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Developmental Biology

Nontransformed मानव fibroblasts से Proliferative टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों की स्थापना

Published: January 8, 2017 doi: 10.3791/55028
Automatic Translation
1, 2
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Introduction

Polyploidy स्तनधारी प्रजातियों के विशेष ऊतकों में भी, लेकिन इस तरह के कैंसर और अपक्षयी रोगों के रूप में रोग की स्थिति की एक किस्म में ही नहीं देखा गया है। Polyploid (ज्यादातर टेट्राप्लोइड) कोशिकाओं अक्सर ऐसे बैरेट घेघा 1,2 या स्क्वैमस गर्भाशय ग्रीवा 3,4 के अंतःउपकला घावों के रूप में मानव ऊतकों के preneoplastic घावों में मनाया जाता है, और उन ऊतकों 5 में घातक aneuploid कोशिकाओं का स्रोत माना गया है , 6। हालांकि यह सुझाव दिया है कि aneuploid कोशिकाओं को टेट्राप्लोइड के रूपांतरण tumorigenesis के प्रारंभिक दौर में एक महत्वपूर्ण घटना हो सकती है, इस प्रक्रिया में शामिल तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं। यह आंशिक रूप क्योंकि कोई इन विट्रो मॉडल उपलब्ध किया गया है, जहां nontransformed polyploid मानव कोशिकाओं का प्रचार कर सकते हैं।

कुछ शोधकर्ताओं द्वारा INH binucleated कोशिकाओं की पीढ़ी के माध्यम से nontransformed मानव उपकला कोशिकाओं में tetraploidy प्रेरित किया हैcytokinesis 7-9 ibiting। इस विधि में, हालांकि, अनावश्यक द्विगुणित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा समाप्त किया जाना चाहिए 7.8 या कमजोर पड़ने 9 सीमित द्वारा क्लोनिंग। क्योंकि इन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने और श्रमसाध्य आसान नहीं हैं, सरल तरीकों की स्थापना के लिए nontransformed टेट्राप्लोइड कोशिकाओं को इस क्षेत्र में अनुसंधान के लिए वांछित हैं।

वर्तमान रिपोर्ट में, हम अपेक्षाकृत सरल प्रक्रियाओं द्वारा सामान्य मानव fibroblasts या टेलोमिरेज-अमर मानव fibroblasts से proliferative टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रियाओं धुरी जहर demecolcine (डीसी) का उपयोग बँटवारा में द्विगुणित कोशिकाओं, और mitotic कोशिकाओं बंद मिलाते हुए आगे डीसी के साथ व्यवहार कर रहे हैं द्वारा एकत्र की गिरफ्तारी के लिए। द्विगुणित mitotic कोशिकाओं लंबे समय के लिए डीसी के साथ इलाज किया टेट्राप्लोइड G1 कोशिकाओं को बदलने, और इन कोशिकाओं को दवा हटाने के बाद कई दिनों के लिए विकास के रूप में गिरफ्तारी के बाद टेट्राप्लोइड कोशिकाओं पैदा करना। इस प्रोटोकॉल प्रदान करता हैगुणसूत्र अस्थिरता और polyploid मानव कोशिकाओं की ऑन्कोजेनिक क्षमता के बीच संबंध का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल बनाने के लिए एक कारगर तरीका।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. tetraploidy प्रेरित करने के लिए कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। तिथि करने के लिए यह पुष्टि की गई है कि इस तकनीक मानव fibroblast सेल लाइनों छूत-1, बी.जे., आईएमआर-90 और टेलोमिरेज-अमर छूत -1 (स्पर्श हिंदुस्तान टाइम्स) के लिए आवेदन किया जा सकता है।
  2. α संशोधन या किसी अन्य सेल संस्कृति के माध्यम से सेल प्रकार के लिए उपयुक्त 10% (वी / वी) गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) एक 5% में incubating द्वारा (v / साथ पूरक अध्ययन किया जा करने के लिए न्यूनतम आवश्यक मध्यम में कोशिकाओं को विकसित v) सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर माहौल। पारित होने कोशिकाओं subconfluent घनत्व पार करने के लिए हर 3 या 4 दिन नहीं।
    नोट: जनसंख्या दुगनी स्तर (पीडीएल) passaging पर हर बार सेल के विकास और सेल उम्र का मूल्यांकन करने के लिए गणना की जानी चाहिए। पीडीएल एक डिश (एन 1) और अगले passaging (एन 2) निम्न सूत्र (एक्स प्रारंभिक पीडीएल है) का उपयोग करने पर काटा सेल नंबर में वरीयता प्राप्त सेल नंबर से गणना की जा सकती है। पीडीएल = एक्स + (लॉग एन 1 - लॉग एन 2) / log 2

2. प्रेरण और एस्टाद्विगुणित fibroblasts से टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों के blishment

  1. मंथन बंद के बिना tetraploidy प्रेरित।
    नोट: कुछ सेल उपभेदों (जैसे छूत-1) लगभग पूरी तरह से टेट्राप्लोइड निरंतर उपचार से demecolcine (डीसी) के रूप में इस के साथ बन सकता है।
    1. दिन पर एक या दो 100 मिमी व्यंजन इलाज से पहले में पारित होने कोशिकाओं tetraploidy प्रेरित करने के लिए। आमतौर पर, टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की प्रेरण के लिए पकवान प्रति 5 एक्स 10 5 1 x 10 6 कोशिकाओं तैयार करते हैं।
    2. 4 दिनों के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी युक्त मध्यम के साथ तेजी से बढ़ कोशिकाओं को समझो।
    3. दवा मुक्त मध्यम के साथ डीसी युक्त मध्यम बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% (वी / वी) सीओ 2 माहौल में कोशिकाओं को सेते हैं। कोशिकाओं को आमतौर पर 1 सप्ताह के भीतर फिर से शुरू प्रसार।
  2. मंथन के साथ बंद tetraploidy प्रेरित।
    नोट: सबसे कोशिकाओं डीसी के साथ सरल उपचार का एक परिणाम के रूप में द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आबादी का एक मिश्रण के ऊपर (2.1) में वर्णित हो जाते हैं। इसलिए, पी के कुछ संशोधनोंrocedure को खत्म करने के रूप में (चित्रा 1) इस प्रकार एक द्विगुणित आबादी जरूरी हैं।
    1. कई T75 में पारित होने कोशिकाओं tetraploidy प्रेरित करने के लिए इलाज से पहले दिन बोतल। आमतौर पर, टेट्राप्लोइड कोशिकाओं के शामिल होने के लिए कम से कम 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं (कुप्पी प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं) तैयार करें।
    2. बँटवारा में कोशिकाओं की गिरफ्तारी के लिए 18 एच - 16 के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी युक्त मध्यम के साथ तेजी से बढ़ कोशिकाओं को समझो। समय बँटवारा में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए आवश्यक लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर हो सकता है और संभव के रूप में कई mitotic कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, धीमी बढ़ कोशिकाओं में तेजी से बढ़ कोशिकाओं की तुलना में लंबे समय के लिए डीसी के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए।
      नोट: कोशिकाओं भी लंबे समय से इस चरण में लिए इलाज कर रहे हैं, वे mitotic फिसलन से गुजरना और पकवान सतह का पालन करना, यह असंभव अगले चरण में मंथन बंद करके mitotic कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए बना सकता है।
    3. हिला बंद विधि द्वारा डीसी को गिरफ्तार कर लिया mitotic कोशिकाओं लीजिए क मेंआईसीएच शिथिल पालन mitotic कोशिकाओं बोतल और मध्यम से धोने centrifugation द्वारा पीछा के कोमल झटकों (300 XG, 5 मिनट) द्वारा एकत्र कर रहे हैं। इस चरण में एक उचित विधि द्वारा सेल संख्या की गणना।
    4. 60 मिमी संस्कृति बर्तन में एकत्र mitotic कोशिकाओं Reseed और एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ कोशिकाओं का इलाज। अधिक से अधिक 1 एक्स 10 6 पकवान प्रति mitotic कोशिकाओं बीज क्योंकि कोशिकाओं के 10% से कम इस इलाज जीवित रह सकते हैं।
    5. डीसी युक्त बदलें दवा मुक्त मध्यम के साथ मध्यम और कोशिकाओं के प्रसार, जो आम तौर पर 1 हफ्ते के भीतर होता है फिर से शुरू करने के लिए इंतजार।
  3. इसी प्रकार मूल द्विगुणित कोशिकाओं को पारित होने कोशिकाओं।

