Abstract
Almindelige problemer i behandlingen af biologiske prøver for observationer med scanning elektron mikroskop (SEM) omfatter celle sammenbrud, behandling af prøver fra våde mikromiljøer og celle ødelæggelse. Brug unge blomster væv, ægsporesvampe cyster og svampesporer (BLADHATTE) som eksempler, specifikke protokoller til at behandle sarte prøver er beskrevet her, der kan overvinde nogle af de vigtigste udfordringer i prøve behandling for billedoptagelse under SEM.
Blomster dannelsesvæv fast med FAA (formalin-eddikesyre-Alkohol) og forarbejdet med det kritiske punkt Dryer (CPD) ikke udviser kollapsede cellulære vægge eller forvrænget organer. Disse resultater er afgørende for genopbygningen af blomster udvikling. En lignende CPD-baserede behandling af prøver fra våde mikromiljøer, såsom glutaraldehyd-fikseret ægsporesvampe cyster, er optimalt at teste forskellen vækst af diagnostiske egenskaber (f.eks, cyste pigge) på forskellige typer af substrates. Ødelæggelse af sygeplejerske celler knyttet til svampesporer blev undgået efter rehydrering, dehydrering, og CPD behandling, et vigtigt skridt til yderligere funktionelle studier af disse celler.
Protokollerne beskrevet her repræsenterer lave omkostninger og hurtige alternativer for erhvervelse af god kvalitet billeder til rekonstruere vækstprocesser og studere diagnostiske egenskaber.
Introduction
I biologi, er brugen af scanning elektronmikroskopi (SEM) blevet udvidet til studier af strukturelle udvikling, sammenlignende morfologi, orgel udvikling og karakterisering af populationer eller arter 1. Med sin todimensionale visning af mikroskopiske strukturer, områder som Mikromorfologisk og systematik profiteret af SEM Teknik fremskridt siden anden halvdel af det 20. århundrede. For eksempel indførelsen af katodeforstøvningscoatingssystem metoden i 1970'erne gjort mulige observationer af sarte materialer såsom skyde spidser og blomster øger billeddannelse af ikke-ledende væv 2, 3. SEM bruger elektroner skubbes ud fra overfladen af prøven til at reproducere topografien i en høj-vakuum miljø 4.
Undersøgelser med SEM er fokuseret i både slutning af strukturelle karakterer og genopbygningen af growth processer. Nye strukturelle tegn relevante for taksonomi og systematik i en bred vifte af organismer er blevet opdaget fra SEM observationer. For eksempel, plante træk bruges for arter, diagnose eller supraspecific klassifikationer, såsom vestured gruber af træ 5, stigmatisering mangfoldighed 6, nectary og blomster morfologi 7, 8, trichome detaljer 9 og pollenkorn 10, 11, kan ikke sigtes ordentligt uden SEM. Succesfulde observationer med konventionelle SEM er også opnået for lang tid formalin-fikserede organismer 12 og plante herbarium prøver 13.
På den anden side, studier af rekonstruktion af vækst processer ved hjælp af SEM involvere en bred vifte af emner, såsom organudvikling 14, infeKTIONER fremkaldt af bakterier 15, plante rod fysiologi 16, parasit-vært vedhæftede mekanismer 17, 18, narkotika virkninger på parasitter 19, mycoparasitism og antibiotiske 20, 21, vækst misdannelse 22, sammenlignende udvikling af vilde og mutant individer 23, og hele livscyklus 24. Selvom scanning miljømæssige elektronmikroskoper (ESEM) 25 kan have vigtige fordele til observation af våde biologiske prøver i vækstprocesser, kan delikat materiale stadig blive kompromitteret, selv i lavt vakuum tilstand ESEM), og skal behandles tilstrækkeligt for at undgå tab af værdifulde morfologiske observation.
