recolhidos por agitando fora são ainda tratados com DC. células mitóticas diplóides tratados com DC por tempo prolongado converter em células G1 tetraplóides, e essas células proliferar como células tetraplóides após a paragem do crescimento durante vários dias após a remoção de drogas. Este protocolo prevêum método eficiente para a criação de um modelo útil para estudar a relação entre a instabilidade dos cromossomas e o potencial oncogénico de células humanas poliplóides.
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Protocol
Cultura 1. celular
- Obter as células para induzir tetraploidia. Até à data, foi confirmado que esta técnica pode ser aplicada a linhas de células humanas de fibroblastos TIG-1, BJ, IMR-90 e da telomerase-imortalizada TIG-1 (TIG-HT).
- Cultivar células em meio essencial mínimo com modificação α ou qualquer outro meio de cultura celular adequado para o tipo de célula a ser estudada suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), por incubação numa atmosfera de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. células de passagem a cada 3 ou 4 dias não deve exceder a densidade subconfluentes.
NOTA: O nível de duplicação da população (PDL) deve ser calculado a cada vez em passaging para avaliar o crescimento celular e idade celular. PDL pode ser calculado a partir do número de células semeadas em um prato (N1) e o número de células colhidas na próxima Passaging (N2) com a seguinte fórmula (X é o PDL inicial). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2
2. Indução e Thisbelecimento de células tetraplóides de fibroblastos diplóides
- Induzir tetraploidia sem shake-off.
NOTA: Algumas estirpes de células (por exemplo, TIG-1) pode tornar-se quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo com demecolcina (DC) como se segue.- células de passagem para uma ou duas placas de 100 mm no dia antes do tratamento para induzir tetraploidia. Geralmente, preparar 5 x 10 5 a 1 x 10 6 culas por prato para a indução de células tetraplóides.
- Tratar as células em crescimento exponencial com meio contendo 0,1 ug / ml CC durante 4 dias.
- Substituir DC contendo meio com meio isento de fármaco e incubar as células numa atmosfera de 5% (v / v) de CO2 a 37 ° C. As células normalmente retomar a proliferação dentro de 1 semana.
- Induzir tetraploidia com shake-off.
NOTA: A maioria das células tornam-se uma mistura de populações diplóides e tetraplóides como um resultado do tratamento com CC simples descrito acima (2.1). Portanto, algumas modificações do pPROCEDIMENTO para eliminar uma população diplóide são necessários os seguintes (Figura 1).- células de passagem em vários T75 frascos o dia antes do tratamento para induzir tetraploidia. Geralmente, preparam-se pelo menos 5 x 10 6 células (1 X 10 6 células por frasco) para indução de células tetraplóides.
- Tratar as células em crescimento exponencial com meio contendo 0,1 ug / ml CC durante 16 - 18 h, para reter as células em mitose. O tempo necessário para reter as células em mitose pode depender de células alvo e deve ser determinado por experiências preliminares para obter tantas células mitóticas quanto possível. Por exemplo, as células de crescimento mais lento deve ser tratada com DC durante mais tempo do que as células de crescimento mais rápido.
NOTA: Se as células são tratadas por muito tempo nesta etapa, eles podem sofrer derrapagem mitótico e aderir à superfície do prato, tornando impossível para coletar células mitóticas por shake-off na próxima etapa. - Recolha células mitóticas DC-presos pelo método shake-off, no which células mitóticas frouxamente aderentes são recolhidas por agitação suave dos frascos e a lavagem com o meio, seguido por centrifugação (300 xg, 5 min). Contar o número de células por um método apropriado nesta etapa.
- Repropagação células mitóticas recolhidas em placas de cultura de 60 mm e o tratamento de células com 0,1 ug / ml CC por um período adicional de 3 dias. Semente mais do que 1 x 10 6 células mitóticas por placa, porque menos de 10% das células podem sobreviver a este tratamento.
- Substituir DC contendo meio com meio isento de droga e esperar para as células a retomar a proliferação, o que geralmente ocorre dentro de 1 semana.
- células de passagem de forma semelhante às células diplóides originais.
3. Análise do ADN Ploidia
NOTA: Este é um procedimento bem estabelecido e um manual técnico deve ser referido para procedimentos detalhados e dicas técnicas.
