Abstract
Vanliga problem i bearbetning av biologiska prover för observationer med svepelektronmikroskop (SEM) innefattar cellkollaps, behandling av prover från våta mikromiljöer och celldöd. Använda unga blommor vävnader, Algsvampar cystor och svampsporer (Agaricales) som exempel, specifika protokoll för att behandla känsliga prover beskrivs här som övervinner några av de största utmaningarna i provbehandling för bildtagning under SEM.
Blommor meristems fast med FAA (Formalin Ättiksyra-alkohol) och behandlas med den kritiska punkten Dryer (CPD) inte visa kollapsade cellväggar eller förvrängda organ. Dessa resultat är avgörande för återuppbyggnaden av blommor utveckling. En liknande CPD-baserad behandling av prover från våta mikromiljöer, såsom glutaraldehydfixerade Algsvampar cystor, är optimalt att testa differential tillväxten av diagnostiska egenskaperna (t.ex., cysta ryggar) på olika typer av SUbstrates. Förstörelse av sjuksköterska celler fästa till svampsporer undveks efter rehydrering, uttorkning, och CPD behandling, ett viktigt steg för ytterligare funktionella studier av dessa celler.
Protokollen som beskrivs här representerar låg kostnad och snabbt alternativ för förvärv av god kvalitet bilder att rekonstruera tillväxtprocesser och att studera diagnostiska egenskaper.
Introduction
I biologi, har användningen av svepelektronmikroskopi (SEM) utsträckts till studier av strukturella utvecklingen, jämförande morfologi, organutveckling, och karakterisering av populationer eller arter 1. Med två-dimensionell bild av mikroskopiska strukturer, områden såsom Mikromorfologi och systematik dragit nytta SEM förskott teknik sedan andra halvan av 20-talet. Till exempel införandet av tronsputterbeläggningsmetod på 1970-talet gjorde möjliga observationer av ömtåliga material, såsom skott spetsar och blommor som ökar avbildning av icke-ledande vävnader 2, 3. SEM använder elektroner utkastade från ytan av provet för att återskapa topografin i en hög vakuum 4.
Studier med SEM fokuseras i både slutsats strukturella karaktärer och återuppbyggnaden av growth processer. Nya strukturella tecken som är relevanta för taxonomi och systematik av ett brett spektrum av organismer har upptäckts från SEM observationer. Till exempel, växtegenskaper som används för arter diagnos eller supraspecific klassificeringar, såsom vestured gropar av trä 5, stigma mångfald 6, Nectary och blommig morfologi 7, 8, trichome detaljer 9 och pollenkorn 10, 11, kan inte korrekt visualiseras utan SEM. Framgångsrika observationer med konventionell SEM har också uppnåtts för lång tid formalinfixerade organismer 12 och växt herbarieexemplar 13.
Å andra sidan, studier av rekonstruktion av tillväxtprocesser som använder SEM innebär ett brett spektrum av ämnen, såsom organutveckling 14, infeTGÄRDER inducerade av bakterier 15, växtrötter fysiologi 16, parasit-värd fästmekanismer 17, 18, drog effekter på parasiter 19, mycoparasitism och antibiosis 20, 21, tillväxt missbildning 22, jämförande utveckling av vilda och muterade individer 23, och hela livscykler 24. Även svepelektronmikroskop (ESEM) 25 kan ha viktiga fördelar för observation av våta biologiska prover i tillväxtprocesser, kan känsliga material fortfarande äventyras även i lågvakuum skick ESEM), och måste behandlas på lämpligt sätt för att undvika förlust värdefulla morfologiska observation.
I detta papper, en översyn av särskilda regler för SEM-observation av tre difftekniker när typer av prover presenteras blom meristem, oomyceter (Saprolegnia) och svampmaterial. Dessa protokoll sammanställa erfarenheterna från våra tidigare SEM-baserade studier 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, där särskilda svårigheter och alternativa lösningar har påträffats. När det gäller anläggningen jämförande utvecklings- och strukturstudier, användningen av SEM startade på 1970-talet 34, 35, och sedan upptäckte forskare att vissa blommor funktioner är mer labil än man tidigare trott 36. Rekonstruktion av blommor utveckling innebär fångst av alla stadier mellan unga blom meristems och blomningen. För att nå detta mål är det essential att prov topografi och cellväggen integritet inte äventyras efter fixering och efterföljande uttorkning. Unga blommor meristems är särskilt känsliga för cellväggen kollapsar (figurerna 1a, 1b). På samma sätt, känsliga strukturer såsom nectaries, kronblad, pistillmärken och sporangier kräver effektiva och undamaging protokoll. Det här omdömet sammanfattar en optimal protokoll för att hålla unga och känsliga vävnader intakt för SEM avbildning.
I fallet med Oomycetes (Stramenopiles) -en av de mest skiftande och omfattande grupper av parasiter, med värdar som sträcker sig från mikrober och växter till ryggradslösa djur och ryggradsdjur 37 - det finns sporer som växer och utvecklas i en fuktig miljö. Detta tillstånd utgör en utmaning för SEM-observation eftersom sporerna behöver en tillräckligt underlag inte lämpar sig för vanliga SEM-protokoll. Bland Oomycetes, arter av Saprolegnia är av särskilt intresse eftersom de can orsaka allvarliga minskningar i vattenbruk, fiske och groddjurspopulationer 38. Mikromorfologiska egenskaper, såsom krok ryggar av cystor, har visat sig vara användbara för att identifiera arter av Saprolegnia, som är grundläggande för att fastställa infektionskontroller och potentiella behandlingar 39. Här, det finns ett experimentellt protokoll för att jämföra mönster av ryggraden tillväxt av cystor på olika substrat och för att manipulera provet för kritisk punkt tork (CPD) beredning och efterföljande SEM-observation.
I ett tredje fall, det finns intressanta resultat som kom upp efter en inspektion av sporer av svampen phellorinia herculanea f. stellata f. nova (Agaricales) 31. Tillsammans med sporer, var en grupp av oväntade plantskola celler identifierades under SEM. Med tidigare traditionella protokoll och obehandlat material, kom sjuksköterskan cellerna out fullständigt kollapsat (figur 1c). Ytterligare slutsatser om särskilda vävnader associerade till sporerna kan göras med enkla men viktiga ändringar av de standardmetoder som beskrivs här (figur 1d).
I denna översyn finns detaljerade SEM protokoll som kan användas för att ta itu med olika problem i samband med SEM-observation i angiospermer, Oomycetes och Agaricales, såsom cellkollaps och meristemvävnad krympning, icke-optimal tillväxt av cysta ryggar, och förstörelse av efemära vävnader, respektive.
Figur 1: Jämförelse av prover som behandlats utan (a, c) och (b, d) protokollet FAA-etanol-CPD. (A - b) Blom knoppar av Anacyclus clavatus, mid-utveckling. Knopp behandlades med osmiumtetroxid 46 </ sup> (a) och Bud behandlades med FAA-CPD-protokollet (b). (C - d) Nurse celler med sporer av phellorinia herculanea f. stellata. Torkade prover utan någon behandling (c) och med det protokoll som beskrivs här för Agaricales (d). Sporer i orange. Skalor: (ab) 100 ^ m, (cd) 50 | j, m. Bilder togs av Y. Ruiz-León. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll omfattar sex huvudsektioner, tre ägnas åt specifika organismer (avsnitt 1-3), och tre som beskriver de förfaranden som är gemensamma för alla (4-6). Asterisker (*) indikerar steg modifierade av praktiker.
1. Studier av att utveckla och fullt utvecklade anläggningsstrukturer
- Insamling och fixering
- Om växtmaterialet samlas på en plats utan tillgång till ett dragskåp, införa och fördjupa materialet i 70% etanol i centrifugrör. Helst doppa materialet efter 48 timmar i FAA (steg 1.1.1-1.1.3) för att undvika överdriven uttorkning i etanolen. Om ett dragskåp är tillgänglig för växtmaterialet, ignorera det här steget och fortsätta med 1.1.1.
- Förbered formalin-ättik-alkohol (FAA) fixativ i ett dragskåp utrustat med en aldehyd-filter. Tillsätt 85 delar av 70% denaturerad etanol, 10 delar 60% formaldehydlösning, och 5 delar isättika. Förbered FAAstrax före fastställande av material, som dess långtidslagring rekommenderas inte 40.