3. डीएनए Ploidy की परीक्षा

नोट: यह एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रिया है और एक तकनीकी मार्गदर्शन विस्तृत प्रक्रिया और तकनीकी खरीदारों के लिए करने के लिए भेजा जाना चाहिए।

  1. हार्वेस्ट कोशिकाओं (5 x 10 5 - 1 x 10 6) एक समाधान चुनाव के साथ incubating कोशिकाओं द्वारा37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.05% और 0.02% trypsin EDTA taining, और 10% FBS युक्त मध्यम से trypsin बेअसर।
  2. मध्यम में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और फॉस्फेट बफर खारा के 5 एमएल (पीबीएस) centrifugation (300 XG, 5 मिनट) के बाद में resuspending द्वारा उन्हें धोने।
  3. निम्नलिखित दो तरीकों में से एक ने डीएनए विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को तैयार
    1. Unfixed कोशिकाओं 10 का विश्लेषण करने के लिए एक विधि
      नोट: इस विधि सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग किया जा सकता है। इस विधि के साथ तैयार नमूनों, तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए क्योंकि कोशिकाओं प्रक्रिया में तय की और दाग नाभिक समय के साथ क्षतिग्रस्त हो जाएगा नहीं कर रहे हैं।
      1. 40 मिमी साइट्रेट युक्त 250 मिमी सुक्रोज बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें। इसके बाद 200 40 की μL मिमी साइट्रेट कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 250 मिमी सूक्रोज युक्त बफर में 0.1% (वी / वी) Nonidet P40 30 माइक्रोग्राम / एमएल trypsin के 250 μL के साथ कोशिकाओं का इलाज।
      2. 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल trypsin INH के 200 μL जोड़ेकमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ibitor और 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल 40 मिमी साइट्रेट युक्त 250 मिमी सुक्रोज बफर में RNase एक, और सेते कोशिकाओं।
      3. 0.4 मिलीग्राम के 200 μL जोड़ें / 40mm साइट्रेट युक्त 250 मिमी सुक्रोज बफर में एमएल propidium आयोडाइड (पीआई), और सेल नाभिक दाग कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं।
    2. तय कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए एक विधि
      1. पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित द्वारा 80% इथेनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, 100% EtOH dropwise के 4 एमएल जोड़ने जबकि सेल निलंबन मिश्रण और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इसे छोड़ने। इस लगानेवाला में प्रकोष्ठों कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
      2. उन्हें पीबीएस के 5 एमएल में resuspending द्वारा कोशिकाओं को धो centrifugation (300 XG, 5 मिनट) द्वारा पीछा किया। 0.5 मिलीग्राम / एमएल RNase एक साथ कोशिकाओं का इलाज और उन्हें 50 माइक्रोग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई) (0.5 मिलीग्राम / एमएल RNase एक के 475 μL और 1 मिलीग्राम की 25 μL / एमएल पीआई) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए के साथ दाग।
  4. टी के डीएनए सामग्री का विश्लेषणवह एक 488 एनएम लेजर और लाल चैनल उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक प्रवाह cytometer का उपयोग कोशिकाओं (लंबी पारित> 610 एनएम)। लक्ष्य कोशिकाओं के ploidy आकलन करने के लिए एक ही समय में वास्तविक द्विगुणित कोशिकाओं से तैयार एक संदर्भ नमूना विश्लेषण।
    1. वैकल्पिक रूप से, द्विगुणित कोशिकाओं बनाम मोतियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात का आकलन करने के लिए प्रतिदीप्ति मानक मोती जोड़ें। कोशिकामापी एकल टेट्राप्लोइड कोशिकाओं और द्विगुणित 11 कोशिकाओं के झुरमुटों के बीच भेदभाव करने के लिए 'पल्स ऊंचाई बनाम पल्स चौड़ाई' प्रवाह के विकल्प का प्रयोग करें।

4. क्रोमोजोम मायने रखता है और कुपोषण विश्लेषण की परीक्षा

नोट: ये सभी अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाओं कर रहे हैं और एक तकनीकी मैनुअल या निर्माता के प्रोटोकॉल विस्तृत प्रक्रिया और तकनीकी खरीदारों के लिए करने के लिए भेजा जाना चाहिए।

  1. metaphase में कोशिकाओं की गिरफ्तारी के लिए 4 घंटे के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ तेजी से बढ़ रही कोशिकाओं को समझो।
  2. गुणसूत्र स्लाइड तैयार करें।
      5 कोशिकाओं) trypsinization द्वारा और FBS युक्त मध्यम में निलंबित।
    1. मध्यम में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (300 XG, 5 मिनट) और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर hypotonic समाधान (0.075 एम KCl के 5 एमएल) के साथ व्यवहार करते हैं।
    2. फिक्स और Carnoy लगानेवाला में कोशिकाओं को निलंबित (मेथनॉल: एसिटिक एसिड = 3: 1)।
    3. सेल निलंबन की - (35 μL 25) एक छोटी मात्रा छोड़ने के द्वारा एक गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं बिखरा हुआ है। इस तरह के गर्म भाप के लिए जोखिम के रूप में अतिरिक्त कदम प्रसार के गुणसूत्र में सुधार करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  3. गुणसूत्र मायने रखता है या कुपोषण विश्लेषण या स्वस्थानी संकरण में बहुरंगा प्रतिदीप्ति के लिए दाग कोशिकाओं (mFISH)।
    1. क्रोमोजोम मायने रखता है।
      1. 20 मिनट - 5% Giemsa समाधान (या 5 माइक्रोग्राम / एमएल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए 0.5 मिलीग्राम / एमएल RNase एक युक्त पीआई) 15 के लिए के साथ दाग कोशिकाओं।
      2. डिजिटल कम से कम 50 metaphase कोशिकाओं की तस्वीर।
      3. सेल प्रति गुणसूत्र संख्या की गणना एक छवि विश्लेषण का उपयोग कर Softwaछू और एक तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गुणसूत्रों ओवरलैपिंग के मैनुअल जुदाई के बाद फिर से। हालांकि गुणसूत्र संख्या मैन्युअल रन बनाए जा सकते हैं, कम्प्यूटरीकृत स्कोरिंग की सिफारिश की है।
    2. कुपोषण विश्लेषण
      नोट: इस विश्लेषण एक प्रशिक्षित तकनीशियन या एक पेशेवर कंपनी द्वारा किया जाना चाहिए।
      1. एक मानक जी बैंडिंग तकनीक 12 के अनुसार दाग कोशिकाओं।
      2. गुणसूत्रों का विश्लेषण मानक karyograms 12 बनाने के लिए।
    3. mFISH
      नोट: यह कदम वैकल्पिक है और यदि आवश्यक हो तो किया जाना चाहिए।
      1. दाग कोशिकाओं निर्माता प्रोटोकॉल 13 के अनुसार मानव गुणसूत्रों के लिए बहुरंगा मछली जांच का उपयोग।
      2. उपयुक्त फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और mFISH विश्लेषण 13 के लिए एक सॉफ्टवेयर का उपयोग गुणसूत्रों का विश्लेषण।

