Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.
Bu protokol, insan prostat spesifik antijen (PSA) salgılar üzere tadil edilmiş olan murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 kullanılarak dişi C57BL / 6J farelerde mesane tümörlerine üretimini tarif eder, ve tümör implantasyonundan teyidi için prosedür. Kısaca, fareler enjektabl ilaçlar kullanılarak anestezi uygulanır ve dorsal pozisyonda yatıyordu yapılır. İdrar mesaneden boşalan ve poli-L-lisin (PLL), 50 uL yavaş yavaş 24 g, IV, kateter kullanılarak 10 mL / 20 s bir hızda damlatılır. Bu kateter tapayla kapatılması ile 20 dakika için idrar torbasında bırakılır. Sonda çıkarılır ve PLL mesane hafif basınç boşalan edilir. Bu murin mesane kanseri hücre çizgisi 10 uL / 20 s bir hızda (1 x 10 5 hücre / 50 uL) bir damlatma izlemektedir. Kateter erken tahliye önlemek için kapatılmakta. 1 saat sonra, fareler bir ters ilaç ile yeniden canlandırılması ve mesane boşalması. Yavaş instilasyon oranı, önemli olanbu tümörler, üst idrar yollarında ve böbreklerde oluşmasına neden olabilir veziko-üreteral reflü, azaltır. hücre hattı da bu implantasyondan sonra düzensiz tümör boyutları yol gibi, hücre topaklanma azaltmak için yeniden askıya alınmalıdır.
Bu teknik, yüksek verimlilik ile tümörleri neden olmaktadır. Tümör büyümesi, üriner PSA salgılama ile izlenir. PSA markör izleme mesane tümör varlığının tespiti için ultrason veya floresan görüntüleme daha güvenilirdir. tedavi edilmediği takdirde 4 hafta – farelerde tümörler genellikle yaklaşık 3 ile maksimum boyutu olumsuz etkiler sağlık ulaşır. tümör büyümesini izleyerek, başarılı tümörlerinin implante değil olanlardan tedavi fareler ayırt etmek mümkündür. Sadece uç nokta analizi ile, ikincisi yanlışlıkla terapi ile tedavi edilmiş kabul edilebilir.
Bu yöntemin amacı, fare ortotopik mesane tümörleri üretmek ve tümör implantasyonu olmadan fareler uç noktası analizinde tedavi sanılan değildir bu yüzden, mümkün olduğu kadar doğru implante tümörleri izlemektir. Genel olarak, yöntem deneysel analiz için farelerin çok sayıda ihtiyacını azaltmak ve tedavi sonuçlarını belirlemede büyük doğruluğunu sağlayacaktır gösterilen.
implante tümör hücreleri deri altına klinik hastalığın çevreyi özetlemek veya tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlamak değil gibi kanser için ortotopik bir model geliştirilmesi önemlidir. Mesanenin mimarisi doğrudan minimal sistemik etkileri ile mesane içine mesane kanseri tedavilerinin damlatma izin verir. Bu durumda, bu ortotopik bir model olarak, bu ortam özetlemek hayvan modelleri, yeni tedavilerin değerlendirilmesi için önemlidir. herhangi bir deneysel set-up çıkarılan sonuçlar bağımlı hazırlık vardırModelin sınırlamalar üzerine t.
Çeşitli teknikler farelerde ortotopik mesane tümörlerinin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar, mesanenin glikozaminoglikan tabakası zarar implante edilecek tümör hücrelerinin sağlayan güveniyor. Kullanılan teknikler mesane 1,2 tek bir sitede tümör gelişimine yol açan, mesane duvarı hasar tek bir noktada sonuçlanır elektrokotere içerir. Bununla birlikte, elektrokoter kullanılarak tümör implantasyonu başarı oranı operatöre bağlıdır 10 arasında değişen bir -% 90, ve periton boşluğu içinde gelişen tümörlerin neden mesane duvarı delinmiş olan tehlikesini içerir. Kimyasal koter gümüş nitrat, zarar mesane duvarı 3 kullanılarak gerçekleştirilir. Benzer şekilde, asit, mesane duvarı 4 zarar kullanılmıştır. Tripsin da iyi 5 ile mesane zarar kullanılmıştır. Bu yöntemler, mesane birden fazla tümör oluşmasına da neden olabilir.kimyasallar çok uzun süre mesane duvarı ile temas halinde bırakılırsa Ayrıca, mesane ciddi hasar tehlikesi vardır. Ninalga ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem. pozitif yüklü poli-L-lisin (PLL), kat mesane duvarı 6 molekülleri kullanır; Bu mesane glikozaminoglikan tabakası sadık negatif yüklü tümör hücreleri sağlar. Bu yöntem, genel olarak mesanede geliştirme birden fazla tümör ile sonuçlanır, ancak tümör implantasyonu 80 olan -% 100 4,7. Teknik olarak, bunu gerçekleştirmek için en kolay prosedür aynı zamanda. geliştirilmesi tümörler da boyutu oldukça emin olmak için, tümör hücreleri implantasyondan önce, büyük yığınlar halinde gruplanmaz önemlidir.
terapötik etkinliğini değerlendirmek amacıyla, oldukça benzer boyutlu tümörleri olan fareler bu çalışma yapmak için uygundur. Böylece, implantasyon hemen sonra tümör boyutu ölçmek için iyi bir algılama sistemi çok önemlidir. Çeşitli stratejiler arıN tümörleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRI), 8-10, floresan 11 biyoluminesans 12,13, ultrason 14 ve enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 15,16 bulunmaktadır. MR ve ultrason tümör hücrelerinin değişiklik gerektirmeyen birlikte, MRI hassas ekipman ve kontrast maddeleri için bir ihtiyaç vardır. lüminesans, Floresan-, ELISA bazlı deneyler, bu yöntemler ile saptanabilir işaretleyici proteinleri ifade etmek için, tümör hücrelerinin değişiklik gerektirir. lüminesans, bir alt-tabaka lusiferaz aktivitesinin saptanması için gereklidir; Bu şekilde, ilave bir aşama ve artan maliyeti vardır. Hem parlaklık ve floresan özel ekipman gerektirir. floresan üretmek için moleküler oksijen ile katalize edilir, yeşil flüoresan proteini (GFP) siklizasyon, gereklidir. Böylece, GFP ifade bu oldukça güvenilmez işaretleyici yaparak, oksijen erişimi bağlı bir tümör kitlesi içinde değişken olabilir <sup> 17. Bir belirteç Başka bir strateji olarak murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 modifikasyonu insan prostat spesifik antijen (PSA) 15,16 salgılamaya. Bu belirteçler, deneyin sonunda tümör varlığını teyit olanağına immünohistokimyasal alternatif yapma için alternatif yollar sağlar. Bu çalışma, ortotopik tümör implantasyonundan PLL metodu bildirir ve tümör algılama sistemleri, yani ELISA, floresan ve ultrason görüntüleme bir karşılaştırmasını göstermektedir.
Protokolde en kritik adımlar 1) başarıyla hücre hattı tümörigenikliğini bakımını yapmak; 2) farelerde, tümör hücresi implantasyonundan önce ölçülebilir PSA salgısını sağlanması; Tümör büyüklüğünün değişik azaltacak şekilde 3), implantasyon için tek bir hücre süspansiyonu üretilmesi; ve 4) böbrekte tümör hücre implantasyonu ile sonuçlanır veziko-üreteral reflü önlemek için yavaş bir hızda hücrelere aşılamak.
In vitro olarak uzun s?…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
L-glutamine | Biowest | X0550 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipment and Software | |||
7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |