Abstract
走査型電子顕微鏡（SEM）による観察のための生物学的サンプルの処理における一般的な問題は、細胞崩壊、湿式微環境からのサンプルを処理し、細胞の破壊を含みます。 SEM下の画像キャプチャのための試料処理における主な課題のいくつかを克服するため、ここで説明されているデリケートなサンプルを処理するために、特定のプロトコルを若い花の組織、卵菌類嚢胞、および例などの真菌胞子（ハラタケ目）を使用します。
花分裂組織FAA（ホルマリン酢酸 - アルコール）で固定し、臨界点乾燥機（CPD）で処理が崩壊セルラー壁や歪ん臓器が表示されませんでした。これらの結果は、花の開発の復興のために非常に重要です。このようなグルタルアルデヒド固定卵菌類嚢胞等の湿式微小環境からのサンプルの同様のCPDに基づく治療、suコマンドの異なる種類の診断特性（ 例えば、嚢胞棘）の差動成長をテストすることが最適ですbstrates。カビの胞子に取り付けられたナース細胞の破壊を再水和、脱水、及びCPD処理、これらの細胞のさらなる機能研究のための重要なステップの後に回避されました。
ここでの詳細なプロトコルは、成長プロセスを再構築し、診断特性を研究するために、良好な品質の画像を取得するための低コストで迅速な代替物を表します。
Introduction
生物学では、走査型電子顕微鏡（SEM）の使用は、構造進化の研究、比較形態、器官の発達、及び集団又は種1の特徴に拡張されています。微細構造体の、その2次元図では、このような微細形態や系統などの分野は、20 世紀後半以降のSEM技術の進歩から利益を得ました。例えば、1970年代にスパッタコーティング方法論の導入は、このような非導電性組織2、3のイメージングを高める茎頂や花などの繊細な素材の可能な観察を行いました。 SEMは、高真空環境4の形状を再現するために、試料の表面から放出された電子を使用します。
SEMを含む研究は、構造的な文字の推論とgrowtの復興の両方に重点を置いています時間プロセス。広範囲の生物の分類と系統に関連する新しい構造的な文字は、SEM観察から発見されています。例えば、このような木材5、柱頭の多様性6、蜜腺と花の形態7、8の衣をまとったピットなどの種の診断またはsupraspecific分類ごとに使用される植物の形質、トライコームの詳細9、および花粉粒10、11は 、適切にせずに可視化することはできませんSEM。従来のSEMで成功観察はまた、長時間のホルマリン固定生物12と植物植物標本13のために達成されています。
一方、SEMを用いた成長プロセスの再構成の研究は、このような臓器の発達14、infeなどのトピックの広い範囲を含みます細菌15、植物の根生理学16、寄生虫ホスト接続機構17、18、寄生虫19、mycoparasitismおよび抗生20、21、成長奇形22、野生および変異個体23の比較開発、およびライフサイクル全体を上薬の効果によって誘発されるctions 24。環境走査型電子顕微鏡（ESEM）25は、成長プロセスにおいて湿潤生体試料の観察に重要な利点を有していてもよいが、繊細な材料が依然としてもESEM）の低真空状態で妥協し、損失を回避するために適切に処理する必要があることができます貴重な形態学的観察。
本論文では、3差分のSEM観察のための特定のプロトコルのレビューではサンプルのerent種類が提示されている：花の分裂組織、卵菌類（ ミズカビ ）、および真菌物質を。これらのプロトコルは、特定の困難や代替案が見出されている我々の以前のSEMベースの研究26、27、28、29、30、31、32、33、の経験をコンパイルします。植物の比較発達と構造研究の場合には、SEMの使用は、1970年代34、35で開始して以来、研究者は、特定の花の特徴は、以前に36を考えられていたよりも不安定であることを発見しました。花の開発の復興は、若い花の分裂組織と開花間のすべての段階の捕獲を伴います。この目的を達するためには、ESSEあります試料のトポグラフィー及び細胞壁の完全性は、固定およびその後の脱水後に損なわれないことをntial。若い花分裂組織の細胞壁の崩壊に対して特に脆弱である（ 図1A、1B）。同様に、蜜腺、花弁、柱頭および胞子嚢のような繊細な構造が効果的とundamagingプロトコルを必要とします。このレビューは、SEMイメージングのためそのまま若くて繊細な組織を維持するための最適なプロトコルをまとめたものです。
