Summary
Denne protokollen beskriver dannelse av murine ortotopiske blæretumorer i hunn C57BL / 6J mus og overvåking av tumorvekst.
Abstract
Denne protokollen beskriver dannelse av blæretumorer i hunn C57BL / 6J-mus ved bruk av murine blærecancercellelinje MB49, som har blitt modifisert til å utskille human prostata spesifikt antigen (PSA), og fremgangsmåten for bekreftelse av tumorimplantering. Kort fortalt blir musene bedøvet bruker injiserbare legemidler og er laget for å ligge i ryggposisjon. Urin forlates fra blæren og 50 ul av poly-L-lysin (PLL) blir langsomt tildryppet med en hastighet på 10 ul / 20 s ved anvendelse av en 24 G IV-kateter. Det er igjen i blæren i 20 min ved å legge stopper kateteret. Kateteret fjernes og PLL er forlatt med lett press på blæren. Dette etterfølges av instillasjon av den murine blærecancercellelinje (1 x 10 5 celler / 50 ul) med en hastighet på 10 pl / 20 s. Kateteret er tettet for å hindre for tidlig evakuering. Etter 1 time blir musene gjenopplivet med en reversering narkotika, og blæren er forlatt. Den langsomme instillasjon hastighet er viktig,da det reduserer vesico-urinleder tilbakeløp, noe som kan føre til svulster å forekomme i den øvre urinveiene og i nyrene. Den cellelinje bør være godt resuspenderes å redusere klumping av celler, da dette kan føre til ujevnheter i tumorstørrelser etter implantasjon.
Denne teknikken induserer tumorer med høy effektivitet. Tumorvekst blir overvåket ved urin PSA sekresjon. PSA markør overvåkning er mer pålitelig enn ultralyd eller fluorescens avbildning for påvisning av nærvær av tumorer i blæren. Svulster i mus generelt nå en maksimal størrelse som negativt påvirker helsen ved ca 3-4 uker hvis venstre ubehandlet. Ved å overvåke tumorvekst, er det mulig å differensiere mus som ble herdet fra de som ikke var fått implantert med tumor. Med bare ende-punkt-analyse, kan den sistnevnte være feilaktig antas å ha blitt herdet ved terapi.
Introduction
Målet med denne metoden er å generere murine ortotopiske blæren svulster og for å overvåke de implanterte svulster så nøyaktig som mulig, slik at mus uten svulst implantasjon ikke er antatt å ha blitt kurert ved utgangen av punkt-analyse. Totalt sett, idet fremgangsmåten er vist vil redusere behovet for et stort antall mus for eksperimentell analyse og sikre større nøyaktighet ved bestemmelse terapeutiske resultater.
Utviklingen av en ortotopisk modell for kreft er viktig, da implantere tumorceller subkutant ikke rekapitulere miljøet av klinisk sykdom eller muliggjøre utvikling av terapeutiske strategier. Arkitekturen av blæren tillater instillasjon av blære kreft terapi direkte inn i blæren med minimale systemiske effekter. Således dyremodeller som rekapitulere dette miljøet, slik som en ortotopisk modell, er viktig for evaluering av nye behandlingsformer. Konklusjonene fra noen eksperimentelle oppsettet er dependent på de begrensninger i modellen.
Flere teknikker er blitt utviklet for fremstilling av ortotopiske blæren svulster i mus. Disse er avhengige av å skade glykosaminoglykan lag av blæren, slik at tumorceller som skal implanteres. Teknikkene som benyttes inkluderer elektrokauterisering, noe som resulterer i et enkelt punkt av skader i blæreveggen, som fører til tumorutvikling på ett sted i blæren 1,2. Men suksessen rate av svulst implantering hjelp elektrokauterisering er operatøravhengig varierende 10-90%, og det inkluderer en fare for at blæreveggen blir punktert, noe som fører til svulster utvikler seg i bukhulen. Kjemisk kirurgi utføres ved hjelp av sølvnitrat, som skader blæreveggen 3. Tilsvarende har syren blitt anvendt for å ødelegge blæreveggen 4. Trypsin har også blitt brukt for å skade blæren også 5. Disse metodene kan resultere i utvikling av mer enn en tumor i blæren.Videre er det en fare for alvorlige skader på blæren hvis kjemikaliene er igjen i kontakt med blæreveggen for lenge. Den metode som er utviklet av Ninalga et al. benytter den positivt ladede poly-L-lysin (PLL) 6 molekyler å belegge blæreveggen; Dette gjør at de negativt ladede kreftceller å holde seg til glycosaminoglycan lag av blæren. Denne fremgangsmåte resulterer generelt i mer enn en tumor utvikling i blæren, men tumorimplantering er ved 80 - 100% 4,7. Teknisk sett er det også den enkleste fremgangsmåten for å utføre. For å sikre at de tumorer som utvikler seg er ganske selv i størrelse, er det viktig at tumorcellene ikke er gruppert i store klumper før implantasjon.
For å kunne vurdere terapeutisk effekt, er det best å utføre denne studie på mus med nokså like store svulster. Dermed vil en god deteksjonssystem som kan måle tumorstørrelse kort tid etter implantering er viktig. Flere strategier har been brukes til å evaluere tumorer. Disse omfatter magnetisk resonansavbildning (MRI) 8-10, fluorescens 11, bioluminescens 12,13, ultralyd 14, og enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Mens MRI og ultralyd ikke krever modifiseringer av tumorceller, er det behov for følsomme utstyr og kontrastmidler for MRI. De fluorescence-, luminescence-, og ELISA-baserte analyser krever endring av kreftceller til å uttrykke markørproteiner som kan oppdages av disse metodene. For luminescens, er et substrat som er nødvendig for påvisning av luciferase-aktivitet; således er det et ekstra trinn og økte kostnader. Både luminescens og fluorescens krever spesialisert utstyr. For å produsere fluorescens, grønt fluorescerende protein (GFP) ringslutning, som katalyseres av molekylært oksygen, er nødvendig. Således kan GFP uttrykk være variabel innenfor en tumormasse, avhengig av tilgang på oksygen, noe som gjør dette til en ganske upålitelig markør
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeid levd opp til de Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer for bruk av dyr og håndtering (Protocol nummer 084/12) ved National University of Singapore.
1. Økende MB49-PSA celler in vitro og Måling PSA sekresjon
- Opprettholde murine blærekreftceller MB49-PSA 15 i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mmol / l L-glutamin, og 0,05 mg / ml penicillin-streptomycin i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Tilsett 200 ug / ml Hygromycin B for å opprettholde seleksjonstrykk for PSA-sekreterende celler.
- For å bestemme PSA sekresjon, plate 1 x 10 6 celler i en 6-brønns dyrkingsplate og inkuberes det ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2 i 48 timer.
- To dager senere, samle supernatanten for PSA måling.
- Ved hjelp av en Pasteur pipette overføre supernatant til et 15 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger i 5 min ved 250 x g for å fjerne flytende celler og rester. Hvis PSA-analysen blir utført på en annen dag, oppbevare den overliggende væske ved - 30 ° C i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hvis ikke, går du videre til neste trinn umiddelbart.
- Bestem PSA konsentrasjon ved hjelp av en human-fri PSA ELISA kit 7.
- Oppsummere de belagt celler.
- Ved hjelp av en Pasteur pipette, vaske cellene forsiktig med 1 ml DMEM. Aspirer og fjerne media.
- Tilsett 1 ml friskt medium og skrape forsiktig med en celleskrape for å løsne cellene fra brønnen.
- Overfør cellene til et mikrosentrifugerør og re-suspendere dem grundig for å sikre en enkeltcellesuspensjon.
- Blande like volumer av cellesuspensjonen og en 0,4% trypanblått-oppløsning. Telle de levende celler (som ikke tar opp fargestoff) ved hjelp av et hemocytometer.
- Beregn PSA uttrykk som ngPSA / ml media / 10 6 celler. PSA-ekspresjon av MB49-PSA-celler for implantasjon i mus er 80-120 ng / ml / 10 6 celler.
2. Bestemme Sensitivity av PSA-målinger ved ELISA og Real-time PCR-analyse
- Plate MB49-PSA celler i komplett DMEM medier i en seks-brønns dyrkingsplate med ulike mengder av foreldre MB49 celler slik at det er maksimum 1 x 10 6 celler per brønn (dvs. 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 eller 10 6 MB49-PSA-celler dyrkes med 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 eller 0-MB49-celler, henholdsvis).
- En dag senere, samle supernatanten for PSA måling, som beskrevet i trinn 1.3. Bestem PSA konsentrasjon ved hjelp av en human-fri PSA ELISA kit 7.
- Ekstrahere RNA fra cellene.
- Lyse denceller direkte i platen ved å tilsette 1 ml av RNA-ekstraksjon reagens.
- Inkuber i 5 min ved romtemperatur og overføre cellelysatet til et mikrosentrifugerør. Legg 0,2 ml kloroform og vortex prøvene kraftig i 15 sek. Inkuber dem i 3 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuger prøvene ved 12 000 xg i 15 min ved 4 ° C. overføre nøye den øvre vandige fase (0,5 ml) til et nytt rør uten å forstyrre interfase.
- Tilsett 0,5 ml isopropylalkohol. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger prøvene ved 12 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten helt, uten å forstyrre RNA-utfellingen på bunnen av røret.
- Vask pelleten en gang med 1 ml 75% etanol. Sentrifuger ved 7500 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern alle etanol og tillate pelleten lufttørke i 10 minutter.
- Oppløs RNA i 30 ul av nuklease-fritt vann. Inkuber i 5 min ved 60 ° C for å øke sålubility.
- Kvantifisere RNA ved å måle absorbansen ved hjelp av ultrafiolett (UV) spektroskopi ved 260 nm (A260). For å vurdere RNA renhet, måle absorbansen ved 280 nm (A280) og beregne A260 / A280-forhold som bør være over 1,6.
- Omvendt-transkribere cDNA fra 2 mikrogram av RNA.
- Fremstille reaksjonsblandingen på is og overføre det til 0,2 ml rør.
- I korthet sentrifuger rørene å spinne ned innholdet og for å fjerne luftbobler.
- Laster rørene inn i thermal cycler og utføre revers transkripsjon ved følgende betingelser: 60 minutter ved 37 ° C etterfulgt av 5 min ved 95 ° C. Når løp er avsluttet, holder cDNA-prøvene ved 4 ° C.
- Oppbevar prøvene ved - 30 ° C for langtidslagring.