I dette papir, en gennemgang af specifikke protokoller for SEM-observation af tre different typer prøver præsenteres: blomster meristemer, Oomycetes (Saproleqnia) og svampe materiale. Disse protokoller kompilere oplevelsen af vores tidligere SEM-baserede studier 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, hvor der er fundet særlige vanskeligheder og alternative løsninger. I tilfælde af anlæg sammenlignende udviklingsmæssige og strukturelle studier, brug af SEM startede i 1970'erne 34, 35, og siden da, opdagede forskerne, at visse blomster funktioner er mere labile end tidligere antaget 36. Rekonstruktion af blomster udvikling indebærer opsamling af alle stadier mellem unge blomster meristemer og anthesis. For at nå dette mål, er det essential at prøven topografi og cellevæggen integritet ikke kompromitteres efter optagelsen og efterfølgende dehydrering. Unge blomster meristem er særligt sårbare over cellevæggen kollaps (figur 1a, 1b). Ligeledes sarte strukturer såsom nectaries, kronblade, stigmata og sporangier kræver effektive og undamaging protokoller. Denne anmeldelse opsummerer en optimal protokol til at holde unge og sarte væv intakt for SEM billeddannelse.
I tilfælde af oomyceter (Stramenopiles) -on af de mest forskelligartede og udbredte grupper af parasitter, med værter lige fra mikrober og planter til invertebrater og vertebrater 37 - der er sporer, der vokser og udvikles i et vådt miljø. Denne betingelse er en udfordring for SEM-observation, fordi sporerne har brug for en tilstrækkelig substrat ikke egnet til standard SEM-protokoller. Blandt Oomycetes, arter af Saproleqnia er af særlig interesse, fordi de can forårsage alvorlige reduktioner i akvakulturer, fiskeri og padder befolkninger 38. Micromorphological karakteristika, såsom de krogede spines af cyster, har vist sig at være nyttigt at identificere arter af Saproleqnia, som er grundlæggende for at etablere infektion kontrol og potentielle behandlinger 39. Her er der en forsøgsprotokol for at sammenligne de mønstre af rygsøjlen vækst af cyster på forskellige substrater og til at manipulere prøven til kritiske punkt tørretumbler (CPD) forberedelse og efterfølgende SEM-observation.
I en tredje sag, der er interessante fund, der kom op efter en inspektion af sporer af svampe Phellorinia herculanea f. stellata f. nova (BLADHATTE) 31. Sammen med de sporer, blev en gruppe af uventede planteskole celler identificeret under SEM. Med tidligere traditionelle protokoller og ubehandlet materiale, kom de sygeplejerske celler out fuldstændig sammen (figur 1c). Yderligere slutninger om særlige væv associeret med sporerne kan fremstilles med de enkle, men vigtige ændringer til standardmetoder beskrevet her (figur 1d).
I denne gennemgang er der detaljerede SEM protokoller, der kan anvendes til at behandle forskellige problemer forbundet med SEM-observation i dækfrøede, Oomycetes, og BLADHATTE, såsom celle sammenbrud og meristemvæv krympning, ikke-optimal vækst af cyster spines, og destruktion af flygtige væv henholdsvis.
Figur 1: Sammenligning af prøver behandlet uden (a, c) og med (b, d) protokollen FAA-ethanol-CPD. (A - b) Blomster knopper af Anacyclus clavatus, mid-udvikling. Bud behandlet med osmiumtetroxid 46 </ sup> (a) og knop behandlet med FAA-CPD-protokol (b). (C - d) Sygeplejerske celler med sporer af Phellorinia herculanea f. stellata. Tørrede prøver uden nogen behandling (C) og med protokollen her beskrevet for BLADHATTE (d). Sporer i orange. Skalaer: (ab) 100 um, (CD) 50 um. Billeder er taget af Y. Ruiz-León. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol omfatter seks hovedafsnit, tre hengivne til specifikke organismer (afsnit 1-3), og tre, der beskriver de procedurer, der er fælles for alle (4-6). Stjerner (*) indikerer skridt ændret af eksperimentatorer.
1. Undersøgelser af Udvikling og fuldt dannet Plant Structures
- Indsamling og fiksering
- Hvis plantematerialet opsamles i et sted uden adgang til et stinkskab, indføre og nedsænke materialet i 70% ethanol i centrifugerør. Ideelt, nedsænkes materialet efter 48 h i FAA (trin 1.1.1-1.1.3) for at undgå overdreven dehydrering i ethanol. Hvis et stinkskab er tilgængelig for plantematerialet, ignorere dette trin og fortsætte med 1.1.1.
- Forbered formalin-eddikesyre-alkohol (FAA) fiksativ i stinkskab forsynet med et aldehyd filter. Tilsættes 85 dele 70% denatureret ethanol, 10 dele 60% formaldehydopløsning, og 5 dele iseddikesyre. Forbered FAAlige før fastsættelse af materialet, som dets langtidsopbevaring anbefales ikke 40.