- Enligt dragskåp, häll lager av FAA i enskilda bred mun och täta plastflaskor. Använd så många flaskor som det finns prover tillgängliga och skapa etiketter för providentifiering.
- Välj blomster eller vegetativa meristems att fixa, så att de inte skadas av insekter, svampar, eller extrema väderförhållanden. Klippa grenar, ta bort oönskat material och deponera provet omedelbart i FAA lösning.
- Efter 72-96 timmar, häll FAA i en plastbehållare för kemisk destruktion. Omedelbart, tvätta proverna tre gånger med färsk 70% etanol för att avlägsna eventuellt kvarvarande FAA. Fasta material kan lagras på obestämd tid i 70% etanol.
- Dissection och uttorkning
- Dissekera fasta materialet i 70% etanol under stereo hjälp av ultrafina pincett, neEdles, pincett, borstar och mikroskalpeller (den maximala storleken av vävnaden bör vara cirka 1 cm 3, eller 2 cm för platt material). Dissekera prov till en Petri-skål täckt med etanol för att förhindra vävnaderna från att torka. Använd en petriskål med basen täckt med torr svart kisel bättre se de kontrasterande vita vävnader.
- Placera dissekerade material i provbehållare för den kritiska punkten tork (CPD, figur 2a). Vid denna tidpunkt, sänk behållarna i petriskål med 70% etanol, och inkluderar providentifieringsetiketter (gjord med papper och penna). För mer effektiv torkning för ytterligare manipulation, undvika att blanda unga och mogna prov i samma behållare. *
- Sätt lock på behållarna och placera dem i plast centrifugrör med massor av 70% etanol. Lagra rören över natten om materialet inte behandlas omedelbart.
- Överför dissekerade materialet genom följande etanol seriesi hermetiska burkar eller centrifugrör: 70%, 90%, 100% och 100%. Lämnar proverna i varje lösning under 1 h vid minst. Hålla proverna över natten i en 100% etanollösning.
- Överför behållarna med materialet till CPD (avsnitt 4).
- Montering och förbereder växtvävnader för SEM observation
- Skriv providentifikationsnummer under SEM provhållare (dvs aluminium stubs). Täcka toppen av stubbar med dubbelhäftande tejp. Placera stubbar in i en provhållare (figur 2b).
- Under en stereomikroskop, försiktigt öppna containrar som innehåller de unga och ömtåliga prover redan torkade i CPD. Tänk på att efter CPD behandlingen proverna blir lättare och känslig för elektrostatik. Stäng behållarna när prover har tagits ut för att undvika damm eller föroreningar.
- Sätt proverna på den klibbiga ytan av stubbar, planera den önskadeläge (när proverna röra vid ytan, är det mycket svårt att ta bort dem). Försök inte att bära en större dissektion på denna punkt; bara ta bort oönskade vävnad som är lätt att plocka upp. För Palynologiska studier, dissekera ståndarknappar och öppna dem för att exponera pollen på stubbar.
- Put långa prover (t.ex., 2 cm lång) såsom blomställningar i det horisontella läget. När det är möjligt, orient prover av samma struktur för polära, från sidan och underifrån. Lämna tillräckligt med utrymme mellan prover på stubben.
- Om proverna inte kan behandlas omedelbart, hålla dem skyddade natten i en hermetisk behållare med kiselgel för att undvika rehydrering (Figur 2c) *. Coat proverna med hjälp av sputter beläggaren och överföra dem till SEM (avsnitten 5 och 6).
Figur 2: Verktyg för prov manipulatipå och bearbetning innan SEM observation. (A) stål som provbehållare med perforerade väggar för etanol / CO2 utbyte i CPD kammaren. (B) Stål stubbar i en plastprovhållare. (C) Glasbehållare används för att hålla proverna skyddas från fukt och damm. Vid basen, det finns ett fack för silikagel. (D) kritisk punkt torktumlare. På framsidan finns (från vänster till höger) manometern, strömbrytaren, den temperaturreglering och temperaturdisplayen. Vanliga arbetstryck för CO2 etanol utbyte är 60 bar (800 psi). I toppen finns det fyra ventiler (kontroller inlopp, avlopp, ventilation och avgas) flankerar den centrala provkammaren. Bilder togs av Y. Ruiz-León och MA Bello. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Växande och fastställande av cystor
- Förbered pepton och glukos (PG-l) media 41 med hjälp av D - (+) - glukos (6 g) och mykologiska pepton (3 g) *. Lägga till upp till 900 ml kranvatten och autoklavera 40 minuter vid 121 ° C. Häll 50 ml av den tidigare autoklaverad lösning A (NaH 2 PO 4, 0,13 M) och 50 ml av lösning B (Na 2 HPO 4, 0,13 M).
- Från stamkulturer av stammar av Saprolegnia parasitica upprätthålls på pepton, glukos, agar media (PGA, som framställs som PG-l men tillsats av 10 g av den europeiska bakteriologisk agar till glukos och pepton före autoklav), växa mycel kolonier i 0,5 ml av PG-l dropparna för 24-48 h vid 20 ° C i petri~~POS=TRUNC. Inducera sporbildning genom tvättning av mycel med autoklaverat kranvatten tre gånger och inkubera dem i 15 timmar vid 20 ° C= "xref"> 42, 43.
- Samla de frigjorda sekundära zoosporer genom att försiktigt pipettera den övre delen av suspensionen och pool dem i 1 ml portioner. Skaka kraftigt de zoosporer för 30 s genom att vortexa att producera sekundära cystor 44.
- För att testa differential tillväxten av ryggar av cystor, på separata petriskålar (P60), satte 0,5 ml av sekundär cysta fjädring på olika ytor (dvs, kol, guld, och koppar TEM galler, lax och kummel fiskfjäll (tidigare blekta) och täckglas) *. Inkubera cystor vid 20 ° C under 70 min, vilket gynnar fastsättningen av cystor till ytan.
- Avlägsna vätskan och tillsätt 0,5 ml av 2% glutaraldehyd till varje yta för fixering av cystor. Hålla proverna vid rumstemperatur under ett dragskåp i 1 h.
- Avlägsna glutaraldehyden och dehydratisera provet genom en etanolserie (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% och 100%), tillsätta 5 ml av varje etanollösning under 15 min. En gång i den sista 100% etanollösning, kan provet lagras i upp till en månad i en försluten petriskål. I detta skede proverna är redo att torkas i CPD.
- Försiktigt överföra gallren och skalor från petriskålen till en hållare lämplig för CPD (§ 4). För detta steg, använda en CPD rutnät hållare eller en stapling provhållare, som håller proven åtskilda från varandra. Ta gallren och skalor med pincett, med tanke på att de cystor ska vara vänd uppåt på gallren hela tiden. *
- Montering och förbereder cysta prover för SEM observation
- Montera gallren och skalor på aluminium stubbar som tidigare täcktes med dubbelhäftande kol tejp och märkta nedanför.
- Överför proverna till sputter beläggaren (avsnitt 5).
- Beakta prov under SEM (avsnitt 6).
phellorinia herculanea enligt SEM
- Rehydrering och uttorkning av sporer
- Wrap varje prov noggrant med filterpapper och bildar blyertsmärkta kuvert ~ 0,5-1 cm 2, noga med att inte krossa dem. Täta filterpapper med gem. Överför packade proverna till en petriskål och fördjupa dem i 10 ml vatten att rehydrera vävnader runt sporerna.
- Omedelbart sätta proverna i en mikrovågsugn (600 W i ca 20 s). Ta bort materialet när vattnet börjar avdunsta, och låt den svalna i rumstemperatur.
- Passerar proverna genom följande etanolserier: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% och 100%. Beroende på mängden av prover, använder en bägare eller centrifugrör för detta steg. Lämnar proverna under 15 minuter i varje lösning.
- Placera proverna till CPD (avsnitt 4).
- Montering och preparing sporer för SEM-observation
- Öppna kuverten. Pour sporerna på en tidigare förberedd talong med dubbelhäftande tejp. Alternativt, samla sporerna med den klibbiga ytan av stubbar, noga med att inte krossa dem *.
- Om proverna innehåller få sporer, utöver det tidigare steget, skära en liten bit av höljet (~ 1 mm 2) och placera den på en ny påbörjad *.
- Placera vävnaderna in i sputter beläggaren (avsnitt 5).
- Provet i SEM (avsnitt 6).
4. Torkning av material med hjälp av en kritisk punkt torktumlare (CPD, figur 2d)
- Använd CPD i ett ventilerat område och kontrollera att alla ventiler i maskinen är stängda. Kontrollera om provkammaren är tom och ren.
- Slå på maskinen och kontrollera att temperaturreglersystem testet sker automatiskt. Om CPD har en extern kylning bad systemet, kontrollera vattennivåerna innan du byter jagt på.
- Följ tillverkarens instruktioner för den specifika CPD används för etanol och CO2 utbyte. För säkerhets skull, bär på det här steget under överinseende av någon utbildad för användning av maskinen. Kom ihåg att det utsätts för snabba tryckförändringar, kan det blåsa ut våldsamt.
- Ta ut prover och fortsätta med steg 1,3 om att arbeta med växtvävnader, steg 2,2 om att arbeta med Oomycetes cystor, och steg 3,2 om att arbeta med svampsporer.
5. Beläggning Samples med guld Använda Sputter Coater (figur 3a)
- Kontrollera sputter beläggaren. Kontrollera att guldkatodmålet är i gott skick. Använda en luddfri trasa dränkt med 90% etanol för att rengöra väggarna i vakuumkammaren och locket kammaren om så behövs.
- Märk sputter hållaren med siffrorna bredvid varje påbörjad hål för ytterligare identifiering av proverna under mikroskop. Försiktigt placera stubbar laddas med samples och säkra dem. Använd en roterande planetprovskedet för att säkerställa en jämn beläggning på prover med oregelbundna ytor.
- Följ tillverkarens instruktioner för att justera inställningar som arbetsavstånd, drift gastrycket (t.ex. 5 x 10 -1 - 7 x 10 -1 mbar) (t.ex., 30 mm.), Sputtring tid (t.ex. 50 s), tjockleken på guldskiktet (t.ex. 12 nm) strömmen (t.ex. 15 mA) och spänningsmatningen (t.ex. 600 V) 45.
- Ta bort stubbar och ta dem till SEM (avsnitt 6). Alternativt, placera stubbar i en sluten behållare med kiselgel (Figur 2c).
Figur 3: sputter beläggaren (a) och svepelektronmikroskop (b). (A) framifrån av vakuumkammaren (vänster), gas valve, timer, vakuum, och nuvarande kontroller. (B) från sidan av de SEM huvudkomponenter (från vänster till höger): vakuum kolonnen med provkammaren, datorskärmen med kontrollerna, och kammaren monitor. Bilder togs av Y. Ruiz-León. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Observation under svepelektronmikroskop (SEM, figur 3b)
- SEM startar
- Följ tillverkarens instruktioner för att starta och ställa in SEM, justera provhöjd målet öppningsdiameter (t.ex. för växter 2 pm och för svampar och oomyceter 4 pm), driftspänning (t.ex., 15 kV).
- Kontrollera den korrekta inriktningen av elektronstrålesystemet och ställa in den axiella inriktningen och de stigmators enligt tillverkarnas indikationer. justera than arbetsavstånd för att få ett tillräckligt skärpedjup.
- bild~~POS=TRUNC
- Få en fokuserad bild av provet och använda den som utgångspunkt. Öka förstoringen nära den maximala nivå och fokusera bilden igen. Välj områden med ytoregelbundenheter såsom hål. Korrigera astigmatism och justera optimal kontrast och ljusstyrka.
- Fånga SEM Bild med hög upplösning. Använd BSE-detektorn om bilden visar att proverna är laddade. Annars ställer SE detektorn. Ändra detektorerna efter tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blommor utveckling och Fixering av att utveckla och färdigformade anläggningsstrukturer
Använda FAA-CPD protokoll som beskrivs här, är unga och mogna växtvävnader optimalt fasta och uttorkade för SEM avbildning. Processer såsom blommor utveckling kan rekonstrueras eftersom topografin och formen av knopparna inte snedvrids genom cell krymper (figurerna 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplexa former kan framgångsrikt täckt med ett enhetligt skikt av ledande material (metall från sputter beläggaren), vilket gör att återhämtningen i övrigt nås detaljer (figurerna 4g-I, 5e). Bra kvalitet bilder av prover från våta mikromiljöer, som används för att överladdas med elektronströmmen om dåligt uttorkad och belagd, kan åstadkommas (figur 4f, 5A, 5B). Viktiga detaljer såsom pollenväggytan (Figur 5b, 5c) och olika typer av indumenta (figurerna 5d-g) kan studeras på djupet utan konstgjorda eller oönskade partiklar eller förvrängda former.
Figur 4: Early (a, b), mitten (c-e), och sen (fi) blommig utveckling fångas under SEM. (A) klase av Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze med flera blommor meristem. (B) Top bild av en ung klase Polygala violacea Aubl. (C) Blom av krameria ixine Loefl. under gynoecium differentiering. (D - e) knoppar av Erythrina sp. (F) från sidan av en blomma av krameria ixine. Ståndarknappar och stil sticker. (G - i) Hoya carnosa (L.) R. Brown. (
Figur 5: SEM mikrofotografier av sporangier och pollen (a, b) detaljerade ytor (c-e), och indumenta (f - g). (A) sporangier av Dryopteris sp. (B) Pollen av Prunus dulcis DA Webb landning på stigma. (C) Pollen av Nepenthes alata Blanco. (D) från sidan av en blomställning av Erigeron karvinskianus DC. Bild tagen med detektor BSE alternativ. (E) från sidan av moss Peristoma sp. (F) Glandulär och ingen körtel trichomes på abaxial ytan av ett blad av Rosmarinus officin L. (G) Uppifrån av blad platta skalor av Olea europaea L. Skalor: (a) 400 | im, (b) 60 | j, m, (c) 5 | im, (d) 4 mm, (e) 600 ^ m, (f) 200 | j, m, (g) 600 | im. Bilder togs av Y. Ruiz-León. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Effekt av olika substrat på Spine tillväxt av sekundära cystor Saprolegnia parasitica
(tabell 1, figur 6a). På kolet och guld galler ryggarna är kortare, böjt och växa rikligt runt cystor utan att bilda slingor (fig 6b, 6d). Även på koppargaller, de ryggar tenderade att krypa utan looping, några av dem avlånga (figur 6c). På fiskfjäll, spines var lockigt, rikligt runt ytan och ibland bildade loopas ändar (figur 6e-f).
Figur 6: Differentialtillväxtmönster av ryggar Saprolegnia parasitica i cystor nedsänkta i flytande media. (A) Glass. (B) Carbon. (C) koppar. (D) guld. (E) Kummel skala. (F) Salmon skala. Raka ryggar utvecklades på glas och koppar, medan böjda ryggar bildades på kol, guld, och fiskfjäll. De krökta tips (vita pilar) av taggar kan observeras i alla taggar som växer på glas och i några ryggar på fiskfjäll. Cysta väggarna är i gult. Skala: 20 | j, m. Bilder togs av Y. Ruiz-León och S. Rezinciuc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Yta | ryggraden morfologi | |
| Förlängning | Slinga vid spetsen | |
| glas täck | Bra töjning, ryggar lätt att räkna Närvarande | |
| Fiskfjäll | Ryggar med lockigt form inte lätt att räkna | Närvarande |
| TEM galler | Korta och lockigt ryggar inte lätt att räkna | Frånvarande |
Tabell 1: Spine morfologi med användning av olika typer av substrat.
Oväntade Observationer i phellorinia herculanea f. stellata
Bortsett från den oväntade upptäckten av laticiferous hyfer på exoperidium P. herculanea, Calonge et al. 31 fann klotformig och glatta sjuksköterska-celler (8-13 ^ m), blandade med sporer i materialet dehydrerades med CPD tack vare den rehydrering steget utförs i en mikrovågsugn. (Figur 1d). Strukturen och detaljer av väggarna i than sjuksköterska celler och sporer är väl bevarade trots deras differential sammansättning (Fig 1c-d).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När det gäller vanliga SEM protokoll, de förfaranden som presenteras här omfattar relativt snabb, lätt att följa, och låg kostnad metoder. Beroende på mängden av prov och på den lättare bearbetning, det tar fyra till fem dagar för att få bilder av god kvalitet. Inklusive lämpliga säkerhetsåtgärder för CPD och SEM drift förfarandena är lätta att hantera. Särskild försiktighet bör iakttas med formalin och glutaraldehyd (se steg 1.1.1 till 1.1.3 och 2.1.5 i protokollet). Det finns vissa steg där, om det behövs, kan processen stoppas under en längre tid utan att skada proverna eller förstöra tidigare steg (t.ex. steg 1.1.5, 1.2.3 och 1.3.5). När det gäller kostnader, en stor del av utrustningen kan återanvändas för flera preparat (t.ex. containrar CPD aluminium och axelhållare), och reagens är icke-dyra kemikalier tillgängliga från alla kommersiella leverantörer.