- Células colheita (5 x outubro 5-1 x 10 6) através da incubação de células com uma solução contenção 0,05% de tripsina e 0,02% de EDTA durante 10 minutos a 37 ° C, e neutralizar a tripsina por meio contendo FBS a 10%.
- Centrifugar as células em meio e lavá-las por ressuspensão em 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) seguido por centrifugação (300 xg, 5 min).
- Preparar células para análise de ADN por um dos dois métodos seguintes
- Um método para analisar as células não fixadas 10
NOTA: Este método pode ser realizado utilizando um kit disponível comercialmente para análise do ciclo celular. As amostras preparadas com este método devem ser analisadas imediatamente, porque as células não são fixos no procedimento e corados núcleos vai ficar danificado ao longo do tempo.- Lavar as células com tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose. Subsequentemente, o tratamento de células com 250 ul de 0,1% (v / v) de Nonidet P40 e 30 ug / ml de tripsina em tampão de citrato 200 ul de 40 mM contendo sacarose 250 mM durante 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar 200 uL de 0,5 ug / mL de tripsina INHibitor e 0,1 ug / ml de RNase A em tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose, e incuba-se as células durante 10 min a temperatura ambiente.
- Adicionar 200? L de 0,4 mg / mL de iodeto de propídio (PI) em tampão de citrato 40 mM contendo 250 mM de sacarose, e incuba-se as células durante 10 minutos à temperatura ambiente para corar os núcleos das células.
- Um método para a análise de células fixadas
- Fixar as células com etanol a 80% por células suspensão em 1 mL de PBS, adição de 4 ml de EtOH a 100%, gota a gota, enquanto a mistura da suspensão de células e deixando-o à temperatura ambiente durante 30 min. Células nesta fixador pode ser armazenado a -20 ° C durante várias semanas.
- Lave as células por ressuspensão em 5 ml de PBS seguido de centrifugação (300 xg, 5 min). Tratar as células com 0,5 mg / ml de RNase A e manchar os com iodeto de 50 ug / mL de propídio (PI) (475 ul de 0,5 mg / ml de ARNase A e 25 uL de 1 mg / mL de PI) durante 30 min à temperatura ambiente.
- Um método para analisar as células não fixadas 10
- Analisar o conteúdo de DNA de tele células utilizando um citómetro de fluxo com um laser de 488 nm e filtro de emissão de canal vermelho (tempo passar> 610 nm). Analisar uma amostra de referência preparada a partir de células diplóides genuínos ao mesmo tempo para avaliar ploidia das células alvo.
- Alternativamente, adicionar fluorescência grânulos padrão para avaliar a relação da intensidade de fluorescência das células diplóides versus os grânulos. Use a 'altura do pulso largura de pulso vs.' opção do citômetro de fluxo para discriminar entre as células tetraplóides individuais e aglomerados de células diplóides 11.
4. Exame de contagem de cromossomos e análise do cariótipo
NOTA: Estes são todos os procedimentos bem estabelecidos e um manual técnico ou protocolos do fabricante deve ser referido para procedimentos detalhados e dicas técnicas.
- Tratar as células em crescimento exponencial com 0,1 ug / ml CC durante 4 h para prender células em metafase.
- Preparar lâminas de cromossomos.
- centrifugar células em meio (300 xg, 5 min) e tratar com uma solução hipotónica (5 ml de 0,075 M de KCl) a 37 ° C durante 10 min.
- Fix e suspender as células em fixador de Carnoy (metanol: ácido acético = 3: 1).
- Espalhe células numa lâmina de vidro deixando cair um pequeno volume (25-35 mL) de suspensão de células. medidas adicionais, tais como a exposição ao vapor quente pode ser necessário para melhorar cromossomo espalhando.
- contagem de cromossomos.
- As células são coradas com solução Giemsa 5% (ou 5 ng de PI / ml contendo 0,5 mg / ml de ARNase A para a microscopia de fluorescência) por 15 - 20 min.
- fotografar digitalmente pelo menos 50 células em metafase.