- Under stinkskabet, hæld bestanden af FAA i individuelle bred mund og lækagesikre plastflasker. Brug så mange flasker, som der er prøver til rådighed, og oprette etiketter til identifikation prøve.
- Vælg de blomster eller vegetative meristemer at fastsætte, der sikrer, at de ikke er beskadiget af insekter, svampe eller ekstreme vejrforhold. Skær grene, fjerne uønsket materiale, og deponere prøven straks i FAA løsningen.
- Efter 72-96 timer, hæld FAA i en plastbeholder til kemisk bortskaffelse. Umiddelbart vaskes prøverne tre gange med frisk 70% ethanol for at fjerne eventuel overskydende FAA. Fast materiale kan opbevares på ubestemt tid i 70% ethanol.
- Dissektion og dehydrering
- Skær faste materiale i 70% ethanol under stereomikroskop ved hjælp ultrafine pincet, neEdles, pincet, pensler, og mikro-skalpeller (den maksimale størrelse af vævet bør være omkring 1 cm 3, eller 2 cm for fladt materiale). Dissekere prøverne i en petriskål dækket med ethanol for at forhindre væv i at tørre. Brug en petriskål med basen dækket med tør sort silicium til bedre se kontrasterende hvide væv.
- Sæt dissekeret materiale i prøvebeholdere til det kritiske punkt tørretumbler (CPD, figur 2a). På dette tidspunkt nedsænkes beholderne i petriskålen med 70% ethanol, og indbefatter de identifikationsnumre prøve etiketter (lavet med papir og blyant). For mere effektiv tørring i yderligere manipulation, undgå at blande de unge og modne prøver i samme container. *
- Sæt låg på beholdere og deponere dem i plastcentrifugerør med masser af 70% ethanol. Opbevar rørene natten over, hvis materiale ikke behandles omgående.
- Overfør det dissekerede materiale gennem følgende ethanol seriesi hermetiske glas eller centrifugerør: 70%, 90%, 100% og 100%. Efterlad prøverne i hver opløsning i 1 time ved mindst. Hold prøverne natten over i en ethanolopløsning 100%.
- Overfør beholderne med materialet til byggevaredirektivet (afsnit 4).
- Montering og forberedelse plantevæv for SEM observation
- Skriv identifikationsnummeret prøvenummer nedenunder SEM prøveholdere (dvs. aluminium stubs). Dække toppen af stubbene med dobbeltklæbende tape. Placer stubs ind i en prøveholder (figur 2b).
- Under et stereomikroskop, forsigtigt åbne containere, der transporterer de unge og sarte prøver allerede tørret i byggevaredirektivet. Husk, at efter byggevaredirektivet behandling, prøverne bliver lysere og følsom over elektrostatikken. Luk beholderne, når prøverne er taget ud for at undgå støv eller urenheder.
- Sæt prøverne på den klæbende overflade af stubbe, planlægge den ønskedeposition (når prøverne berøre overfladen, er det meget vanskeligt at fjerne dem). Forsøg ikke at bære en større dissektion på dette punkt; bare fjerne uønsket væv, der er let at samle op. For palynological undersøgelser, dissekere de støvknapper og åbne dem for at eksponere pollen på stubbe.
- Put lange prøver (fx 2 cm lang) såsom blomsterstande i den horisontale position. Når det er muligt, orientere prøver af den samme struktur for polar, side, og bund udsigt. Sørg for plads nok mellem prøver på stub.
- Hvis prøverne ikke kan behandles med det samme, holde dem beskyttet natten over i en hermetisk beholder med silicagel for at undgå rehydrering (figur 2c) *. Coat prøverne ved hjælp af pådampningsbelægningsmaskinen og overføre dem til SEM (§§ 5 og 6).