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Representative Results

हमारे अनुभव में, छूत-1 कोशिकाओं 4 दिनों के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी (2A चित्रा) के साथ सरल निरंतर उपचार से लगभग पूरी तरह से टेट्राप्लोइड बनाया जा सकता है। इसके विपरीत, इस तरह के बीजे या आईएमआर -90, और स्पर्श-HT कोशिकाओं के रूप में अन्य fibroblast उपभेदों, द्विगुणित और एक ही इलाज के बाद टेट्राप्लोइड आबादी, और शेक बंद विधि द्वारा mitotic कोशिकाओं के अलगाव का एक मिश्रण बन कोर्स के दौरान आवश्यक है (- 18 h उपचार की शुरुआत के बाद आमतौर पर 16) (आंकड़े 2 बी, सी) डीसी उपचार के। 3 दिन के लिए डीसी के साथ एक अतिरिक्त उपचार के बाद, कोशिकाओं के विकास गिरफ्तारी कराना पड़ा और बड़े प्रदर्शन किया, कई दिनों के लिए आकृति विज्ञान चपटा। सामान्य तौर पर एक सप्ताह के भीतर, छोटे proliferating कोशिकाओं (चित्रा 3) बड़े चपटा कोशिकाओं के बीच दिखाई दिया। 3 सप्ताह डीसी उपचार के बाद - प्रकोष्ठों लगभग 2 में पूरी तरह से टेट्राप्लोइड बन गया। स्थापित टेट्राप्लोइड कोशिकाओं में गुणसूत्र संख्या मोडल ज्यादातर मामलों में 92 था, उत्कृष्टतापीटी छूत-HT कोशिकाओं से स्थापित टेट्राप्लोइड सेल लाइनों की है कि एक कोशिकाओं के बहुमत में 91 गुणसूत्रों (चित्रा 4) था। स्थापित टेट्राप्लोइड कोशिकाओं द्विगुणित कोशिकाओं के रूप में लगभग एक ही दर (चित्रा 5) से बढ़ा है। टेट्राप्लोइड सेल लाइनों गैर-अमर कोशिकाओं से की स्थापना की, मूल द्विगुणित कोशिकाओं के रूप में एक लगभग बराबर replicative उम्र से पता चला है, जबकि भी अमर (चित्रा 5) होना प्रतीत होता है अमर कोशिकाओं से उन। टेट्राप्लोइड गैर-अमर छूत-1 कोशिकाओं से स्थापित कोशिकाओं, एक टेट्राप्लोइड गुणसूत्र संख्या (चित्रा 6 शीर्ष पैनल) होने अमर छूत -1 (स्पर्श हिंदुस्तान टाइम्स) से उन जबकि कोशिकाओं बल्कि जटिल प्रतिरूप aberrations से पता चला है के लिए (चित्रा 6 को छोड़कर एक सामान्य कुपोषण से पता चला मध्य और नीचे पैनल)। उत्तरार्द्ध कोशिकाओं में प्रतिरूप aberrations की आवृत्ति (स्पर्श-HT-4N) सेल प्रति 2.5 aberrations से 255 जनसंख्या दुगनी स्तर (PDLS) पर सेल प्रति 5.2 aberrations के लिए 450 पीडीएल में वृद्धि हुईबार-बार उपसंस्कृति के साथ।

आकृति 1
चित्रा 1: Tetraploidy की प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध चित्रण। द्विगुणित कोशिकाओं की न्यूनतम संदूषण के साथ टेट्राप्लोइड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, mitotic हिला बंद और डीसी उपचार का एक संयोजन, सबसे सेल उपभेदों (कम चित्रण) के लिए आवश्यक है, जबकि कुछ सेल उपभेदों (जैसे छूत-1) लगभग पूरी तरह से निरंतर उपचार से टेट्राप्लोइड बन सकता है demecolcine (ऊपरी उदाहरण) के साथ। बँटवारा में कोशिकाओं की गिरफ्तारी के लिए 18 घंटे (इस बार प्रारंभिक प्रयोगों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए) - 1) 16 के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ T75 बोतल (कम से कम 5 एक्स 10 6) में कोशिकाओं को समझो। 2) हिला बंद विधि द्वारा mitotic कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 60 मिमी संस्कृति बर्तन में reseed। 3) एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ कोशिकाओं को समझो। 4) दवा मुक्त माध्यम में कोशिकाओं (आमतौर पर कोशिकाओं को फिर से शुरू पी सेते1 सप्ताह के भीतर roliferation)। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Fibroblasts से पहले की और Tetraploidy की प्रेरण के लिए उपचार के बाद डीएनए Histograms। (ए) छूत-1 कोशिकाओं। यह सेल तनाव 4 दिनों के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ सरल निरंतर उपचार से टेट्राप्लोइड हो जाता है। (बी) बीजे कोशिकाओं। क्योंकि इस सेल तनाव डीसी (बाएं पैनल) के साथ सरल इलाज के बाद द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आबादी का एक मिश्रण हो जाता है, बंद झटकों से mitotic कोशिकाओं के अलगाव टेट्राप्लोइड कोशिकाओं (सही पैनल) की स्थापना के लिए डीसी उपचार के दौरान आवश्यक है। (सी) छूत-HT (टेलोमिरेज-अमर छूत-1) कोशिकाओं। इन कोशिकाओं को भी एक कंघी द्वारा तैयार रहने की जरूरत डीसी उपचार और हिला बंद टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की स्थापना के लिए की ination। histograms में अंकों के दवा हटाने के बाद समय (दिन) का प्रतिनिधित्व करते हैं। भुज डीएनए सामग्री (सी, पूरक) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 3: डीसी के साथ इलाज किया बी.जे. कोशिकाओं के प्रतिनिधि Photomicrographs। (ए) बीजे कोशिकाओं 16 घंटे के लिए 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल डीसी के साथ इलाज किया। कई बँटवारा में गिरफ्तार कोशिकाओं देखा जा सकता है। (बी) डीसी उपचार के अंत। लगभग सभी कोशिकाओं विकास को गिरफ्तार कर लिया हैं। (सी) 7 दिन डीसी उपचार के बाद। बड़े चपटा कोशिकाओं के बीच छोटे proliferating कोशिकाओं देखा जा सकता है। (डी) 14 दिनों के इलाज के बाद डीसी। कोशिकाओं को सक्रिय बढ़ रहे हैं। e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 4: प्रत्येक कोशिका तनाव से स्थापित टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों के लिए क्रोमोसोम और गुणसूत्र संख्या के histograms के प्रतिनिधि Photomicrographs। शीर्ष, मध्य और नीचे पैनलों टेट्राप्लोइड छूत-1 से स्थापित कोशिकाओं (डीसी उपचार के बाद 2 सप्ताह), बीजे (2 हफ्तों के बाद डीसी उपचार) और स्पर्श-HT (7 सप्ताह के इलाज के बाद डीसी) क्रमश कोशिकाओं प्रतिनिधित्व करते हैं। गुणसूत्रों में कम से कम 50 metaphases में रन बनाए थे। histograms में अंकों के मोडल गुणसूत्र संख्या रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5: मानव fibroblasts (द्विगुणित कोशिकाओं) और टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों प्रत्येक कोशिका तनाव से स्थापित की प्रतिनिधि ग्रोथ प्रोफाइल। , वाम केंद्र और सही पैनल मूल छूत-1 के विकास प्रोफाइल दिखाने, बी.जे. और स्पर्श-HT कोशिकाओं (खुला मार्कर) और प्रत्येक कोशिका तनाव से स्थापित टेट्राप्लोइड कोशिकाओं के उन (बंद मार्कर)। कोशिकाओं को एक सप्ताह में दो बार passaged थे और PDLS सेल नंबर से गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: प्रतिनिधि Karyograms जी बैंडिंग और mFISH द्वारा। शीर्ष पैनल छूत-1 से स्थापित टेट्राप्लोइड कोशिकाओं (डीसी उपचार के बाद 2 सप्ताह) के जी बैंडिंग द्वारा एक karyogram पता चलता है। मध्य और नीचे फलक दिखाएंटेट्राप्लोइड छूत-HT कोशिकाओं (डीसी उपचार के बाद 15 और 41 सप्ताह) से स्थापित कोशिकाओं के लिए mFISH द्वारा karyograms। Karyotypes 10 कोशिकाओं (स्पर्श -1) या 20 कोशिकाओं (स्पर्श हिंदुस्तान टाइम्स) पर आधारित थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

, या तो cytokinesis अवरोधकों से या धुरी अवरोधकों द्वारा रासायनिक एजेंटों द्वारा द्विगुणित कोशिकाओं से tetraploidy की प्रेरण में एक प्रमुख समस्या यह है कि कोशिकाओं को अक्सर द्विगुणित और टेट्राप्लोइड आबादी का एक मिश्रण बन गया है, और टेट्राप्लोइड कोशिकाओं द्विगुणित कोशिकाओं से अलग किया जाना चाहिए। द्विगुणित कोशिकाओं से मुक्त एक टेट्राप्लोइड आबादी के अलगाव के लिए सबसे आम दृष्टिकोण के कमजोर पड़ने सीमित द्वारा FACS या क्लोनिंग का उपयोग करें। हालांकि, इन प्रक्रियाओं श्रमसाध्य और प्रदर्शन करने के लिए आसान नहीं हैं। इस रिपोर्ट में, हम सामान्य मानव fibroblasts से एक द्विगुणित आबादी से मुक्त proliferative टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की स्थापना के लिए एक नए प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल बँटवारा में द्विगुणित कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए धुरी जहर डीसी का उपयोग करता है, और mitotic कोशिकाओं द्विगुणित अंतरावस्था कोशिकाओं है, जो पकवान सतह का पालन से मिलाते हुए बंद से अलग होती गिरफ्तार कर लिया। एकत्र कोशिकाओं एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए डीसी के साथ व्यवहार कर रहे हैं, और द्विगुणित mitotic कोशिकाओं यह लंबे समय तक डीसी इलाज मुमकिन है ख से टेट्राप्लोइड G1 कोशिकाओं में बदलने काY चौकी अनुकूलन (भी mitotic फिसलन कहा जाता है)। इन कोशिकाओं को दवा हटाने के कई दिनों के लिए विकास गिरफ्तारी के बाद टेट्राप्लोइड कोशिकाओं के रूप में सेल के विकास को पुनः आरंभ।