卵菌類の微生物や植物からの無脊椎動物と脊椎動物37に至るまでのホストと寄生虫の最も多様かつ広範なグループの（ストラメノパイル） -オンの場合、 -成長し、湿潤環境での開発胞子があります。胞子は、標準的なSEMプロトコルには適していない適切な基板を必要とするので、この条件は、SEM観察のための課題です。彼らはcaのため卵菌類のうち、 サプロレグニアの種は特に重要ですnは水産養殖、漁業、および両生類の個体数38で深刻な減少を引き起こします。そのような嚢胞のフック棘などの微細形態の特徴は、感染の制御および潜在的な治療法39を確立することが基本であるサプロレグニア、の種を同定するのに有用であることが見出されています。ここでは、異なる基板上の嚢胞の脊椎の成長パターンを比較し、臨界点乾燥（CPD）の調製とその後のSEM観察用の試料を操作するための実験プロトコルがあります。
第三のケースでは、真菌のPhelloriniaのherculanea fの胞子の検査後に思い付いた興味深い調査結果があります。 stellataの F。新星（ハラタケ目）31。一緒に胞子で、予想外の保育園の細胞のグループがSEMで確認されました。以前の伝統的なプロトコルおよび未処理材料で、ナース細胞は、OUを来ましたtは完全に（ 図1c）を崩壊しました。胞子に関連する特定の組織についてのさらなる推論は、ここで説明する（ 図1D）は、標準的なアプローチにシンプルだが非常に重要な変更を加えて行うことができます。
このレビューでは、このような細胞の崩壊と分裂組織の縮小、嚢胞棘の非最適な成長、および破壊など、さまざまな被子植物におけるSEM観察に関連する問題、卵菌類、およびハラタケ目に対処するために使用することができ、詳細なSEMプロトコルが存在し、それぞれはかない組織。
図1（C）なしで（B、D）プロトコルFAAエタノール-CPDで処理したサンプルの比較。 （ - b）は Anacyclusのclavatus、ミッド開発の花蕾。バドは<四酸化オスミウム46で処理されました/ SUP>（a）およびFAA-CPDプロトコル（B）で処理した出芽。 （C - D）Phelloriniaのherculanea fの胞子とナース細胞。 stellata。任意の治療（C）なしで、ここハラタケ目（d）に記載のプロトコルを用いてサンプルを乾燥させました。オレンジ色で胞子。スケール：（AB）が100μm、（CD）50μmです。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
注：このプロトコルは、すべての（4-6）に一般的な手順を記述した特定の生物（セクション1-3）、および三から三献身的な6つの主要なセクションが含まれています。アスタリスク（*）は、実験者によって変更された手順を示しています。
1.開発の研究と完全に形成されたプラントの構造
- コレクションと固定
- 植物材料は、ドラフトチャンバーへのアクセスなしで所定の位置に収集されている場合は、導入して遠心分離管に70％エタノールで材料を浸します。理想的には、エタノールに過度の脱水を避けるためにFAAで48時間（ステップ1.1.1-1.1.3）後の材料を浸します。ドラフトチャンバーは、植物材料からアクセス可能である場合は、この手順を無視し、1.1.1に進みます。
- アルデヒドフィルタを装着した通風室にホルマリン、酢酸、アルコール（FAA）固定液を準備します。 70％変性エタノール85部、60％ホルムアルデヒド水溶液10部、および氷酢酸の5部を加えます。 FAAの準備ちょうどその長期保存として、材料を固定する前に、40をお勧めしません。
- ドラフトチャンバーの下では、個々の広口及び漏れ防止プラスチックボトルにFAAの株式を注ぎます。利用可能なサンプルと同数のボトルを使用し、試料を識別するためのラベルを作成します。
- 彼らは昆虫、真菌、または極端な気象条件によって損傷されていないことを確認して、修正するために花のや栄養分裂組織を選択します。不要な材料を除去、枝を切断し、FAA溶液中ですぐにサンプルを堆積させます。
- 72〜96時間後、化学的処理のためのプラスチック容器にFAAを注ぎます。直ちに、残留FAAを除去するために、新鮮な70％エタノールで試料を3回洗浄します。固定された物質を70％エタノール中で無期限に保存することができます。
- 解剖と脱水
- ね、超微細ピンセットを用いて、実体顕微鏡下で70％エタノールで固定材料を解剖edles、鉗子、ブラシ、およびマイクロメス（組織の最大サイズは約1 cm 3であり、または平坦な材料は2 cmでなければなりません）。乾燥から組織を防止するために、エタノールで覆われたペトリ皿にサンプルを分析。より良い対照的な白の組織を見るために、乾燥ブラックシリコンで覆われたベースでペトリ皿を使用してください。
- 臨界点乾燥機（CPD、 図2a）のための検体容器内の解剖材料を入れてください。この時点で、70％エタノールでペトリ皿に容器を浸漬し、（紙と鉛筆を用いて作られた）サンプル識別ラベルを含みます。さらなる操作のためのより効果的な乾燥のために、同じ容器に若く、成熟したサンプルを混合しないようにしてください。*
- コンテナに蓋を入れて、70％エタノールをたっぷりとプラスチック製遠心管にそれらを堆積させます。材料はすぐに処理されていない場合は一晩チューブを保管してください。
- 以下のエタノールセリエを通して解剖材料を転送密閉瓶または遠心チューブ中の70％、90％、100％、100％。少なくとも1時間のために、各溶液中の試料を残します。 100％エタノール溶液中で一晩サンプルを保管してください。
- CPD（セクション4）の材料でコンテナを転送します。
- SEM観察のための植物組織をマウントと準備
- SEM試料ホルダー（ すなわち、アルミスタブ）の下にサンプル識別番号を書きます。両面テープでスタブの上部をカバーしています。試料ホルダー（ 図2b）にスタブを配置します。
- 実体顕微鏡下では、慎重に既にCPD中で乾燥させ、若くて繊細なサンプルを運ぶコンテナを開きます。 CPD処理後、試料は軽く、静電気に敏感になることに注意してください。サンプルは、ほこりや不純物を避けるために取り出された後、容器を閉じます。
- 先に希望を計画し、スタブの粘着性表面上にサンプルを置きます位置（試料が表面に触れると、それらを削除することは非常に困難です）。この時点で、主要な解剖を運ぶためにしようとしないでください。ただ拾うのは簡単である不要な組織を除去します。花粉分析研究のために、葯を分析し、スタブに花粉を公開するためにそれらを開きます。
- このような水平位置にある花序として入れて長いサンプル（ 例えば、長さ2cm）。可能な場合、極性、側についても同様の構造、および底面図の配向サンプル。スタブ上のサンプル間に十分なスペースを入れてください。
- サンプルはすぐに処理することができない場合は、*再水和（ 図2c）を避けるためには、シリカゲルと密閉容器中で一晩保護しておきます。コートスパッタコーターを使用し、SEMに転送サンプル（セクション5及び6）。
図2：サンプルmanipulatiためのツール上およびSEM観察の前処理。 CPDチャンバ内のエタノール/ CO 2交換のための穴のあいた壁を有する（a）は、スチール製の試料容器。 （b）はプラスチック製試料ホルダー内のスチールスタブ。 （C）ガラス容器は、湿気や埃から保護し、サンプルを保持するために使用されます。基部には、シリカゲルのためのコンパートメントがあります。 （d）の臨界点乾燥機。前に、圧力計、電源スイッチ、温度制御システム、および温度表示（左から右へ）があります。 CO 2 -エタノール交換のための通常の作動圧力は、60バール（800 psi）です。上部では、中央の試料室に隣接する4バルブ（入口、ドレイン、換気、排気コントロール）があります。写真はY.ルイス・レオンとMAベロによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 嚢胞の成長と定着
- （+） - -グルコース（6グラム）と菌学的ペプトン（3グラム）*ペプトンとグルコース（PG-L）Dを使用してメディア41を準備します。水道水の900ミリリットルまで追加し、121℃で40分間オートクレーブ。あらかじめオートクレーブ溶液Aの50ミリリットル（のNaH 2 PO 4、0.13 M）、溶液Bの50ミリリットルし（Na 2 HPO 4、0.13 M）を注ぎます。