Figur 2: Værktøjer til prøve manipulatipå og forarbejdning før SEM-observation. (A) Stål-made eksemplar beholder med hulforsynede vægge for ethanol / CO 2 udveksling i byggevaredirektivet kammeret. (B) Stål stumper inden en plastik prøveholder. (C) Glas beholder, der anvendes til at holde prøverne beskyttet mod fugt og støv. På basen, der er et rum til silicagel. (D) Kritisk Punkt Dryer. I fronten er der (fra venstre til højre) manometret, på afbryderen, systemets temperatur kontrol, og temperaturen display. Sædvanlig arbejdstryk for CO 2 ethanol udveksling er 60 bar (800 psi). I toppen er der fire ventiler (indløb, afløb, ventilation, og udstødning kontroller) flankerer den centrale prøvekammer. Billeder er taget af Y. Ruiz-León og MA Bello. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Dyrkning og fastsættelse af cyster
- Forbered pepton og glukose (PG-l) medier 41 ved hjælp af D - (+) - glukose (6 g) og mykologisk pepton (3 g) *. Tilføj op til 900 ml ledningsvand og autoklaver 40 minutter ved 121 ° C. Hæld 50 ml af den tidligere autoklaveret opløsning A (NaH 2 PO4, 0,13 M) og 50 ml opløsning B (Na 2 HPO 4, 0,13 M).
- Fra lager kulturer af stammer af Saproleqnia parasitica vedligeholdes på pepton, glucose, agar medier (PGA, der er forberedt som PG-l, men at tilsætte 10 g europæisk bakteriologisk agar til glukose og pepton før autoklaven), vokser mycelia kolonier i 0,5 ml PG-l dråber i 24-48 timer ved 20 ° C i petriskåle. Fremkalde sporulering ved vask af mycelia med autoklaveret postevand tre gange og inkubere dem i 15 timer ved 20 ° C= "xref"> 42, 43.
- Indsamle de frigivne sekundære zoosporer ved forsigtigt at pipettere den øverste del af suspensionen og samle dem i 1 ml portioner. Rystes kraftigt de zoosporer i 30 s ved vortexing at producere sekundære cyster 44.
- For at teste den differentielle vækst af piggene af cysterne, på separate petriskåle (p60), sættes 0,5 ml af den sekundære cyste suspensionen på forskellige overflader (dvs., carbon, guld og kobber TEM net; laks og kulmule fiskeskæl (tidligere bleget), og dækglas) *. Inkubér cyster ved 20 ° C i 70 min, hvilket fremmer fastgørelsen af cyster til overfladen.
- Fjern væsken og tilsæt 0,5 ml 2% glutaraldehyd til hver overflade for fiksering af cyster. Hold prøverne ved stuetemperatur under et stinkskab i 1 time.
- Fjern glutaraldehyd og dehydrere prøven gennem en ethanol-serien (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% og 100%), tilsætning af 5 ml af hver ethanol opløsningen i 15 minutter. Fra den sidste 100% ethanolopløsning, kan prøven opbevares i op til en måned i en forseglet petriskål. På dette stadium, prøverne er klar til at blive tørret i byggevaredirektivet.
- overføre omhyggeligt net og skalaerne fra petriskålen til en holder egnet til Byggevaredirektivet (afsnit 4). Til dette trin, skal du bruge en CPD gitter indehaveren eller en stabling prøveholder, der holder prøver adskilt fra hinanden. Tag ristene og skalaer med pincet, holde sig for øje, at cyster skal vende op på ristene hele tiden. *
- Montering og forberedelse cyste prøver til SEM observation
- Monter net og vægten på aluminium stubbe, der tidligere var dækket med dobbeltsidet carbon tape og mærket nedenunder.
- Overfør prøverne til pådampningsbelægningsmaskinen (afsnit 5).
- Overhold prøver under SEM (afsnit 6).
Phellorinia herculanea under SEM
- Rehydrering og dehydrering af sporer
- Pak hver prøve forsigtigt med filtrerpapir, danner blyant-mærkede kuverter ~ 0,5-1 cm 2, pas på ikke at knuse dem. Forsegl filtrerpapiret med papirclips. Overfør de pakkede prøver til en petriskål og nedsænke dem i 10 ml vand at rehydrere væv omkring sporerne.
- Straks sat prøverne i en mikrobølgeovn (600 W i ca. 20 s). Fjerne materialet, når vand begynder at fordampe, og lad den afkøle ved stuetemperatur.
- Passere prøverne gennem følgende ethanolserie: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% og 100%. Afhængig af mængden af prøver, skal du bruge et bæger eller centrifugeglas til dette trin. Lad prøverne i 15 min i hver opløsning.
- Placer prøverne til byggevaredirektivet (afsnit 4).
- Montering og preparing sporer for SEM-observation
- Åbn konvolutterne. Hæld sporerne på en tidligere fremstillet stub med dobbeltsidet tape. Alternativt, indsamle sporerne med den klæbrige overflade stubbe, pas på ikke at knuse dem *.