Nackdelar med dessa förfaranden ärbehovet av lämplig kemiskt avfall för aldehyder och etanolen och bristen på viktiga leveranser och begränsningarna i tekniken. Material såsom guldskivan för sputter beläggaren och CO2 cylinder för CPD bör kontrolleras i förväg. Om de är i kontinuerlig drift, kommer laboratoriet kräver flera lager av dem, som så småningom höjer kostnaderna. Eftersom enskilda forskare ofta inte kan motivera de kostnader som härrör från underhåll av dessa typer av leveranser, eller de helt enkelt inte behöver använda SEM kontinuerligt dessa förfaranden tenderar numera utföras i laboratorier med externa elektronmikroskopi tjänster.
Observationstekniken enligt SEM är begränsad till en hög förstoring studie av ytor. Om inre vävnader måste iakttas, bör proverna skäras i det korrekta sättet att utforska det yttre utseendet av inre vävnader. Att utforska interna aspekter av cellerna vid hög magnification, är ett transmissionselektronmikroskop (TEM) som krävs. Kritiska steg i protokollet är korrekt fixering och dehydrering av proverna före CPD behandling, där det är viktigt att hålla vävnader säker från chockerande förändringar och direkt kontakt med luften. Dessutom är viktigt noggrann hantering av tryckförändringen i CPD provkammaren och mängden av beläggning avsatt på olika typer av prover.
Trots dessa begränsningar och speciella manipulationer, studier av biologiska prover med SEM efter protokollen som beskrivs här gör det möjligt för att lösa några vanliga problem, såsom cellväggen och organ distorsion (figurerna 1, 4, 5), restriktionerna för observation och tillväxt av strukturer som kommer från våta och flytande miljöer (fig 5, 6), och förstörelsen av känsliga celler (fig 1c, 1d).
De protokoll som presenteras här har allowed den omtolkning och ifrågasättande av traditionella taxonomiska egenskaper, såsom ryggraden struktur i cystor av Saprolegnia 47. Differentialtillväxtmönster av Saprolegnia ryggar på olika ytor visar labilitet av denna funktion och dess begränsningar för arter diagnos. Förutom fångst av relevanta egenskaper för taxonomiska studier, utvecklingsstadier organ, och infektionssjukdomar, funktioner av vävnader aldrig observerats tidigare har undersökts tack vare dessa tekniker. Nu kan detta protokoll utvidgas till tusentals fallstudier som väntar på att undersökas 33. Enligt granskad litteratur databas Scopus i sista de senaste fem åren har det varit 7,425 publikationer av papper som behandlar SEM avbildning av växter (4914), oomyceter (21) och svampar (2490). Detta faktum tyder på att forskning i Oomycetes använder SEM avbildning är fortfarande mycket sällsynt i jämförelse medväxter och svampar. Med ESEM är siffrorna ännu lägre. Det finns 588 manuskript i samma tidsperiod: 337 i växter, 1 i Oomycetes och 250 i svampar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta projekt har fått stöd från EU: s Horisont 2020 forsknings- och innovationsprogram enligt bidragsavtal nr 634429. Denna publikation ansvarar endast upphovsmannen, och kommissionen kan inte hållas ansvarig för någon användning som kan göras av informationen som finns däri. Vi erkänner också det finansiella bidraget från Real Jardín Botánico, CSIC. SR är tacksam mot Europeiska unionen [ITN-Sapro-238.550] för att stödja sin forskning i Saprolegnia. Vi vill också tacka Francisco Calonge för vänligt ge phellorinia herculanea bilder och B. Pueyo för bearbetning prover (Figur 5). Alla bilder är tagna av SEM tjänsten på Real Jardín Botánico-CSIC i Madrid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D-(+)-Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. Plant microtechnique. , McGrow-Hill. New York. (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , Springer Science + Business Media, LLC. NY. (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , Universidad Internacional Menéndez Pelayo. Doctoral Thesis (2013).