- Contagem número de cromossomos por célula usando um softwa análise de imagemre após a separação manual de tocar e sobreposição cromossomos usando um software de edição de fotos. Embora o número de cromossomos podem ser marcados manualmente, pontuação computadorizado é recomendado.
- A análise do cariótipo
NOTA: Esta análise deve ser realizada por um técnico treinado ou uma companhia profissional.- Células de manchas de acordo com uma técnica G-bandas padrão de 12.
- Analisar cromossomos para fazer cariogramas padrão de 12.
- mFISH
NOTA: Este passo é opcional e deve ser realizada, se necessário.- Células mancha usando sondas FISH multicolor para cromossomos humanos de acordo com o protocolo do fabricante 13.
- Analise cromossomas utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados e um software para análise mFISH 13.
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Representative Results
Na nossa experiência, as células TIG-1 pode ser feito quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo simples com 0,1 ug / ml CC durante 4 dias (Figura 2A). Em contraste, outras estirpes de fibroblastos, tais como BJ ou IMR-90, e as células TIG-HT, tornou-se uma mistura de diplóide e populações tetraplóides seguindo o mesmo tratamento, e o isolamento de células mitóticas por o método shake-off é necessária durante o curso DC de tratamento (geralmente 16 - 18 h após o início do tratamento) (Figuras 2B, C). Após um tratamento adicional com DC durante 3 dias, as células foram submetidos a paragem do crescimento e exibiram grande, achatada morfologia durante vários dias. Dentro de uma semana, em geral, pequenas células em proliferação apareceu entre as grandes células achatadas (Figura 3). As células tornaram-se quase completamente tetraplóide em 2 - 3 semanas após o tratamento DC. O número modal de cromossomas nas células tetraplóides estabelecidos foi de 92 na maioria dos casos, except que uma das linhas de células estabelecidas a partir de células tetraplóides TIG-HT foi de 91 cromossomas na maioria das células (Figura 4). Células tetraplóides estabelecidos cresceu em quase a mesma taxa que as células diplóides (Figura 5). Linhas de células estabelecidas a partir de células tetraplóides não imortalizadas mostrou um tempo de vida replicativo aproximadamente iguais como as células diplóides originais, enquanto que aqueles a partir de células imortalizadas parecia ser também imortais (Figura 5). Células tetraplóides estabelecidas a partir de células TIG-1 não imortalizadas mostrou um cariótipo normal, excepto por ter um número de cromossomas tetraplóide (Figura 6 painel superior), enquanto que aqueles a partir imortalizada TIG-1 (TIG-HT), as células mostraram alteração clonal bastante complicadas (Figura 6 meio e painéis inferiores). A freqüência de aberrações clonais nas últimas células (TIG-HT-4n) aumentou de 2,5 aberrações por célula em 255 populacionais dobrando níveis (PDLs) para 5,2 aberrações por célula a 450 PDLcom uma subcultura repetida.
Figura 1: Esquema Ilustração do protocolo de indução de tetraplóide. Para obter células tetraplóides com contaminação mínima de células diplóides, uma combinação de mitótico shake-off e tratamento DC é necessário para a maioria das estirpes de células (inferior ilustração), enquanto que algumas estirpes de células (por exemplo, TIG-1) pode tornar-se quase completamente tetraplóide por tratamento contínuo com demecolcina (ilustração superior). 1) o tratamento de células em frascos T75 (pelo menos 5 x 10 6) com 0,1 ug / ml CC durante 16 - 18 h (tempo deve ser determinado por experiências preliminares) para reter as células em mitose. 2) Recolha células mitóticas pelo método de shake-off e propagar novamente em 60 placas de cultura mm. 3) o tratamento de células com 0,1 ug / ml CC por um período adicional de 3 dias. 4) Incubar as células em meio isento de drogas (usualmente células p retomarroliferation dentro de 1 semana). As barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: DNA histogramas de fibroblastos Antes e após os tratamentos para indução de tetraplóide. (A) As células TIG-1. Esta estirpe celular torna-se tetraplóides por tratamento contínuo simples com 0,1 ug / ml CC durante 4 dias. Células (B) BJ. Porque esta estirpe célula torna-se uma mistura de populações diplóides e tetraplóides após tratamento simples com DC (painéis esquerdos), é necessário durante o tratamento DC isolamento de células mitóticas por agitação para estabelecer células tetraplóides (painéis da direita). Células (C) TIG-HT (TIG-1-telomerase imortalizada). Estas células também precisa ser preparado por um pente inação do tratamento DC e agitar-off para a criação de células tetraplóides. Numerais nos histogramas representam o tempo (dias) após a remoção do fármaco. A abcissa representa o teor de ADN (C, complemento). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fotomicrografias representativos de células BJ tratados com DC. (A) células BJ tratados com 0,1 ug / ml CC durante 16 h. Muitas células envolvidas na mitose pode ser visto. (B) A fim de tratamento DC. Quase todas as células são presos ao crescimento. (C) 7 dias após o tratamento DC. células em proliferação pequeno entre grandes células achatadas pode ser visto. (D) 14 dias após o tratamento DC. As células são em crescimento activo. e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Fotomicrografias representativas dos cromossomos e histogramas do número de cromossomos de células tetraploides estabelecida a partir de cada linhagem celular. Top, painéis de média e na baixa representam células tetraplóides estabelecidas a partir TIG-1 (2 semanas após o tratamento DC), BJ (2 semanas após o tratamento DC) e TIG-HT (7 semanas após o tratamento DC) células, respectivamente. Cromossomos foram marcados em pelo menos 50 metafases. Numerais em histogramas são números de cromossomos modais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5: Perfis de crescimento representativos de fibroblastos humanos (células diplóides) e células tetraploides estabelecida a partir de cada linhagem celular. Esquerda, centro e painéis da direita mostram perfis de crescimento de originais TIG-1, células BJ e TIG-HT (marcadores abertos) e os de células tetraplóides estabelecida a partir de cada linhagem celular (marcadores fechado). As células foram passadas duas vezes por semana e PDL foram calculados a partir do número de células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Representante cariogramas pelo G-faixas e mFISH. painel superior mostra uma karyogram pelo G-bandas de células tetraplóides estabelecidas a partir TIG-1 (2 semanas após o tratamento DC). painéis de média e na baixa mostrarcariogramas por mFISH para células tetraplóides estabelecidas a partir de células TIG-HT (15 e 41 semanas após o tratamento DC). Cariótipos foram baseados em células 10 (TIG-1) ou 20 células (TIG-HT). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um problema importante na indução de tetraploidia a partir de células diplóides por agentes químicos, quer por inibidores de citocinese ou por inibidores do fuso, é que as células tornam-se muitas vezes uma mistura de populações diplóides e tetraplóides, e células tetraplóides têm de ser separados a partir de células diplóides. abordagens mais comuns para isolamento de uma população de células tetraplóides livre diplóides utilizar FACS ou clonagem por diluição limitante. No entanto, esses procedimentos são trabalhosos e não é fácil de realizar. Neste relatório, nós apresentamos um novo protocolo para estabelecer células tetraplóides proliferativas livres de uma população diplóide de fibroblastos humanos normais. O protocolo usa fuso veneno DC para deter células diplóides na mitose, e prendeu células mitóticas são separadas por agitação-off a partir de células de interfase diplóides, que aderiram à superfície do prato. As células recolhidas são tratados com CC por um período adicional de 3 dias, e as células mitóticas diplóides para converter células tetraplóides G1 por este tratamento prolongado DC b presumivelmentey checkpoint adaptação (também chamado de deslizamento mitótico). Estas células reiniciar o crescimento de células como células tetraplóides após a detenção de crescimento para vários dias de remoção de drogas.
Uma vantagem deste método é que os processos são relativamente simples e viável em comparação com as que utilizam FACS ou clonagem para isolar células tetraplóides. As limitações do método são as seguintes. Aplicabilidade aos outros do que os fibroblastos tipos de células, tais como células epiteliais, é actualmente desconhecida. Este deve ser confirmado em estudos futuros. Uma pequena população diplóide pode permanecer em alguns casos. No entanto, estas células tendem a diminuir com passagens em série. Se uma população diplóide significativa persistir após o tratamento DC, uma concentração mais elevada de DC (1,2-1,5 ug / mL) ou de prolongar o tratamento com DC após o shake-off (4 dias em vez de 3 dias) pode melhorar o resultado.