- Hvis prøverne indeholder få sporer, ud over det foregående trin, skære et lille stykke af konvolutten (~ 1 mm 2) og anbring den på en ny stub *.
- Placer væv ind i pådampningsbelægningsmaskinen (afsnit 5).
- Overhold under SEM (afsnit 6).
4. Tørring af Material Brug et kritisk punkt Dryer (CPD, figur 2d)
- Brug byggevaredirektivet i et ventileret område, og kontrollere, at alle ventiler i maskinen er lukket. Tjek om prøvekammeret er tom og ren.
- Tænd for maskinen og kontrollere, at temperaturen kontrolsystem test sker automatisk. Hvis byggevaredirektivet har en ekstern køleanlæg bad-system, skal du kontrollere vandstanden før du skifter jegT på.
- Følge producentens anvisninger for det specifikke CPD anvendes til ethanol og CO 2 udveksling. For sikkerhed, bære på dette trin under opsyn af en person uddannet til brug af maskinen. Husk, at det er udsat for hurtige trykændringer, kunne det blæse voldsomt.
- Tag prøverne og fortsætte med trin 1.3, hvis arbejde med plantevæv, trin 2.2, hvis arbejde med Oomycetes cyster, og trin 3.2, hvis arbejde med svampesporer.
5. Belægning Samples med Gold Brug af pådampningsbelægningsmaskinen (figur 3a)
- Check pådampningsbelægningsmaskinen. Kontroller, at guldet katode målet er i god stand. Brug en fnugfri klud gennemblødt med 90% ethanol til at rense væggene i vakuum kammer og kammeret låg evt.
- Marker sputter holder med tal ved siden hver stub hul til yderligere identifikation af prøverne under mikroskop. Forsigtigt placere stubbe læsset med Samples og sikre dem. Brug en roterende planetarisk prøvebordet at sikre en ensartet belægning på prøver med uregelmæssige overflader.
- Følg producentens anvisninger for at justere indstillingerne såsom arbejdsafstand, drift gastryk (f.eks 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (f.eks, 30 mm.), Sputtering tid (f.eks 50 s), tykkelse af guldlag (f.eks 12 nm) den nuværende (f.eks 15 mA) og forsyningsspændingen (f.eks 600 V) 45.
- Fjern stubbe og tage dem til SEM (afsnit 6). Alternativt placere stubbene i en lukket beholder med silicagel (figur 2c).
Figur 3: pådampningsbelægningsmaskine (a) og scanningselektronmikroskop (b). (A) set forfra af vakuumkammeret (venstre), gas valve, timer, vakuum, og nuværende kontrol. (B) fra siden af SEM hovedkomponenter (fra venstre mod højre): vakuum søjlen med prøvekammeret, computerskærmen med kontrollerne, og kammeret skærm. Billeder er taget af Y. Ruiz-León. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Observation under Scanning Electron Microscope (SEM, figur 3b)
- SEM opstart
- Følg producentens anvisninger for at starte og indstille SEM, justering af prøven højde målet blænde diameter (f.eks, for planter 2 um og for svampe og Oomycetes 4 um), driftsspændingen (f.eks, 15 kV).
- Kontroller den korrekte opretning af elektronstrålen, og indstille den aksiale opretning og stigmators ifølge producentens angivelser. Juster than arbejder afstand for at opnå en tilstrækkelig dybdeskarphed.
- Billede capture
- Få en fokuseret billede af prøven og bruge det som udgangspunkt. Øge forstørrelsen tæt på det maksimale niveau og fokusere billedet igen. Vælg områder med ujævnheder såsom huller. Korrekt bygningsfejl og justere den optimale kontrast og lysstyrke.
- Fang SEM billede med høj opløsning. Brug BSE detektor hvis billedet viser, at prøverne er opladet. Ellers sæt SE detektoren. Skift detektorerne efter producentens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Floral Udvikling og Fiksering af Udvikling og fuldt dannet Plant Structures
Brug af FAA-CPD protokollen beskrevet her, er unge og modne plantevæv optimalt fast og dehydreret for SEM billeddannelse. Processer såsom blomster udvikling kan rekonstrueres, fordi topografi og formen af knopper ikke fordrejes af celle faldende (figur 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplekse former med held kan dækkes med et ensartet lag af ledende materiale (metallet fra pådampningsbelægningsmaskinen), tillader genvinding af ellers uopnåelige detaljer (fig 4g-I, 5e). God kvalitet billeder af prøver fra våde mikromiljøer, der bruges til at være overbelastede med elektron strøm hvis dårligt dehydreret og belagt, kan opnås (figur 4f, 5a, 5b). Vigtige detaljer såsom pollen væg overflade (Figur 5b, 5c) og forskellige typer indumenta (figur 5d-g) kan studeres i dybden uden kunstige eller uønskede partikler eller forvrængede former.