- サプロレグニアパラシティカの株のストック培養物から0.5 mLの菌糸のコロニーを育て、ペプトン、グルコース、寒天培地（PG-リットルのように調製したが、グルコース、オートクレーブ前ペプトンにヨーロッパの細菌学的寒天10gを加えているPGA）上に維持ペトリ皿中で20℃で24〜48時間、PG-L滴。オートクレーブ水道水で3回菌糸体を洗浄し、20℃で15時間、それらをインキュベートすることによって胞子形成を誘導します= "外部参照"> 42、43。
- 優しくサスペンションの上部をピペッティングすることにより放出される二次遊走子を収集し、1 mLの部分でそれらをプール。二次嚢胞44を生成するためにボルテックスすることによって積極的に30秒のための遊走子を攪拌。
- 嚢胞の棘の差動成長をテストするには、別々のペトリ皿（P60）に、異なる表面（ すなわち、炭素、金、銅TEMグリッド上に二次嚢胞懸濁液0.5 mLのを入れて、サケやメルルーサ魚の鱗（以前漂白）、およびガラスカバースリップ）*。表面に嚢胞の付着を有利に70分、20℃で嚢胞をインキュベートします。
- 液体を除去し、嚢胞の固定のために各表面に2％グルタルアルデヒドの0.5 mLを加え。 1時間のドラフトチャンバー下、室温でサンプルを保管してください。
- グルタルアルデヒドを除去し、エタノール系列（30％、40％、50％、60％、70％、80％を通して試料を脱水、90％、100％、100％）、15分間の各エタノール溶液5mLを加えます。最後に100％エタノール溶液で一度、サンプルを密閉ペトリ皿内月まで保存することができます。この段階では、サンプルは、CPD中で乾燥する準備ができています。
- 慎重CPD（第4節）に適したホルダーにペトリ皿からグリッドとスケールを転送します。この工程のために、互いから分離されたサンプルを保持CPDグリッドホルダーまたは積層試料ホルダを使用します。嚢胞はすべての時間のグリッド上で上向きにする必要があることを念頭に置いて、ピンセットでグリッドとスケールを取ります。*
- SEM観察用のマウントと準備嚢胞サンプル
- 以前両面カーボンテープで覆われ、その下に標識したアルミニウムスタブ上のグリッドとスケールをマウントします。
- スパッタコーター（セクション5）にサンプルを転送します。
- SEM（セクション6）の下でサンプルを観察します。
Phelloriniaのherculaneaのハーバリウム真菌胞子の研究
- 胞子の再水和と脱水
- 〜0.5〜1センチメートル2、それらを粉砕しないように注意しながら鉛筆で標識された封筒を形成し、ろ紙で慎重に各サンプルを包みます。ペーパークリップで濾紙をシール。ペトリ皿にパックされたサンプルを移し、胞子周囲の組織を再水和するために10mLの水でそれらを浸します。
- すぐにマイクロ波（約20秒間600 W）でサンプルを置きます。水が蒸発し始めたら、材料を除去し、それを室温で冷却することができます。
- 以下エタノールシリーズを通して試料を通過する30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％。サンプルの量に応じて、このステップのためにビーカーや遠心管を使用しています。各溶液中で15分間サンプルを残します。
- CPD（セクション4）にサンプルを置きます。
- 取付けおよびpSEM観察のための胞子をreparing
- 封筒を開きます。両面テープで予め用意スタブに胞子を注ぎます。また、*それらを粉砕しないように注意しながら、スタブの粘着性表面に胞子を収集します。
- サンプルは、いくつかの胞子が含まれている場合は、前のステップに加えて、エンベロープ（〜1ミリメートル2）の小片をカットして、新しいスタブ*上に置きます。
- スパッタコーター（第5節）に組織を置きます。
- SEM（セクション6）の下で観察します。
臨界点乾燥機を使用した素材の4乾燥（CPD、図2d）
- 換気された場所でCPDを使用して、マシンのすべてのバルブが閉じていることを確認します。試料室が空であり、汚れていないか確認してください。
- マシンのスイッチをオンにし、温度制御システムの試験は自動的に行われることを確認します。 CPDは、外部冷凍浴システムを持っている場合は、私を切り替える前に、水のレベルを確認上のT。