Os passos mais críticos neste protocolo são as seguintes. Em primeiro lugar, o tempo de tratamento com CC, durante umrresting células em mitose antes shake-off é crítica. Embora este tempo de tratamento deve ser longa o suficiente para recolher o máximo de células mitóticas quanto possível, o tratamento por muito tempo pode causar o deslizamento mitótico e adesão à superfície do prato, tornando impossível para recolher as células mitóticas por agitação. Uma vez que um tempo apropriado para a recuperação máxima de células mitóticas pode depender das células alvo, deve ser determinado por experiências preliminares. Em segundo lugar, a etapa de agitação fora para separar células mitóticas partir de células de interfase também é crítica. Neste passo, as células mitóticas diplóides, que são fracamente aderidas à superfície do prato, são recolhidos por agitação suave dos frascos seguido de centrifugação. Este mitótico shake-off separa células mitóticas preso pela DC a partir de células de interfase aderidos que podem ser a origem da contaminação pela população diplóide mais tarde. Tremer violentamente pode causar borbulhante do meio, o que poderia danificar as células, e também destacamento de células em interfase, resulting na contaminação de células diplóides. Outro fator que pode afetar o sucesso deste método é o meio de cultura. Porque a estimulação do crescimento robusto parece ser necessária para a recuperação de proliferação após tratamento DC, meio rico em nutrientes, tais como MEM-α deve ser usado para suportar a proliferação de células tetraplóides. O aumento da concentração de FBS a 20% no passo final da indução de células tetraplóides (2.2.5) também pode aumentar o sucesso deste método.
Usando este protocolo, temos até à data produziu células tetraplóides a partir das estirpes de fibroblastos humanos TIG-1, BJ, IMR-90 e-telomerase imortalizado TIG-1 até agora a 14-16. Entre estas estirpes celulares, TIG-1 é bastante incomum, porque esta estirpe célula torna-se quase completamente tetraploid quando tratados continuamente com DC, sem shake-off, durante 4 dias. A razão pela qual apenas as células TIG-1 tornam-se completamente tetraplóide como um resultado de tratamento simples com DC é actualmente desconhecida. EXPOSIÇÃO possívelnações pode ser que uma proporção significativa de células de outras prisões tipos em fase G1 diplóide quando tratados com DC e retoma a proliferação após o tratamento, enquanto que (1) as células TIG-1 não prender na G1 com o mesmo tratamento, ou (2) um população de células TIG-1 irreversivelmente prende em G1 sob o mesmo tratamento e não retomar a proliferação posteriormente. Em qualquer caso, as diferentes sensibilidades do ponto de controlo G1 para DC pode ser responsável pelos comportamentos diferentes de células após tratamento contínuo com DC.
Ao investigar o significado etiológico da tetraploidia na tumorigénese, muitos investigadores têm grandes preocupações acerca do estado do gene p53 em células tetraplóides, porque tem sido proposto que tetraploidia induz a paragem do crescimento dependente de p53 de células, o que é denominado o "ponto de verificação tetraploidia" 17-20. Se esta hipótese estiver correta, p53 de sinalização na proliferação de células tetraplóides deve ser inactivado. Contudo,células tetraplóides estabelecidas pelo nosso protocolo parecem ter p53 funcional apesar do crescimento em quase a mesma taxa que as células diplóides 15,16. A razão para esta discrepância não é conhecido no presente, e o significado de inactivação p53 na proliferação de células tetraplóides deve ser examinado com precisão em estudos futuros. Na verdade, a presença de um posto de controle, que funciona através de tetraploidia p53 permanece controverso 21-23.
Embora as células poliplóides não transformadas que podem se propagar in vitro são imprescindíveis para a análise detalhada de instabilidade cromossômica eo potencial oncogénico de células poliplóides, essas células têm, até agora raramente estão disponíveis. Nosso protocolo proporciona um método simples e possível estabelecer células tetraplóides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normais, o que poderia ser um modelo útil para estudar os mecanismos que conduzem à transformação de células humanas poliplóides.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm qualquer interesse financeiro que faça concorrência.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
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