Figur 4: Tidlig (a, b), mid (c-e), og sent (fi) floral udvikling fanget under SEM. (A) klase af Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze med flere blomster dannelsesvæv. (B) Ovenfra af en ung klase Polygala violacea Aubl. (C) Blomster knop af Krameria ixine Loefl. under frugtanlæg differentiering. (D - e) knopper af Erythrina sp. (F) Set fra siden af en blomst af Krameria ixine. De støvknapper og stil stikker. (G - i) Hoya carnosa (L.) R. Brown. (
Figur 5: SEM-mikrografer af sporangier og pollen (a, b), detaljerede overflader (c-e), og indumenta (f - g). (A) sporangia af Dryopteris sp. (B) Pollen af Prunus dulcis DA Webb landing på stigmatisering. (C) Pollen af Nepenthes alata Blanco. (D) Set fra siden af en blomsterstand af Erigeron karvinskianus DC. Billede taget med BSE detektor mulighed. (E) siden udsigt på bryophyte Peristoma sp. (F) glandulær og ingen glandulær trichomes på abaxial overflade af et blad af Rosmarinus officinalis L. (G) Ovenfra af bladet flade skalaer af Olea europaea L. Scales: (a) 400 um, (b) 60 um, (c) 5 um, (d) 4 mm, (e) 600 um, (f) 200 um, (g) 600 um. Billeder er taget af Y. Ruiz-León. Klik her for at se en større version af dette tal.
Effekt af forskellige substrater på Spine Vækst af Secondary cyster Saproleqnia parasitica
(tabel 1, figur 6a). På carbon og guld gitre spines er kortere, krøllet og vokse mere rigeligt omkring cyster uden at danne løkker (figur 6b, 6d). Selv om kobber net, de pigge tendens til at krølle, uden looping, nogle af dem aflange (figur 6c). På fiskeskæl, spines var krøllet, rigelige omkring overfladen og undertiden dannede loopes ender (figur 6e-f).
Figur 6: Differential vækstmønstre af spines af Saproleqnia parasitica i cyster nedsænket i flydende medier. (A) Glass. (B) Carbon. (C) Kobber. (D) Gold. (E) Hake skala. (F) Salmon skala. Lige pigge blev udviklet på glas og kobber, mens krøllede pigge blev dannet på carbon, guld, og fiskeskæl. De krogede tips (hvide pile) af spines er observerbare i alle pigge vokser på glas og i få pigge på fiskeskæl. Cyste vægge er i gult. Scale: 20 um. Billeder er taget af Y. Ruiz-León og S. Rezinciuc. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Overflade | Spine morfologi | |
| forlængelse | Løkke på spidsen | |
| Glas cover | God forlængelse, pigge let at tælle Til stede | |
| fiskeskæl | Pigge med krøllet form ikke let at tælle | Til stede |
| TEM gitre | Korte og krøllede pigge ikke let at tælle | Fraværende |
Tabel 1: Spine morfologi ved hjælp af forskellige typer underlag.
Uventede Observationer i Phellorinia herculanea f. stellata
Bortset fra det uventede fund af laticiferous hyfer på exoperidium af P. herculanea, Calonge et al. 31 syntes kugleformet og glatte sygeplejerske celler (8-13 um) blandet med sporer i materialet dehydreret med CPD takket være rehydratiseringstrinnet udført i mikrobølgeovn. (Figur 1d). Strukturen og detaljer af væggene af than sygeplejerske celler og sporerne velbevaret trods deres differential sammensætning (figur 1c-d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hensyn til standard SEM-protokoller, de procedurer, der præsenteres her omfatter forholdsvis hurtig, let at følge, og billige metoder. Afhængigt af mængden af prøver og på den lette behandling, tager det fire til fem dage til at erhverve billeder af god kvalitet. Herunder passende forholdsregler til byggevaredirektivet og SEM drift sikkerhed, procedurerne er let at håndtere. Særlig forsigtighed bør tages med formalin og glutaraldehyd (se trin 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Der er visse trin, hvor, hvis det er nødvendigt, kan processen stoppes i længere tid uden at beskadige prøverne eller ødelægge tidligere trin (f.eks trin 1.1.5, 1.2.3, og 1.3.5). Med hensyn til omkostninger, kan meget af udstyret genbruges i flere præparater (f.eks CPD aluminium containere og stub indehavere), og reagenserne er ikke-dyre kemikalier tilgængelige fra alle kommercielle leverandører.
Ulemper ved disse procedurer erbehovet for korrekt bortskaffelse af kemisk affald til aldehyder og ethanolen og manglen på vigtige forsyninger og begrænsningerne af teknikken. Materialer, såsom guld disk for pådampningsbelægningsmaskinen og CO 2 cylinder for CPD bør kontrolleres i god tid. Hvis de er i kontinuerlig brug, vil laboratoriet kræver flere lagre af dem, som i sidste ende hæver omkostningerne. Fordi individuelle forskere ofte ikke kan retfærdiggøre udgifterne stammer fra vedligeholdelse af disse typer af leverancer, eller de simpelthen ikke behøver at bruge SEM kontinuerligt, disse procedurer i dag en tendens til at blive udført i laboratorier med eksterne elektronmikroskopi tjenester.
Observationen teknik af SEM er begrænset til en høj forstørrelse undersøgelse af overflader. Hvis de interne væv skal overholdes, bør prøverne skæres i den rigtige måde at udforske det udvendige udseende af de interne væv. At udforske interne aspekter af cellerne ved høj magnification, er en transmissions elektron mikroskop (TEM), der kræves. Kritiske trin i protokollen er den rette fiksering og dehydrering af prøverne før CPD behandling, hvor det er afgørende at holde væv sikkert fra chokerende ændringer og direkte kontakt med luften. Også, omhyggelig styring af trykændringen i CPD prøvekammeret og mængden af coating aflejret på forskellige typer prøver er vigtig.
På trods af disse begrænsninger og særlige manipulationer, studiet af biologiske prøver med SEM efter protokollerne beskrevet her muliggør løsningen af nogle fælles problemer, såsom cellevæggen og orgel forvrængning (figur 1, 4, 5), de begrænsninger for observation og vækst af strukturer kommer fra våde og flydende miljøer (5, 6), og ødelæggelse af følsomme celler (figur 1c, 1d).
Protokollerne præsenteres her har allowed nyfortolkning og afhøring af traditionelle taksonomiske egenskaber, såsom rygsøjlen struktur i cyster i Saproleqnia 47. Forskellen vækstmønster af Saproleqnia pigge på forskellige overflader viser labilitet af denne funktion og dens begrænsninger for arter diagnose. Ud over erobringen af relevante karakteristika for taksonomiske undersøgelser, stadier af organudvikling og infektionssygdomme, funktioner af væv aldrig observeret før er blevet udforsket takket være disse teknikker. Nu kan denne protokol udvides til tusindvis af casestudier venter på at blive undersøgt 33. Ifølge peer-reviewed litteratur database Scopus, i den sidste af de sidste fem år har der været 7.425 publikationer af papirer, der beskæftiger sig med SEM billeddannelse af planter (4914), Oomycetes (21) og svampe (2490). Dette faktum tyder på, at forskning i Oomycetes hjælp af SEM imaging er stadig meget sparsomme i forhold tilplanter og svampe. Med ESEM, er tallene endnu lavere. Der er 588 håndskrifter i samme tidsrum: 337 i planter, 1 i Oomycetes og 250 i svampe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Den Europæiske Unions Horisont 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr 634429. Denne publikation forpligter kun forfatteren, og Kommissionen kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der kan gøres af oplysningerne indeholdt deri. Vi anerkender også den finansielle bidrag fra Real Jardín Botánico, CSIC. SR er taknemmelig for Den Europæiske Union [ITN-SAPRO-238.550] til støtte af hendes forskning i Saproleqnia. Vi vil også gerne takke Francisco Calonge for venlig at give de Phellorinia herculanea billeder og B. Pueyo for behandling af prøver (figur 5). Alle billeder blev taget af SEM service på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