इस पद्धति का एक लाभ यह है कि प्रक्रियाओं अपेक्षाकृत सरल और FACS रोजगार या टेट्राप्लोइड कोशिकाओं को अलग करने के लिए क्लोनिंग उन के साथ तुलना संभव हो रहा है। विधि की सीमाओं अनुसरण कर रहे हैं। सेल ऐसे उपकला कोशिकाओं के रूप में fibroblasts की तुलना में अन्य प्रकार के लिए प्रयोज्यता, वर्तमान में अज्ञात है। यह भविष्य के अध्ययनों में इस बात की पुष्टि की जानी चाहिए। एक छोटा सा द्विगुणित आबादी कुछ मामलों में रह सकता है। हालांकि, इन कोशिकाओं सीरियल passaging के साथ कम होते हैं। एक महत्वपूर्ण द्विगुणित आबादी डीसी उपचार, डीसी के एक उच्च एकाग्रता के बाद बनी रहती है (1.2 - 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल) या शेक बंद करने के बाद डीसी के साथ लंबे समय तक इलाज (4 दिन 3 दिन के बजाय) परिणाम में सुधार हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम निम्नलिखित हैं। सबसे पहले, एक के लिए डीसी के साथ इलाज के समयमंथन से पहले बँटवारा में कोशिकाओं rresting महत्वपूर्ण है। हालांकि इस उपचार समय में लंबे समय के लिए पर्याप्त होना चाहिए भी लंबे समय के लिए इलाज के पकवान सतह के लिए mitotic फिसलन और आसंजन कारण हो सकता है, यह असंभव बंद झटकों से mitotic कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कर रही है, के रूप में संभव के रूप में कई mitotic कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए। क्योंकि mitotic कोशिकाओं की अधिकतम वसूली के लिए एक उपयुक्त समय लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर हो सकता है, यह प्रारंभिक प्रयोगों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए। दूसरे, बंद मिलाते कदम mitotic कोशिकाओं को अलग करने से कोशिकाओं Interphase भी महत्वपूर्ण है। इस चरण में, द्विगुणित mitotic कोशिकाओं है, जो शिथिल पकवान सतह का पालन कर रहे हैं, बोतल centrifugation द्वारा पीछा के कोमल झटकों से एकत्र कर रहे हैं। इस mitotic हिला बंद पालन अंतरावस्था कोशिकाओं है कि बाद में द्विगुणित आबादी द्वारा संदूषण की उत्पत्ति हो सकती से डीसी ने गिरफ्तार mitotic कोशिकाओं को अलग करती है। हिंसक हिलती माध्यम है, जो कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है, और यह भी अंतरावस्था कोशिकाओं की टुकड़ी के उत्साह से भरा हुआ कारण हो सकता है, Rद्विगुणित कोशिकाओं के संक्रमण में esulting। एक और पहलू है कि इस विधि की सफलता को प्रभावित कर सकता संस्कृति माध्यम है। क्योंकि मजबूत विकास उत्तेजना डीसी उपचार के बाद प्रसार की वसूली के लिए आवश्यक प्रतीत हो रहा है, इस तरह के सदस्य के रूप में α पोषक तत्वों से भरपूर मध्यम टेट्राप्लोइड कोशिकाओं के प्रसार को समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। टेट्राप्लोइड कोशिकाओं (2.2.5) की प्रेरण के अंतिम चरण में 20% करने के लिए FBS एकाग्रता बढ़ाने से भी इस पद्धति की सफलता में वृद्धि हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम मानव fibroblast उपभेदों छूत-1, बी.जे., आईएमआर -90 और अब 14-16 को टेलोमिरेज-अमर छूत-1 ऊपर से टेट्राप्लोइड कोशिकाओं का उत्पादन तिथि करने के लिए है। क्योंकि इस सेल तनाव लगभग पूरी तरह से टेट्राप्लोइड जब डीसी के साथ लगातार इलाज किया, हिला बंद के बिना, 4 दिनों के लिए हो जाता है इन सेल उपभेदों के बीच, छूत-1 बल्कि असामान्य है। कारण है कि केवल छूत-1 कोशिकाओं डीसी के साथ सरल उपचार का एक परिणाम के रूप में पूरी तरह से टेट्राप्लोइड बनने वर्तमान में अज्ञात है। संभव explaराष्ट्रों हो सकता है कि द्विगुणित G1 चरण में अन्य प्रकार के गिरफ्तारी की कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात जब डीसी के साथ इलाज किया गया और उपचार के बाद प्रसार शुरू, जबकि (1) छूत-1 कोशिकाओं को एक ही उपचार के साथ G1 पर गिरफ्तार नहीं है, या (2) एक छूत-1 कोशिकाओं की आबादी अचल एक ही इलाज चल रहा G1 पर गिरफ्तारी और उसके बाद प्रसार फिर से शुरू नहीं करता है। किसी भी मामले में, डीसी के लिए G1 चौकी के अलग संवेदनशीलता डीसी के साथ निरंतर उपचार के बाद कोशिकाओं के विभिन्न कार्यों के लिए जिम्मेदार हो सकता है।

जब tumorigenesis में tetraploidy की etiological महत्व की जांच, कई शोधकर्ताओं, टेट्राप्लोइड कोशिकाओं में P53 जीन की स्थिति के बारे में महान चिंता है क्योंकि यह प्रस्ताव किया गया है कि tetraploidy लाती कोशिकाओं के P53-निर्भर विकास गिरफ्तारी, जो "tetraploidy जांच की चौकी" कहा जाता है 17-20। यदि यह परिकल्पना सही है, टेट्राप्लोइड कोशिकाओं proliferating में P53 सिगनल निष्क्रिय किया जाना चाहिए। तथापि,टेट्राप्लोइड हमारे प्रोटोकॉल द्वारा स्थापित कोशिकाओं द्विगुणित कोशिकाओं 15,16 के रूप में लगभग एक ही दर से बढ़ के बावजूद कार्यात्मक P53 करने लगते हैं। इस विसंगति के लिए कारण वर्तमान में नहीं जाना जाता है, और टेट्राप्लोइड कोशिकाओं के प्रसार में P53 निष्क्रियता के महत्व को भविष्य के अध्ययनों में ठीक से जांच की जानी चाहिए। वास्तव में, एक tetraploidy चौकी कि P53 के माध्यम से कार्यों की उपस्थिति विवादास्पद 21-23 बनी हुई है।

हालांकि nontransformed polyploid कोशिकाओं है कि इन विट्रो में प्रचार कर सकते हैं गुणसूत्र अस्थिरता और polyploid कोशिकाओं के ऑन्कोजेनिक क्षमता का विस्तृत विश्लेषण के लिए अपरिहार्य हैं, इस तरह की कोशिकाओं को अब तक शायद ही कभी उपलब्ध किया गया है। हमारी प्रोटोकॉल सामान्य मानव fibroblasts है, जो तंत्र polyploid मानव कोशिकाओं के परिवर्तन के लिए अग्रणी अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल हो सकता से proliferative टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की स्थापना के लिए एक सरल और व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEM-α Sigma-Aldrich M8042-500ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
FBS Sigma-Aldrich 172012-500ML
Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) Sigma-Aldrich D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits BD Biosciences #340242 For examination of DNA ploidy by flow cytometry
Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte MetaSystems #D-0125-060-DI Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary
Isis imaging system with mFISH  software  MetaSystems Specialized probe kit is necessary

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Nontransformed मानव fibroblasts से Proliferative टेट्राप्लोइड प्रकोष्ठों की स्थापना
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Ohshima, S., Seyama, A.… More

Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (119), e55028, doi:10.3791/55028 (2017).

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