- エタノールとCO 2の交換に使用される特定のCPDの製造元の指示に従ってください。安全のため、機械の使用のために訓練誰かの監督の下で、この手順を続けていきます。それは急激な圧力変化にさらされていることを忘れないでください、それは激しく吹き消すことができます。
- サンプルを取り出し、植物組織、ステップ2.2で作業する場合は卵菌類嚢胞を扱う場合は、手順1.3を継続し、カビの胞子で作業している場合3.2を繰り返します。
5.スパッターコーター（図3a）を使用したゴールドでサンプルをコーティング
- スパッタコーターを確認してください。金陰極ターゲットが良好な状態であることを確認します。必要に応じて、真空チャンバと、チャンバ蓋の壁をきれいにするために90％エタノールでびっしょり糸くずの出ない布を使用してください。
- 顕微鏡下での試料のさらなる識別のための各スタブ穴の横に番号がスパッタホルダーをマークします。慎重に、samplを搭載したスタブを配置エスと固定します。不規則な表面を持つ標本上に均一なコーティングを確実にするために、回転式の遊星試料ステージを使用してください。
- このような作動距離として設定を調整するには、製造元の指示に従って、動作ガス圧（ 例えば、×10 -1 5から7×10 -1ミリバール）（ 例えば 、30ミリメートル。）、スパッタ時間（ 例えば、50秒）、金層（ 例えば、12 nm）の電流（ 例えば 、15ミリアンペア）と電圧源（ 例えば、600 V）45の厚さ。
- スタブを削除し、SEM（セクション6）にそれらを取ります。また、シリカゲル（ 図2c）と密閉容器内にスタブを配置します。
図3：スパッタコーター（a）および走査型電子顕微鏡（B）。 （a）は 、真空チャンバ（左）の正面図、ガスVALV電子、タイマー、真空、および現在のコントロール。 （b）は （左から右へ）SEMの主要な構成要素の側面図：試料室と真空カラム、コントロールとコンピュータ画面、および室のモニターを。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
走査型電子顕微鏡（SEM、図3b）の下で6観察
- SEMは起動します
- サンプル高対物絞り径（ 例えば、植物が2μmおよび菌類と卵菌類4μmのため）、動作電圧（ 例えば、15 kVの）を調整、SEMを起動し、設定する製造元の指示に従ってください。
- 電子ビームシステムの正しい配置を確認し、製造業者の指示に従って軸方向に整列し、スティグメータを設定します。トンを調整彼は、フィールドの十分な深さを得るために、作動距離。
- 画像キャプチャ
- サンプルの合焦画像を取得し、出発点としてそれを使用しています。最大レベルに近い倍率を増やして、再び画像の焦点を合わせます。このような穴のような表面の凹凸のある地域を選択してください。乱視を矯正すると、最適なコントラストと明るさを調整します。
- 高解像度でのSEM画像をキャプチャします。画像はサンプルが帯電していることを示していた場合にBSE検出器を使用してください。それ以外の場合は、SE検出器を設定します。製造者の指示に従って検出器を変更します。
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Representative Results
花の開発と開発の固定と完全に形成されたプラントの構造
ここで説明FAA-CPDのプロトコルを使用して、若い成熟した植物組織を最適に固定され、SEMイメージングのために脱水されています。芽の地形や形状が収縮細胞（ 図1B、1D、図4A-F）によって歪まされていないので、このような花の発達等の処理を再構成することができます。複雑な形状の構造が正常に他の方法で到達不能な詳細（ 図の4G-I、5E）の回復を可能にする、導電性材料の均一な層（スパッタコーターの金属）で覆うことができます。ひどく脱水およびコーティング、（ 図4F、5A、5B）を達成することができる場合、電子電流で過充電するために使用される湿式微環境からの試料の良好な品質の画像、。このような花粉の壁面などの重要な詳細（図5b、図5c）及びindumentumの複数形（ 図5D-G）の異なるタイプの人工的なまたは望ましくない粒子または歪んだ形状をなし深く研究することができます。
図4： 初期の（a、b）は、ミッド（C-E）、 およびSEM下で撮影後半（FI）花の開発。 （a）は 、いくつかの花の分裂組織とCaesalpiniaスピノサ （モリーナ）Kuntzeの総状花序。 （b）は若い総状花序ヒメハギviolacea Aublのトップビュー。 （c）の ラタニアixine Loeflの花蕾。雌ずい群の分化中。 （D - E） エリスリナ属sp。の芽。 （f）は ラタニアのixineの花のサイドビュー。葯とスタイルが突出しています。 （ グラム - ⅰ） サクララン （L.）R.ブラウン。 （
図5： 胞子と花粉のSEM顕微鏡写真（a、b）は、詳細な表面（C-E）、 およびindumentumの複数形（F - グラム）。 （a）は Dryopteris属の胞子嚢。 プルーナスダルシス DAのWebの（b）の花粉B柱頭に着陸。 （c）の ウツボカズラアラタブランコの花粉。 （d）に ペラペラヨメナ DCの花序の側面図を。 BSE検出オプションを使用して撮影した画像。コケ植物Peristoma sp。の（e）の側面図。 （f）は腺とローズマリーのofficinalisのLの葉の背軸面に無腺毛。 （ グラム ） オリーブLの葉平らなスケールの上から見た図。スケール：（A）が400μm、（b）は60μmで、（C）は5μm、（D）4をミリメートル、（e）は600μmで、（F）は200μm、（G）は600μm。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セカンダリ嚢胞サプロレグニア病菌の脊椎成長に対する異なる基質の影響
表1、 図6A）でループを示しました。炭素と金棘が短くなっているグリッド上、カールやループ（ 図6bは、図6d）を形成することなく、嚢胞周りより豊富に成長。銅グリッド上にあるが、棘は、それらのいくつかの細長い（ 図6c）、ループせずにカールする傾向がありました。魚の鱗で、棘は、巻き毛の表面の周りに豊富で、時には（ 図6E-f）の端をループ形成します。
図6： 液体培地に浸漬嚢胞で サプロレグニア病菌 の棘の示差成長パターン 。 （a）のグラス秒。 （B）カーボン。 （C）銅。 （d）のゴールド。 （e）はメルルーサ規模。 （f）はサーモンスケール。カール棘は、炭素、金、魚鱗を形成したのに対し、直線状の棘が、ガラスおよび銅を開発しました。棘の引っ掛け先端（白矢印）は、ガラス上に成長しているすべての棘にし、魚の鱗には、いくつかの棘で観測可能です。嚢胞壁は黄色です。スケール：20μmです。写真はY.ルイス・レオンとS. Rezinciucによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 表面 | スパイン形態 | |
| 伸長 | 先端のループ | |
| ガラスぶた | 良好な伸び、簡単に棘がカウントします現在 | |
| 魚鱗 | カウントすることは容易ではない巻き毛状の棘 | 現在 |
| TEMグリッド | カウントすることは容易ではないショートやカーリー棘 | ありません |
表1：基板の異なるタイプを使用して脊椎形態。
Phelloriniaのherculanea Fの予想外の観測。 stellata
別にP.のherculanea、カロンジュらのexoperidiumにラテックスを含む菌糸の予期せぬ発見から。 31は、マイクロ波で行われる再水和ステップにCPDのおかげで脱水材料で胞子と混合球形で滑らかなナース細胞（8-13μm）を発見しました。 （ 図1D）。 Tの壁の構造および詳細ナース細胞と胞子彼はよく自分の差動組成物（ 図1C-D）にもかかわらず、保存されています。
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Discussion
標準的なSEMプロトコルに関しては、ここで紹介する手順は、比較的、迅速な追随しやすく、かつ低コストの方法論を含みます。試料の量と処理の容易さに応じて、良好な品質の画像を取得するために4〜5日かかります。 CPDとSEMの操作のための適切な安全措置を含め、手続きは、取り扱いが容易です。特に注意が（1.1.3およびプロトコルの2.1.5へのステップ1.1.1を参照）、ホルマリンやグルタルアルデヒドで撮影する必要があります。サンプルを損傷するか、前のステップを台無しにすることなく、必要に応じて、プロセスが長時間停止することができ、特定の工程は、（ 例えば、1.1.5、1.2.3、および1.3.5ステップ）があります。コストの観点から、機器の多くは、いくつかの製剤（ 例えば、CPDアルミニウム容器とスタブホルダー）に再利用することができ、及び試薬は全て商業的供給業者から入手できる非高価な化学物質です。