- Utfør en real-time PCR-analyse for PSA og cytoplasmatiske beta aktin. Beta-aktin blir brukt til å normalisere prøvene. Utføre analysen på 100 ng av revers-transkribert RNA i en 96-brønners plate. Analysen alle prøver in triplo. Utføre 40 sykluser med følgende parametre: 2 minutter ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C, 15 s ved 95 ° C for denaturering, og 1 min ved 60 ° C. Sett laveste deteksjonsgrense på en syklus terskel (CT) av 35; dermed er enhver prøve med en CT-verdi utover 35 anses ikke oppdages.
3. Opprettholde tumorigenitet av MB49-PSA-cellelinje
MERK: Langvarig vekst in vitro fører til et tap av tumorigenitet. For å opprettholde tumorigenicity er MB49-PSA cellelinje passert gjennom musen minst en gang hvert 2. år.
- Celler.
- Høste eksponentielt voksende celler ved å skrape forsiktig med en steril celle skrape. Blande like volumer av cellesuspensjonen og en 0,4% trypanblått-oppløsning. Telle levende celler ved hjelp av en hemocytometer. Ikke implanter hvis mer enn 20% av cellene er døde.
- Beregne mengden av levende celler kreves (1 x 107 celler / ml) og overføre dem til en 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og kast supernatanten. Re-suspendere cellepelleten i DMEM blank media. Gjenta vask tre ganger for å fjerne alle spor av FBS før implantasjon.
- Hold cellesuspensjonen på is inntil musene er klar for implantering.
- Implantere tumorceller subkutant i mus på den dorsale flanke.
- Bedøve en 4- til 6-uker gamle C57BL6 / J mus ved anvendelse av en blanding av bedøvelses ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg, henholdsvis), injisert intraperitonealt i 0,1 ml per 10 g kroppsvekt.
- Barbere på høyrekanten for å eksponere huden.
- Ved hjelp av en pinsett, løfter huden for å skille den fra den underliggende muskel og injisere 0,1 ml av cellesuspensjonen (1 x 10 6 celler) subkutant med en 24 G nål. Mens nålen fjernes, klemme injeksjonsstedet i 5 til 10 s, slik at kreftceller gjøreikke lekke ut fra injeksjonsstedet.
- Gjenopplive mus med en subkutan injeksjon av atipamezol (1 mg / kg) ved 0,1 ml per 10 g kroppsvekt.
- Overvåk tumorvekst annenhver dag ved å måle tumordiameter ved hjelp calipers. Tumorvolumet blir beregnet ved hjelp av formelen V = (ab 2) / 2, hvor "a" er den lengste dimensjon, og "b" er den perpendikulære bredde, både i mm.
- Når tumorvolumet er minst 50 mm 3 (omtrent 7 dager), avlive mus med CO 2. Eksisere tumormassen med et par av sterile pinsetter og sakser under aseptiske betingelser og sted i DMEM.
- I en 6-brønns kulturplate, hakke tumoren i små stykker ved hjelp av sterile skalpeller. Bruke en 1 mL sprøyte stemplet som et "stampe" for å ytterligere disaggregert tumoren.
- Tilsett 3 ml komplett DMEM og opprettholder cellene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når cellene holder seg til plate (mellom en og to dager), tar ut mediene, rusk, og ikke-heftende celler ved å aspirere forsiktig med en steril Pasteur pipette. Vask to ganger med DMEM. Pass på å ikke forstyrre cellene.
- Tilsett 1 ml DMEM og høste cellene ved å skrape dem med en celleskrape. For å velge og utvide enkeltkolonier, telle celler ved hjelp av et hemocytometer og platen 1 celle pr brønn i en 96-brønners kulturplate. Kultur celler i DMEM med 200 ug / ml Hygromycin B ved 37 ° C og 5% CO2.
- Endre media og antibiotikum hver 4 - 5 dager. Overvåk cellene til de er på ca 80-90% sammenflytende. Re-plate cellene på en 24-brønners dyrkingsplate ved pipettering for å løsne cellene fra brønnen.
- Når cellene i 24-brønners kulturplate er konfluent, løsne dem ved å skrape med en celleskrape og plate dem i en 6-brønners kulturplate.
- Sikt de forskjellige kloner for PSA sekresjon, slik det er beskrevet i trinn 1. Cryo-bevare klonen med den høyeste PSA hemmeligion og bruke den for fremtidige museforsøk.
4. Implantere Tumor
MERK: Hver mus implantert med 1 x 10 5 MB49-PSA celler i 50 mL av DMEM tomme medier i blæren. På grunn av den døde plass i kateteret, alltid forberede ekstra volum (minst 100 mL ekstra per mus). En alternativ metode ville være å bruke en luftfylt sprøyte som beskrevet av Kasman et al. 5 i stedet for en fylt sprøyte.
- Celler.
- Én dag før implantering, når cellene er omtrent 80% konfluent, passasje av MB49-PSA tumorceller i fullstendig DMEM medium (supplert med 10% FBS, 2 mmol / l L-glutamin, 0,05 mg / ml penicillin-streptomycin, og 200 ug / ml Hygromycin B) ved 37 ° C og 5% CO2 ved et delingsforhold på 1: 2.
- På dagen for inngrepet, høste celler ved skraping av forsiktig med en steril celleskraper. Blande like volumer av cellesuspensjonen ogen 0,4% trypan blå løsning. Telle levende celler ved hjelp av en hemocytometer. Ikke implanter hvis mer enn 20% av cellene er døde.
- Beregne mengden av levende celler kreves (2 x 10 6 celler / ml) og overføre dem til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C og kast supernatanten. Re-suspendere cellepelleten i DMEM blank media. Gjenta vask tre ganger for å fjerne alle spor av FBS før implantasjon.
- Hold cellesuspensjonen på is inntil musene er klar for implantering.
- Tillat den 4- til 6-uker gamle hunn C57BL / 6J-mus for å akklimatisere seg i en uke før prosedyren. Alle dyr arbeidet må utføres i et biologisk sikkerhetskabinett for å opprettholde sterile forhold.
- Veie hver mus og injisere anestesi (75 mg / kg ketamin og 1 mg / kg medetomidin) intraperitonealt i 0,1 ml per 10 g kroppsvekt. Bodyweights bør være mellom 17 og 22 g. Bekreft anesthetization ved å observere ingen RespoNSE etter en tå klype.
- For identifisering merke i øret ved hjelp av en øre slag.
- Injiser Hartmann løsning eller sammensatte natriumlaktat intraperitonealt 0.1 ml per 10 g kroppsvekt hver 1-2 time for fuktighet.
- Påfør sterile oftalmisk salve til begge øyne ved hjelp av en steril bomull pære, siden den blinkende refleks er tapt under narkose og øynene tørker ut. Påfør ved behov.
- Lå musene i liggende stilling på papirhåndklær på toppen av en varmepakning (aktivert ved kontakt med luft) for å opprettholde kroppstemperatur og tape bakbena ned.
- Med en finger, trykk forsiktig til det nedre mageregionen og samle urin fra blæren til en 1,5 ml mikrosentrifuge-rør. Denne prøven fungerer som den basale verdien av urin Ptil.
- Trekk sterile poly-L-lysin (PLL) i en 1 ml sprøyte og fest en 24-gauge IV kateter, med nålen stylet fjernet. Smør tuppen av kateteret og insERT kateter gjennom urinrøret inn i blæren med tang for å lede kateterisering. Stopp når du kjenner motstand. MERK: Forskere bør diskutere med sin veterinær ansatte om behovet for bruk av en smør gel med bedøvelse for intravesikal instillations og bruk av post-prosedyre analgetika.
- Innpode 50 mL av PLL langsomt, med en hastighet på 10 ul hvert 20. s, for å unngå vesico-urinleder tilbakeløp 18. La kateter i urinblæren i 20 minutter med en propp for å forhindre ut-strømningen.
- Etter 20 minutter, fjerne kateteret og fraflytte blæren av noe innhold ved å trykke forsiktig på nedre mageregionen. Ved anvendelse av en tom 1 ml sprøyte, spyle eventuelle gjenværende innholdet ut av kateteret.
- Bland MB49-PSA celler grundig ved pipettering og trekke dem inn i en 1 ml sprøyte. Fest kateteret og smøres med glidemiddel. Innpode 50 ul av 1 x 10 5 celler ved en lav hastighet på 10 ul hvert 20. s. Bytt ut proppen påkateteret. Gi kontroll mus 50 mL av saltvann.
- Etter en time, fjerne kateter og fraflytte blæren av noe innhold. Fjern tapen på bakbena og plassere musene på sine ventral sider. Gjenopplive mus ved subkutant sprøyte reversering medikament (1 mg / kg atipamezole) 0.1 ml per 10 g kroppsvekt.
- Overvåk mus til bevegeligheten er observert. Returner musene til burene.
- Ved fullføring av en tumordeteksjon protokoll (seksjoner 5, 7 eller 8), avlive musene ved hjelp av CO2. Post-mortem svulst deteksjon er beskrevet i kapittel 6.
5. Overvåking tumorvekst med ELISA
MERK: Tumor tilstedeværelse og vekst overvåkes i mus ved å måle PSA sekresjon i urin. Forskere bør rådføre seg med sin veterinær ansatte på oppfølging dyrehelse og trivsel post-tumor implantasjon og humane endepunkter.
- Det finnes to metoder for å samle urin fra mus.
- Samle urin over natten ved å plassere et enkelt mus i et metabolsk bur utformet for å skille urinen fra avføring. Hvis oppsettet ikke har kjøling, legge en proteasehemmer (100 mL) i urinrøret for å hindre nedbrytning av PSA over natten. Imidlertid er antallet tilgjengelige metaboliske bur begrenser nytten av denne fremgangsmåte for urinoppsamling.
- Hvor det er logistisk umulig å bruke metaboliske bur (for eksempel i ABSL2 rom), samle urin sted ved hjelp av en finger for å utøve lett trykk på den nedre mageregionen, mens musene bedøvet som beskrevet i trinn 4.2.1. Dette gjøres vanligvis før behandlingen er innpodet. Fra vår erfaring, kan i det minste 150 ul urin samles 1 time etter anestesi.
- Umiddelbart plassere urinprøve på is. Hematuria kan være synlig fra den andre uken etter tumorimplantering. Meget hemolyserte prøver kan påvirke ELISA analyse. Derfor, urinmå plasseres på is og behandlet raskt etter samlingen.
- Sentrifuger urinprøver ved 6700 xg i 5 min ved 4 ° C for å fjerne celler eller rusk.