これらの手順の欠点は、アルデヒドとエタノールとキー物資の不足や技術の限界のための適切な化学廃棄物処理の必要性。このようなスパッタコーター、CPDのためのCO 2気筒のためのゴールドディスクのような材料は、事前にチェックする必要があります。彼らは連続使用している場合は、研究室では、最終的にはコストを上昇させ、それらの複数の株式を、必要になります。個々の研究者は、多くの場合、消耗品のこれらのタイプのメンテナンスに由来する費用を正当化できないため、またはそれらが単に連続SEMを使用する必要はなく、これらの手順は、最近外部電子顕微鏡サービスを実験室で行われる傾向があります。
SEMの観察手法は、表面の高倍率の研究に限られています。内部組織を観察する必要がある場合、サンプルは、内部組織の外観を探索するのに適切な方法で切断する必要があります。高ミリアンペアで細胞の内部側面を探求するために、gnification、透過型電子顕微鏡（TEM）が必要となります。プロトコル内の重要なステップは、衝撃的な変化と空気との直接接触からの安全な組織を維持することが重要であるCPD処理、前のサンプルの適切な固定および脱水されています。また、CPDの試料室の圧力変化と試料の異なるタイプの堆積されたコーティングの量の慎重な管理が重要です。
これらの制限や特別な操作にもかかわらず、SEMは、ここに記載されているプロトコルを、以下の生物学的サンプルの研究は、このような細胞壁及び臓器歪み（ 図1、図4、5）、観測上の制限など、いくつかの一般的な問題の解決のために可能にウェットと液体環境（ 図5、図6）、および感受性細胞の破壊（ 図1C、1D）からの構造の成長。
ここで紹介するプロトコルはalloweていますサプロレグニア 47の嚢胞で、このような脊椎構造などの伝統的な分類学的特性の再解釈と尋問をdは。異なる表面上サプロレグニア棘の差動成長パターンは、この機能の不安定性と種の診断のためのその限界を示しています。分類学的研究、器官の発達の段階、および感染症に関連する特性の捕獲に加えて、前に観測されたことがない組織の機能は、これらの技術のおかげで検討されています。現在、このプロトコルは、33を検討されるのを待っている事例の数千に拡張することができます。査読文献データベースScopusのによると、最後の最後の5年間で植物（4914）、卵菌類（21）および真菌（2490）のSEM画像を扱った論文の7425の出版物がありました。この事実は、SEM画像を用いて、卵菌類の研究は、と比較してまだ非常に希少であることを示唆しています植物や菌類。 ESEMで、数字はさらに低くなっています。植物337、卵菌類における1および真菌における250：588同じ時間スパンでの写本があります。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、このマニュアルでは、唯一の著者の見解を反映し、欧州委員会は、情報を挙げることができる任意の使用のための責任を負うことはできません付与契約番号634429.の下で、欧州連合（EU）のホライゾン2020年研究と技術革新プログラムから資金提供を受けていますその中に含まれます。我々はまた、レアルハルディンボタニコ、CSIC製の資金拠出を認めます。 SRはサプロレグニアで彼女の研究をサポートするため、欧州連合（EU）[ITN-SAPRO-238550]に感謝しています。我々はまた、親切Phelloriniaのherculanea画像を提供し、処理サンプルについてB.プエヨ（図5）のためのフランシスコカロンジュに感謝したいと思います。すべての画像はマドリードでレアルハルディンボタニコ-CSICのSEMサービスによって撮影されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
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