- For å normalisere forskjellen i urinmengde mellom mus, alikvoter urinen til nye rør og lagres ved -30 ° C inntil utfører analysene for PSA ved hjelp av et ELISA-kit 7 og kreatinin ved hjelp av et analysesett 7. Selv om mus som ikke produserer PSA, er lave nivåer av ikke-spesifikk binding påvist ved hjelp av ELISA. For prøver som skal betraktes som positiv, må terskelen settes til verdier som er større enn hos normale mus + 3 standardavvik (SD) 15.
6. Oppdager Tumor Presence med Real-time PCR
- Ved oppsigelse, dissekere bukhulen på mus og finn blæren. Eksisere blære og plassere den i en kryoampulle. Fryses umiddelbart i flytende nitrogen.
- Pakk ut RNA ved homogenisering av vev i en RNA extrhandling reagens.
- Utfør revers transkripsjon og real-time PCR-analyse for PSA, som beskrevet ovenfor i avsnitt 2.
7. Overvåking tumorvekst med Fluorescens Imaging
- Merk 1 x 10 7 MB49-PSA celler med en nær-infrarødt fluorescerende fargestoff 19.
- Re-plate og høste de merkede celler på dag 4, 7, 11, 14, 18, og 21 for å undersøke om cellene beholde levedyktighet og fluorescens ved flowcytometri 20.
- Implantere de merkede MB49-PSA celler i mus blærer, som beskrevet ovenfor i punkt 4.
- Overvåke tumorvekst ved anvendelse av en fluorescens bildedannende system annenhver dag.
- På dagen for bildebehandling, veie og bedøve mus ved anvendelse av en blanding av bedøvelses ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg, henholdsvis), injisert intraperitonealt i 0,1 ml per 10 g kroppsvekt.
- Barbere mageområdet for å eksponere huden.
- Plasser mus i bildekammeret og tilegnebilder av blærer ved hjelp av programvaren som følger med imaging system.
- Gjenopplive mus ved subkutant injeksjons en reversering medikament (1 mg / kg atipamezole) 0.1 ml per 10 g kroppsvekt.
8. Overvåking tumorvekst med Høyfrekvente ultralydavbildning
- Implant svulster hos mus, som beskrevet ovenfor i punkt 4.
- Annenhver dag, overvåke tumorvekst ved hjelp av ultralyd imaging.
- På dagen for bildebehandling, veie og bedøve mus ved anvendelse av en blanding av bedøvelses ketamin og medetomidin (75 mg / kg og 1 mg / kg, henholdsvis), injisert intraperitonealt i 0,1 ml per 10 g kroppsvekt.
- Barbere mageområdet for å eksponere huden.
- Innpode 100 ul steril 0,9% saltoppløsning inn i blæren ved hjelp av en 24-gauge IV kateter. Den saltvann vil distend blæren og bedre synlighet under ultralydavbildning.
- Plasser musen på ultralyd plattformen og gjelder ledende gel til lower magen.
- Senk håndholdte proben til huden og skaffe B-mode bilder av blæren på bildeplattformen 21.
- Gjenopplive musene ved subkutan injisering reversering medikament (1 mg / kg atipamezol) ved 0,1 ml per 10 g kroppsvekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PSA-sekresjon fra MB49-celler ble funnet å variere med vekstmediet. MB49-PSA blir dyrket i DMEM-media, fordi dette resulterer i økt PSA sekresjon (figur 1A). For å bestemme følsomheten av PSA ELISA og real-time PCR ble forskjellige mengder MB49-PSA-utsondrende celler blandet med MB49 parentale celler. PSA ELISA oppdager et minimum av 1 x 10 5 PSA-sekresjon celler / 1 x 10 6 celler (Figur 1b), mens real-time PCR-analyse oppdager 100 PSA-sekresjon celler / 1 x 10 6 celler (figur 1C). Således er real-time PCR mer følsom enn ELISA, men det kan bare utføres på hele blæren. Dette begrenser nytteverdien til endepunktet analyse. PLL metoden for tumorimplantasjon resulterer i flere tumorer (figur 2A) som utvikler seg i blæren. Begge over natten samling av urin ved hjelp av metaboliske bur (figur 2B (figur 2B, nedre panel) kan brukes til å måle PSA ved hjelp av ELISA. For alle dyrestudier, er mus vekt bemerket som et mål på helse (figur 2C, øvre panel) og urin PSA overvåkes på en ukentlig basis (figur 2C, nedre panel) som et mål på tumorvekst. Det er vanligvis en god korrelasjon mellom musevekt og tumorstørrelse, målt ved PSA. Mus med store tumorer begynner å gå ned i vekt (figur 2C, mus 3 og 5). Noen mus ble observert i figur 2C kan ha en stor tumor, men likevel viser en normal kroppsvekt. Således er kroppsvekt alene ikke et tilstrekkelig mål på tumorvekst. PSA tjener som en god surrogatmarkør av tumorvekst (figur 3A-D). Musene ble avlivet ca 3-5 dager etter urinanalyser for PSA på dag 14. Bildene av blæren tverrsnitt viser tumorstørrelse og den tilsvarende dagen 14 PSA / kreatinin x 10 6 reading. Variasjonen i tumorstørrelse er relatert til behandlingen mottok musene. Figur 3, paneler AD representerer mus fra 3 forskjellige behandlingsarmer. En alternativ strategi for å PSA modifikasjon av celler er merking av celler med et fargestoff. Denne strategien eliminerer behovet for celletransformasjon og seleksjon. Merking av MB49-PSA-celler med et fluorescerende fargestoff er lett å utføre (figur 4A), og in vitro-overvåkning viste lovende når det gjelder overlevelse av signalet, til tross for cellereplikasjonen (figur 4B og C). Imidlertid in vivo avbildning var ikke vellykket, fordi mus føde hadde også naturlig rød fluorescens (figur 4D), som resulterte i ikke-spesifikk fluorescens i mageregionen. En sammenligning ble utført mellom ultralydavbildning, PSA urinutskillelse, og PSA end-point analyse. Ultralydavbildning av blæren (figur 5A-H) var god for å identifiserestore svulster, men det var ikke så vellykket med små svulster.
Figur 1. PSA Sekresjon fra MB49-PSA Cells og bestemmelse av deteksjonsgrenser med Elisa og Real-time PCR-analyse. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA-celler ble dyrket i forskjellige vekstmedier, og PSA sekresjon i supernatanten ble påvist 2 dager senere ved hjelp av ELISA. Dyrkningsmediet var: RPMI med FBS- (RPMI), RPMI med Premium FBS (RPMI (P)), RPMI med en alternativ FBS (RPMI (H)), og DMEM med FBS (DMEM). MB49-PSA celler dyrket i DMEM media hadde høyere PSA sekresjon. (B) MB49-PSA-celler (10 seks celler til en celle) ble blandet med paren MB49 celler (en celle til 10 6 celler) og sådd ut i 24 timer. PSA-ELISA ble utført på supernatanten, og RNA ble ekstrahert fra cellene. Et minimum på 1 x 10 5 6 celler kunne påvises ved hjelp av ELISA. (C) 100 PSA-sekreterende celler / 1 x 10 6 celler kunne påvises ved sanntids-PCR-analyse. Y-aksen verdiene representerer den midlere RQ (relativ mengde) ± standardavvik. RQ verdiene er relative fold endringer, oppnådd ved å normal C T verdier av PSA til beta aktin genet og sammenlignet med en kontrollgruppe blære som er satt til 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Blære tumorvekst og Detection. (A) Histologisk undersøkelse av en blære 13 dager etter tumor-implantering. Den parafin-embedded blære ble seksjonert og farget med hematoksylin (mørk blå), som stains kjernene, og eosin (rosa), som farger de gjenværende cellulære komponenter. Ptil / kreatinin x 10 6-verdien for denne blæren på dag 5 og 13 er vist som 7/2688. Forstørrelsen er på 44.8X. Målestokk representerer 1 mm. (B) Urin ble oppsamlet ved enten å plassere mus i metaboliske bur over natten og overføring av urin fra oppsamlingsrøret inn i 2 ml rør (øvre panel) eller ved på-stedet urinoppsamling fra bedøvede mus (nedre panel) i 1,5 ml rør , som så ble overført til 0,6 ml rør. (C) Etter tumorimplanteringen, ble musene overvåket vekt to ganger ukentlig (øvre panel). Urin PSA ble målt til å overvåke svulsten implantering og vekst hos mus (nedre panel). Y-aksen PSA / knirk representerer urin PSA normalisert til kreatinin x 10 6. Musene ble avsluttet en gang var det et underskudd på mer enn 20% av kroppsvekt. Merk: PSA genekspresjon ble detektert i blæren i mus 2 på dag 40, da det var Termi nert, selv om den hadde lav urin PSA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. PSA og blære tumorvekst. (AD) Histologiske snitt av muse blærer høstet på dag 19 (A og B), dag 17 (C) og dag 13 (D) etter tumorimplantering. Dagen 4 og dag 13 eller dag 14 urin PSA / kreatinin x 10 6 verdiene for hver blære er vist på høyre side av hvert bilde i formatet dag 4 / dag 13 eller 14. urin PSA / kreatinin verdier øker med tumorstørrelse . Musene i bilder AD mottatt ulike behandlinger regnskap for svulst størrelsesforskjeller. Forstørrelsen er på 41.4X. Målestokk representerer 1 mm."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Profilen til MB49-PSA celler merket med et fluorescerende fargestoff. (A) fargede celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri før utplating. Merkede celler ble høstet med få dagers mellomrom for å analysere intensiteten av fluorescerende fargestoff. (B) Prosent av merket MB49-PSA celler i P2 gate fra (A) på bestemte dager post-merking. (C) Intensitet av det fluorescerende fargestoff målt ved midlere fluorescensintensitet (MFI) av signalet. (D) bilder fra mus 10 dager etter implantasjon med merkede MB49-PSA-celler ved bruk av en in vivo bildedannende system viste ikke-spesifikk fluorescens i mageregionen.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Ultralyd Bilder av Murine blæren. Mus blærer (a) før tumorimplantering og (B) 8 dager etter tumor-implantering. (C) til (H) er ultralydbilder av mus blærene to uker etter implantasjon. PSA / knirk: urin PSA normalisert til kreatinin (10 6). PSA-genet: genuttrykk av PSA i blærer (logg RQ) er vist for hver blære. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| urin~~POS=TRUNC PSA | fluorescens Imaging | ultralyd Imaging | |
| Steps (kreves) | Anesthetize mus. Samle 110 mL urin. (~ 1 h) Utfør PSA ELISA (total inkubasjonstid: 2 t 30 min) Kreatinin analysen (inkubasjonstid: 5 min) | Anesthetize mus. Barbere pels på mageregionen. Utfør bildebehandling. | Anesthetize mus. Barbere pels på mageregionen. Kateterisere og innpode 100 ul av saltvann inn i blæren. Påfør ledende gel til nedre del av magen og få ultralydbilder. |
| spesialisert utstyr | ELISA plateleser (på bølgelengde på 450 nm og 510 nm) | Imaging System | Ultralyd Imaging System |
| Modifikasjon av tumorceller | Kraved (uttrykker PSA) | Nødvendig (fluorescens) | Ikke obligatorisk |
| Fordeler | Pålitelig | Enkel og rask | Kan oppdage store svulster |
| begrensninger | Kan ikke få nok urin En negativ verdi betyr ikke fravær av tumor (PSA genekspresjonsanalyser øker følsomheten, men er begrenset til slutt-punkt-analyse) | Nøye utvelgelse av fluorescens-fargestoff er nødvendig for å hindre høy bakgrunn. | Kan ikke oppdage små svulster. En mus på en gang. |
Tabell 1. Sammenligning av metoder for overvåking tumorvekst i mus blæren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiske trinnene i protokollen er 1) med hell å opprettholde tumorigenisitet av cellelinjen; 2) sikre målbare PSA sekresjon før tumorcelle implantasjon i mus; 3) å generere en enkeltcellesuspensjon for implantasjon, slik som å redusere variasjon i tumorstørrelse; og 4) instilling celler ved en langsom hastighet for å forhindre vesico-urinleder tilbakeløp, noe som resulterer i tumorcelle implantasjon i nyrene.
Etter lengre tids passasje in vitro, kan MB49 / MB49-PSA cellene mister sin tumorgenisitet, som vist ved deres manglende evne til å produsere tumorer i mus. Dette kan være en problemfaktor med hensyn til hvorvidt mus er kurert etter behandling. I fravær av tumorer, er det ikke mulig å skille mus kurert ved terapi fra mus kurert spontant på grunn av immunogene tumorer eller fra mus med tumorer uten i det hele tatt fordi cellelinjen er i stand til å danne svulster. En måte å motvirke dette på er å re-passasje cellene i mus ved fremstilling av sub-kutan svulster. Hvis denne re-aging utføres for ofte, er altfor aggressive svulster generert. En fin balanse er nødvendig for å fastslå når cellene trenger for å bli re-passeres. Vanligvis, før en stor serie eksperimenter, blir cellelinje gjenopplivet og deretter implantert i mus subkutant for å bekrefte deres evne til å danne svulster. Svulstene blir overvåket i flere uker for å sikre at det ikke er noen spontan botemidler. Men hvis spontane botemidler er observert, så protokollen i trinn 3 skal utføres. På tilsvarende måte, evnen til MB49-PSA-celler til å produsere PSA alltid skal bekreftes før cellene blir anvendt for tumorimplantering.
Urin PSA kan brukes for å overvåke veksten av blæretumorer etablert ved hjelp av MB49-PSA-celler. Men en negativ eller "normal" urin PSA-verdi ikke nødvendigvis å bety et fravær av tumorceller, men bare at mindre enn 1 x 10 5 celler er til stede. Som urin PSA bestemmes rundt dag 4til dag 7, mus som synes å ha noen tumor, basert på verdien av normale mus + 3 SD, kan fjernes fra eksperimentet. Noen av disse mus kan utvikle en svulst på et senere tidspunkt. Fjerne mus uten svulster sikrer at svulster er svært like i størrelse før du begynner å terapi. Dette reduserer variasjon på grunn av tumorstørrelse på respons på behandling. En viktig årsak til tumor størrelse variasjon er klumper av celler før implantasjon, så det bør arbeides for å re-suspendere celler før implantasjon.
Når imidlertid et lite antall mus blir brukt, kan det være nødvendig å holde alle mus i studien, selv om svulster er ikke målbar etter dager 4 - 7. Ved å overvåke PSA på dag 11, kan det fremdeles være mulig å kategorisere disse mus som har hatt små svulster, og kan utføres end-point-analyse med hensyn til den opprinnelige tumorstørrelse (basert på tilstedeværelsen av urin målbar PSA på dager 4 - 7 i forhold til dag 11). Fordelen ved å være i stand til å kvantifisere tumorermed forskjellige PSA-verdier er at alle mus kan bli inkludert i studien, og responsen på behandlingen kan bestemmes på grunnlag av sine PSA / kreatinin-verdier i forhold til den opprinnelige svulsten størrelse. En annen bekymring er vesico-urinleder reflux. Dette kan føre til tumorutvikling i nyrene. Redusere volumet som skal innpodet fra 100 mL til 50 mL og utfører drypping sakte reduserer sannsynligheten for at dette skjer.
Ett problem forbundet med urinbaserte assays er den reduserte urinoppsamling observert som ortotopiske svulster vokse i blæren. Mens urin kan lett samles fra mus i løpet av de første ukene etter implantasjon, med tiden, volumet av urin samlet kan ikke være tilstrekkelig for PSA og kreatinin målinger. Den minimale volum av urin som trengs er 110 ul, men mer er bedre. Således kan PSA-målinger ikke er tilgjengelige for alle mus ved senere tidspunkter. Også lyse av røde blodceller i urinen gir falskthøye målingen på PSA ELISA. En ikke-urin-baserte analysen kunne overvinne dette problemet. Dessverre skjønt fluorescens bildebehandling er enkel å bruke, har vi funnet at musen føde hadde rød fluorescens også. Dette ga en høy bakgrunnen for at blæren ikke kan være lett synlig. Det er mulig at bruk av en grønn fluorescerende fargestoff eller proteinet kan overkomme dette problemet, som beskrevet av Sweeney et al. 10 For både fluorescens og ultralyd, mus må være barbert på ventral overflaten.
Ultralydbilder ser ut til å være like god som PSA genuttrykk i å finne svulster. Men ulempen ved ultralydavbildning er at blæren må være strukket ut i løpet av avbildning for å få god tumor visualisering. Mens bildene er tydelig når blæren tumor er stor, er det vanskelig å skille små svulster i mus fra fravær av tumorer. Det har blitt rapportert at ultralyd kan påvise svulster i området rundt 1,5 mm i diameter 22, men på dag 4etter implantering, tumorer er mye mindre enn dette. Dermed kan denne metoden ikke være bra for påvisning av svulster på dag 4. Tabell 1 sammenligner 3 forskjellige tumor overvåkingssystemer; Ptil ELISA er den enkleste å bruke og krever ikke små dyr imaging-systemer, som kanskje ikke er tilgjengelig på alle dyrefasiliteter.
Gis en større følsomhet av real-time PCR-analyse av PSA-genekspresjon, kan den brukes i stedet for immunhistokjemi for å bekrefte hvorvidt mus ble herdet da forsøket ble avsluttet. Med immunhistokjemi, en svulst på 0,2 - 0,3 mm registreres av dag 4 etter implantasjon 15. Dette er imidlertid en ende-punkt analysemetode som ikke kan brukes til å overvåke tumorimplantering. I denne studien ble MR ikke undersøkt, men det har blitt rapportert å være i stand til å identifisere tilstedeværelsen av tumorer ved dag 10 etter implantasjon 8. Ved å endre celler til å uttrykke grønne fluorescerende protein (GFP), det jeger mulig å bekrefte tumorimplantering ved dag 7. En kombinasjon av tidlig urin PSA for å påvise tumor-implantasjon og real-time PCR-analyse ved avslutning gir bekreftelse på tumorimplantering og terapeutisk effekt mellom forskjellige behandlingsgrupper.
En ulempe ved vår protokoll er først og fremst at den ELISA-analysen ikke kan bekrefte tilstedeværelse av svulster når antall celler som er tilstede er mindre enn 10 5 celler. Dermed mer sensitive analyser må utvikles samt raskere analyser for å redusere den tiden som trengs for PSA deteksjon. ELISA tar flere timer å gjennomføre. En rask metode slik som den kreatinin assay som er basert på den metode Jaffe 23 og tar omtrent 5 min for å utføre i stor grad vil forenkle kontroll av tumorvekst. For dette formål ble en enzymbasert metode for å detektere PSA-aktivitet evaluert, men det var ikke vellykket. Anvendelse av kolloidalt gull og nanopartikkelbasert analysesystemer kan redusere tiden det tar å utføre analysen ennd øke følsomheten 24. I denne forbindelse har elektrode baserte sensorer og elektrokjemisk baserte sensorer ved hjelp av nanopartikler blitt utviklet for å analysere humant PSA 25-27 og dersom kostnadene er rimelig kan anvendes på dyremodellen. Analysesystemet kan også forbedres ved hjelp av en annen proteinutskillelse system slik som GFP eller luciferase hvor Analysen utføres under optimale betingelser in vitro i stedet avhengig av in vivo avbildning som er avhengig av vevsoksygenering.
Mens kjemisk karsinogenese i mus frembringer tumorer med likhet med humane kreftformer i form av mutasjoner 28, de tar lengre tid å produsere og er ikke så sammenlignbare i størrelse mellom dyr, som krever større antall mus som øker kostnadene ved eksperimentering. Ved målretting midler erkjenner menneskelige proteiner som skal evalueres, menneske xenografter implantert subkutant i naken eller Alvorlig kombinert immunsvikt(SCID) mus er det eneste alternativet. Selv om disse modellene gir bevis på konseptet av antistoff anerkjennelse, mangel på et intakt immunsystem hindrer vurdering av aktivering av immunsystemet. Den siste utviklingen av en humanisert musemodell for blærekreft ved bruk av menneskelige xenografter 29, gjør gi noen immun innsikt, men som celler blir implantert subkutant det faktisk ikke rekapitulere den menneskelige sykdommen miljø. Det er teknisk vanskelig å fremstille ortotopiske tumorer i immunmangelfull mus. Dermed er den syngene orthotopic modellen til tross for sine begrensninger fortsatt en god modell for vurdering og utvikling av behandling for blærekreft som det gir den riktige vev plassering muliggjør kontrollert eksponering for terapi modellering den kliniske situasjonen og muligheten til å evaluere virkningen av vertsimmunceller under kreftbehandling. Alt dette, kombinert med rask tumorutvikling hos mus, og muligheten til å overvåke tumorvekst resulterer i en kostnadseffektiv modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
- Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
- Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).
- Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
- Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).
- Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
- Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
- Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).
- Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
- Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
- Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
- Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
- Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
- Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
- Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
- Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).
- Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075 (2007).
- Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
- Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718 (2015).
- Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
- Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
- Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
- Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
- Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
- Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
- Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
- Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).
