Summary
Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.
Abstract
Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica in topi C57BL / 6J femmina utilizzando la linea cellulare di cancro alla vescica murino MB49, che è stato modificato a secernere prostatico umano specifico (PSA), e la procedura per la conferma di impianto del tumore. In breve, i topi vengono anestetizzati con farmaci iniettabili e sono fatti per porre in posizione di dorsale. L'urina è liberata dalla vescica e 50 ml di poli-L-lisina (PLL) viene lentamente instillato ad una velocità di 10 microlitri / 20 s utilizzando un catetere 24 G IV. Si lascia in vescica per 20 min in tappatura catetere. Il catetere viene rimosso e PLL è lasciata libera entro una leggera pressione sulla vescica. Questa è seguita da instillazione della linea cellulare di cancro alla vescica murino (1 x 10 5 cellule / 50 mL) ad una velocità di 10 ml / 20 s. Il catetere viene tappo per evitare evacuazione prematura. Dopo 1 h, i topi sono fatti rivivere con un farmaco inversione, e la vescica è liberate. Il tasso di instillazione lento è importante,poiché riduce il reflusso vescico-ureterale, che può causare tumori a verificarsi nel tratto urinario superiore e nei reni. La linea cellulare dovrebbe essere ben risospeso per ridurre aggregazione di cellule, come questo può portare a dimensioni tumorali irregolari dopo l'impianto.
Questa tecnica induce tumori con elevata efficienza. La crescita del tumore è monitorato da urinario secrezione di PSA. monitoraggio marcatore PSA è più affidabile di ultrasuoni o la fluorescenza per la rilevazione della presenza di tumori nella vescica. I tumori nei topi generalmente raggiungono una dimensione massima che influisce negativamente la salute di circa 3 - 4 settimane, se non trattata. Monitorando la crescita tumorale, è possibile differenziare topi che sono stati curati da quelli che non sono stati impiantati con successo con tumori. Con solo l'analisi end-point, quest'ultimo può essere erroneamente assume che sono stati curati con la terapia.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di generare tumori della vescica murino ortotopiche e di monitorare i tumori impiantati con la massima precisione possibile, in modo che i topi senza l'impianto del tumore non è pensato per essere trattato ad analisi end-point. In generale, il metodo mostrato ridurrà la necessità di un gran numero di topi per analisi sperimentale e garantire una maggiore precisione nel determinare risultati terapeutici.
Lo sviluppo di un modello ortotopico per il cancro è importante, in quanto le cellule tumorali impiantare sottocute non ricapitolano l'ambiente della malattia clinica o consentire lo sviluppo di strategie terapeutiche. L'architettura della vescica permette l'instillazione di terapie del cancro della vescica direttamente nella vescica con effetti sistemici minimi. Così, i modelli animali che ricapitolano questo ambiente, come un modello ortotopico, sono importanti per valutare nuove terapie. Le conclusioni tratte da qualsiasi set-up sperimentale sono dependent sulle limitazioni del modello.
Numerose tecniche sono state sviluppate per la produzione di tumori della vescica ortotopico nei topi. Questi si affidano danneggiare lo strato glicosaminoglicano della vescica, consentendo cellule tumorali da impiantare. Le tecniche utilizzate comprendono elettrocauterizzazione, che si traduce in un unico punto di danno nella parete della vescica, con conseguente sviluppo del tumore in un sito nella vescica 1,2. Tuttavia, il tasso di successo di impianto tumore, utilizzando elettrocauterizzazione è operatore-dipendente variabili da 10 - 90%, e comprende il pericolo che la parete della vescica viene perforato, portando a sviluppare tumori nella cavità peritoneale. Cauterizzazione chimica viene eseguita utilizzando nitrato d'argento, che danneggia la parete della vescica 3. Analogamente, l'acido è stato usato per danneggiare la parete della vescica 4. Tripsina è stato utilizzato anche per danneggiare la vescica e 5. Questi metodi possono provocare lo sviluppo di più di un tumore nella vescica.Inoltre, vi è il rischio di gravi danni alla vescica se le sostanze chimiche vengono lasciati a contatto con la parete della vescica per troppo tempo. Il metodo sviluppato da Ninalga et al. utilizza il poli-L-lisina carica positiva (PLL) 6 molecole per rivestire la parete della vescica; Questo permette alle cellule tumorali carica negativa ad attaccarsi al livello glicosaminoglicano della vescica. Questo metodo comporta generalmente più di un tumore sviluppare nella vescica, ma tumorale impianto è a 80 - 100% 4,7. Tecnicamente, è anche la procedura più semplice da eseguire. Per garantire che i tumori che si sviluppano sono abbastanza anche in dimensioni, è importante che le cellule tumorali non vengono raggruppati in grandi ciuffi prima dell'impianto.
Per valutare l'efficacia terapeutica, è meglio effettuare questo studio su topi con tumori abbastanza di dimensioni simili. Così, un buon sistema di rilevamento che possono quantificare le dimensioni del tumore subito dopo l'impianto è importante. Diverse strategie sono apen usato per valutare i tumori. Questi includono la risonanza magnetica (MRI) 8-10, fluorescenza 11, bioluminescenza 12,13, ultrasuoni 14, e il dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) 15,16. Mentre MRI e ultrasuoni non richiedono modifiche delle cellule tumorali, vi è la necessità di attrezzature e contrasto sensibili agenti per MRI. I saggi fluorescence-, luminescence-, e basati su ELISA richiedono modifiche delle cellule tumorali per esprimere proteine marker che possono essere rilevati da questi metodi. Per luminescenza, un substrato è necessaria per la rilevazione dell'attività di luciferasi; vi è quindi un passo aggiunto e aumento dei costi. Sia luminescenza e fluorescenza richiedono attrezzature specializzate. Per produrre fluorescenza, proteina fluorescente verde (GFP) ciclizzazione, che viene catalizzata da ossigeno molecolare, è necessaria. Così, l'espressione della GFP può essere variabile all'interno di una massa tumorale seconda accesso ad ossigeno, rendendo questo un indicatore piuttosto affidabile
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Protocol
Tutti i lavori animale aderito alle linee guida istituzionali cura e l'uso Comitato Animal (IACUC) in uso animale di spedizione (numero di protocollo 084/12) presso l'Università Nazionale di Singapore.
1. crescita delle cellule MB49-PSA in vitro e misurazione del PSA secrezione
- Mantenere murino di cancro della vescica cellule MB49-PSA 15 in totale Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS), 2 mmol / L di L-glutammina, e 0,05 mg / ml penicillina-streptomicina in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. Aggiungere 200 ug / mL Hygromycin B per mantenere la pressione selettiva di cellule PSA-secernenti.
- Per determinare la secrezione di PSA, piastra 1 x 10 6 cellule in una piastra di coltura da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C in presenza del 5% di CO 2 per 48 ore.
- Due giorni dopo, raccogliere il supernatante per la misurazione PSA.
- Usando una pipetta Pasteur, trasferire il supernatant ad una provetta 15 centrifuga.
- Centrifugare per 5 minuti a 250 xg per rimuovere le cellule galleggianti e detriti. Se il test PSA viene effettuata su un giorno differente, memorizzare il supernatante a - 30 ° C in una provetta da microcentrifuga da 1,5. In caso contrario, passare alla fase successiva immediatamente.
- Determinare la concentrazione di PSA con un PSA libero-umano ELISA Kit 7.
- Enumerare le cellule placcato.
- Usando una pipetta Pasteur, lavare le cellule delicatamente con 1 ml di DMEM. Aspirare e completamente rimuovere il supporto.
- Aggiungere 1 ml di mezzi freschi e raschiare delicatamente con un raschietto cellulare per rimuovere le cellule dal pozzo.
- Trasferire le cellule in una provetta e risospendere accuratamente per garantire una cella singola sospensione.
- Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare e una soluzione trypan blu 0,4%. Contare le cellule vive (che non occupano il colorante) utilizzando un emocitometro.
- Calcolare l'espressione del PSA come ngdi PSA / ml di mezzi / 10 6 cellule. L'espressione PSA di cellule MB49-PSA per l'impianto in topi è di 80 - 120 ng / mL / 10 6 cellule.
2. Determinazione della sensibilità del PSA Misure da ELISA e analisi in tempo reale PCR
- Piastra cellule MB49-PSA nei media DMEM completo in una piastra di coltura 6-bene con diverse quantità di cellule MB49 parentali tale che c'è un massimo di 1 x 10 6 cellule per bene (ad esempio, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, o 10 6 cellule MB49-PSA sono coltivate con 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 o 0 MB49 cellule, rispettivamente).
- Il giorno dopo, raccogliere il surnatante per la misurazione del PSA, come descritto al punto 1.3. Determinare la concentrazione di PSA con un PSA libero-umano ELISA Kit 7.
- Estrarre il RNA dalle cellule.
- Lyse ille cellule direttamente nel piatto con l'aggiunta di 1 ml di reagente di estrazione di RNA.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire il lisato cellulare in una provetta. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e vortice campioni energicamente per 15 s. incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore (0,5 mL) in una nuova provetta senza disturbare l'interfase.
- Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante completamente, senza disturbare il precipitato RNA sul fondo della provetta.
- Lavare il pellet una volta con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere tutti etanolo e consentire il pellet asciugare all'aria per 10 min.
- Sciogliere l'RNA in 30 ml di acqua priva di nucleasi. Incubare per 5 minuti a 60 ° C per aumentare la cosìlubility.
- Quantificare l'RNA misurando l'assorbanza mediante spettroscopia ultravioletta (UV) a 260 nm (A260). Per valutare l'RNA purezza, misurare l'assorbanza a 280 nm (A280) e calcolare il rapporto A260 / A280, che dovrebbe essere al di sopra 1.6.
- Reverse-trascrivere cDNA da 2 mg di RNA.
- Preparare la miscela di reazione in ghiaccio e trasferirlo a 0,2 mL.
- centrifugare brevemente le provette a girare verso il basso i contenuti e per eliminare le bolle d'aria.
- Caricare le provette nel termociclatore ed eseguire la trascrizione inversa alle seguenti condizioni: 60 min a 37 ° C seguita da 5 min a 95 ° C. Una volta che la corsa è stata completata, conservare i campioni di cDNA a 4 ° C.
- Conservare i campioni a - 30 ° C per una conservazione a lungo termine.
- Eseguire un real-time PCR per PSA e citoplasmatica beta actina. actina Beta viene utilizzato per normalizzare i campioni. Eseguire il test su 100 ng di RNA reverse-trascritte in un 96 pozzetti plaTE. Analizzare tutti i campioni in triplice copia. Eseguire 40 cicli con i seguenti parametri: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 15 s a 95 ° C per la denaturazione, e 1 min a 60 ° C. Impostare il limite più basso di rilevazione in un ciclo soglia (CT) 35; quindi, ogni campione con un valore CT oltre 35 è considerata non rilevabile.
3. mantenere la tumorigenicità della MB49-PSA Cell Line
NOTA: prolungata crescita in vitro porta ad una perdita di tumorigenicità. Per mantenere tumorigenicità, la linea cellulare MB49-PSA è diversi passaggi attraverso il mouse, almeno una volta ogni 2 anni.
- Cells.
- Raccolto in crescita esponenziale cellule raschiando delicatamente con un raschietto cellulare sterile. Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare e una soluzione trypan blu 0,4%. Contare le cellule vive usando un emocitometro. Non impiantare se più del 20% delle cellule sono morti.
- Calcolare la quantità di cellule vive richiesto (1 x 107 cellule / ml) e trasferirli in una provetta 15 centrifuga. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in DMEM supporti vuoti. Ripetere il lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce di FBS prima dell'impianto.
- Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino topi sono pronti per l'impianto.
- Impiantare le cellule tumorali per via sottocutanea in topi sul fianco dorsale.
- Anestetizzare un 4 a 6 settimane di età topo C57BL6 / J utilizzando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Shave il fianco destro per esporre la pelle.
- Utilizzando un paio di pinze, sollevare la pelle per separarlo dal muscolo sottostante e iniettare 0,1 ml di sospensione cellulare (1 x 10 6 cellule) per via sottocutanea con un ago 24 G. Durante la rimozione dell'ago, pizzicare il sito di iniezione da 5 a 10 s in modo che le cellule tumorali fannonon fuoriuscire dal sito di iniezione.
- Revive il mouse con un'iniezione sottocutanea di atipamezolo (1 mg / kg) a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Monitorare la crescita del tumore ogni due giorni, misurando il diametro del tumore usando pinze. Il volume del tumore è calcolato utilizzando la formula v = (ab 2) / 2, dove "a" è la dimensione più lunga e "b" è la larghezza perpendicolare, sia in mm.
- Quando il volume del tumore è di almeno 50 mm 3 (circa 7 giorni), eutanasia il mouse con CO 2. Asportare la massa tumorale con un paio di pinze sterili e forbici in condizioni asettiche e il luogo in DMEM.
- In una piastra di coltura 6-bene, tritare il tumore in piccoli pezzi con bisturi sterili. Utilizzare una siringa da 1 ml stantuffo come un "pestello" disaggregare ulteriormente il tumore.
- Aggiungere 3 ml di DMEM completo e mantenere le cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Una volta che le cellule aderiscono alla piattaformae (tra uno e due giorni), rimuovere il supporto, detriti, e le cellule non-aderenti aspirando delicatamente con una pipetta Pasteur sterile. Lavare due volte con DMEM. Fare attenzione a non disturbare le cellule.
- Aggiungere 1 ml di DMEM e raccogliere le cellule da essi raschiando con un raschietto cellulare. Per selezionare ed espandere singole colonie, Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la piastra 1 cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 96 pozzetti. Cellule di coltura in DMEM con 200 mg / ml Hygromycin B a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Modificare i media ed un antibiotico ogni 4 - 5 giorni. Monitorare le cellule fino a quando sono a circa il 80-90% confluenti. Re-plate cellule su una piastra di coltura a 24 pozzetti pipettando per staccare le cellule dal pozzo.
- Una volta che le cellule nella piastra di coltura a 24 pozzetti sono confluenti, li rimuovere raschiando con un raschietto cellulare e piastra in una piastra di coltura da 6 pozzetti.
- Schermo i diversi cloni per la secrezione del PSA, come descritto al punto 1. Cryo-conservare il clone con il massimo segreto PSAione e usarlo per esperimenti futuri del mouse.
4. Impianto del tumore
NOTA: Ogni mouse è impiantato con 1 x 10 5 cellule MB49-PSA in 50 ml di DMEM supporti vergini nella vescica. A causa dello spazio morto nel catetere, sempre preparare volume extra (almeno 100 microlitri supplementari per topo). Un approccio alternativo sarebbe quello di utilizzare una siringa riempita di aria come descritto da Kasman et al. 5 piuttosto che una siringa riempita.
- Cells.
- Un giorno prima dell'impianto, quando le cellule sono circa 80% confluenti, passaggio le cellule tumorali MB49-PSA in completa mezzi DMEM (supplementato con 10% FBS, 2 mmol / L di L-glutammina, 0,05 mg / ml penicillina-streptomicina e 200 mcg / mL Hygromycin B) a 37 ° C e 5% CO 2 ad un rapporto di divisione di 1: 2.
- Il giorno della procedura, raccogliere le cellule raschiando delicatamente con un raschietto cellulare sterile. Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare eun 0,4% trypan soluzione blu. Contare le cellule vive usando un emocitometro. Non impiantare se più del 20% delle cellule sono morti.
- Calcolare la quantità di cellule vive richiesto (2 x 10 6 cellule / ml) e trasferirli in una provetta da 15 centrifuga. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in DMEM supporti vuoti. Ripetere il lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce di FBS prima dell'impianto.
- Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino topi sono pronti per l'impianto.
- Lasciare che il 4 a 6 settimane di età femminile C57BL topi / 6J da ambientare una settimana prima della procedura. Tutti i lavori animale deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica per mantenere condizioni sterili.
- Pesare ogni topo ed iniettare anestesia (75 mg / kg ketamina e 1 mg / kg medetomidina) per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo. Bodyweights dovrebbe essere compreso tra 17 e 22 g. Confermare anestesia osservando non RESPONSE dopo un pizzico dito del piede.
- Per l'identificazione, segnare l'orecchio con un pugno all'orecchio.
- Iniettare la soluzione di sodio o composto di Hartmann lattato per via intraperitoneale a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo ogni 1-2 ore per l'idratazione.
- Applicare pomata oftalmica sterile in entrambi gli occhi con un bulbo di cotone sterile, dal momento che il riflesso lampeggiante si perde in anestesia e gli occhi secchi. Riapplicare se necessario.
- Posare il mouse in posizione supina su carta assorbente sulla cima di un pacchetto di calore (attivato dal contatto con l'aria) per mantenere la temperatura corporea e nastro le zampe posteriori verso il basso.
- Con un dito, applicare una leggera pressione alla regione addominale inferiore e raccogliere l'urina dalla vescica in una provetta da 1,5 ml. Questo esempio serve come il valore basale di PSA urinaria.
- Estrarre sterile poli-L-lisina (PLL) in una siringa da 1 ml e allegare un 24-gauge catetere IV, con il mandrino dell'ago rimosso. Applicare il lubrificante alla punta del catetere e insert il catetere attraverso l'uretra nella vescica con pinze per guidare la cateterizzazione. Fermarsi quando si avverte resistenza. NOTA: ricercatori dovrebbero discutere con il proprio personale veterinario della necessità per l'uso di un gel lubrificante con anestetico per instillazioni endovescicale e l'uso di analgesici post-procedura.
- Instillare 50 ml di PLL lentamente, ad una velocità di 10 ml ogni 20 s, per evitare vescico-ureterale reflusso 18. Lasciare il catetere nella vescica per 20 min con un tappo per impedire out-flow.
- Dopo 20 minuti, rimuovere il catetere e lasciare la camera d'aria di qualsiasi contenuto premendo delicatamente sulla regione addominale inferiore. L'utilizzo di un vuoto siringa da 1 ml, lavare eventuali contenuti residui fuori del catetere.
- Mescolare le cellule MB49-PSA accuratamente pipettando e ritirarsi in una siringa da 1 ml. Fissare il catetere e applicare il lubrificante. Instillare 50 microlitri di 1 x 10 5 cellule ad una bassa velocità di 10 ml ogni 20 s. Sostituire il fermo sulil catetere. Dare topi di controllo 50 ml di soluzione fisiologica.
- Dopo 1 ora, rimuovere i cateteri e lasciare la vescica di qualsiasi contenuto. Rimuovere il nastro sulle zampe posteriori e posizionare il mouse sui loro lati ventrale. Rilanciare il topi per via sottocutanea che iniettano il farmaco di inversione (1 mg / kg atipamezolo) a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Monitorare il mouse fino a quando si osserva la motilità. Restituire i topi per loro gabbie.
- Al termine di un protocollo di rilevamento del tumore (sezioni 5, 7 o 8), eutanasia i topi con CO 2. individuazione del tumore post-mortem è descritto nel capitolo 6.
5. Monitoraggio crescita tumorale con ELISA
NOTA: la presenza del tumore e la crescita è monitorato nei topi, misurando la secrezione di PSA nelle urine. I ricercatori dovrebbero consultare il proprio personale veterinario sul monitoraggio della salute degli animali e il benessere l'impianto post-tumore e gli endpoint umane.
- Ci sono due metodi per raccogliere l'urina dai topi.
- Raccogliere urine notte posizionando un singolo mouse in un individuo gabbia metabolica per separare l'urina da materiale fecale. Se il set-up non ha refrigerazione, aggiungere un inibitore della proteasi (100 l) nel tubo di raccolta delle urine per prevenire la degradazione del PSA durante la notte. Tuttavia, il numero di gabbie metaboliche disponibili limita l'utilità di questo metodo di raccolta delle urine.
- Dove è logisticamente impossibile utilizzare gabbie metaboliche (come ad esempio nelle camere ABSL2), raccogliere l'urina posto utilizzando un dito per esercitare una leggera pressione sulla regione addominale inferiore, mentre i topi sono anestetizzati come descritto al punto 4.2.1. Questo è solitamente fatto prima della terapia è instillata. Dalla nostra esperienza, di almeno 150 ml di urina può essere raccolto 1 h dopo l'anestesia.
- Subito posizionare l'urina raccolta sul ghiaccio. Ematuria può essere visibile dalla seconda settimana dopo l'impianto del tumore. Altamente campioni emolizzati possono influenzare l'analisi ELISA. Pertanto, urinedevono essere posti su ghiaccio e trasformati rapidamente dopo la raccolta.
- Centrifugare le provette di urina a 6.700 xg per 5 minuti a 4 ° C per rimuovere le cellule o detriti.
- Per normalizzare la differenza di diuresi tra i topi, un'aliquota l'urina in nuove provette e conservarli a -30 ° C fino a effettuare le analisi per PSA utilizzando un kit ELISA 7 e creatinina utilizzando un kit di dosaggio 7. Anche se i topi non producono PSA, ci sono bassi livelli di legame non specifico identificati mediante ELISA. Per i campioni da considerare positivo, la soglia deve essere impostata a valori superiori a topi normali + 3 deviazioni standard (SD) 15.
6. Rilevamento della presenza del tumore con il Real-time PCR
- Alla cessazione, sezionare la cavità addominale del mouse e localizzare la vescica. Accise L'vescica e metterlo in una provetta Microbank ™. Congelare immediatamente in azoto liquido.
- Estrarre il RNA omogeneizzando i tessuti in un estr RNAreagente azione.
- Eseguire la trascrizione inversa e real-time PCR per PSA, come sopra descritto nella sezione 2.
7. Monitoraggio crescita tumorale con imaging di fluorescenza
- Etichetta 1 x 10 7 cellule MB49-PSA con un colorante fluorescente vicino infrarosso 19.
- Re-piastra e raccogliere le cellule marcate nei giorni 4, 7, 11, 14, 18, e 21 per verificare se le cellule mantengono la vitalità e fluorescenza mediante citometria di flusso 20.
- Impiantare le cellule MB49-PSA etichettati vesciche topi, come sopra descritto nella sezione 4.
- Monitorare la crescita tumorale mediante un sistema di imaging di fluorescenza ogni due giorni.
- Il giorno dell'imaging, pesare e anestetizzare topi usando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Radere la zona addominale per esporre la pelle.
- Posizionare topi in camera di imaging e acquisireimmagini delle vesciche utilizzando il software fornito con il sistema di imaging.
- Rivivere i topi da iniettare per via sottocutanea una droga di inversione (1 mg / kg atipamezolo) a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo.
8. Monitoraggio crescita tumorale con alta frequenza ultrasuoni Imaging
- tumori impianto in topi, come sopra descritti al punto 4.
- Ogni due giorni, monitorare la crescita del tumore mediante imaging ad ultrasuoni.
- Il giorno dell'imaging, pesare e anestetizzare topi usando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Radere la zona addominale per esporre la pelle.
- Instillare 100 ml di sterile 0,9% soluzione fisiologica nella vescica utilizzando una 24-gauge catetere IV. La soluzione salina sarà distendere la vescica e migliorare la visibilità durante l'ecografia.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma ecografica e applicare il gel conduttivo alla lotenza addome.
- Abbassare la sonda portatile per la pelle e acquisire immagini B-mode della vescica sulla piattaforma di imaging 21.
- Revive i topi da sottocutanea farmaco inversione iniezione (1 mg / kg atipamezolo) a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
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Representative Results
secrezione di PSA da cellule MB49 è risultata variare con i mezzi di crescita. MB49-PSA viene coltivato in DMEM media, perché questo si traduce in un aumento della secrezione del PSA (Figura 1A). Per determinare la sensibilità del PSA ELISA e PCR in tempo reale, diverso numero di MB49-PSA-secernenti cellule sono state mescolate con cellule parentali MB49. PSA ELISA rileva un minimo di 1 x 10 5 cellule secernenti PSA / 1 x 10 6 cellule (Figura 1B), mentre analisi in tempo reale PCR rileva 100 cellule secernenti PSA / 1 x 10 6 cellule (Figura 1C). Così, PCR in tempo reale è più sensibile ELISA, ma può essere eseguita solo su tutta la vescica. Questo limita la sua utilità per analisi end-point. Il metodo PLL dei risultati tumore impianto in tumori multipli (Figura 2A) sviluppo nella vescica. Entrambi raccolta durante la notte di urina con gabbie metaboliche (Figura 2B (Figura 2B, pannello inferiore) possono essere utilizzati per misurare PSA con ELISA. Per tutti gli studi su animali, il peso del mouse è noto come una misura di salute (Figura 2C, pannello superiore) e PSA urinaria è monitorato su base settimanale (Figura 2C, pannello inferiore) come misura della crescita tumorale. Non vi è generalmente una buona correlazione tra peso mouse e dimensioni del tumore, come misurato da PSA. I topi con tumori di grandi dimensioni inizia a perdere peso (Figura 2C, i topi 3 e 5). Alcuni topi osservati nella figura 2C possono avere un grosso tumore, ma mostrare ancora un peso corporeo normale. Così, peso corporeo da solo non è una misura sufficiente di crescita tumorale. PSA serve come un buon marker surrogato della crescita tumorale (Figura 3A-D). I topi sono stati sacrificati circa 3-5 giorni dopo l'analisi delle urine per PSA il giorno 14. Le immagini della vescica sezioni mostrano le dimensioni del tumore e il corrispondente giorno 14 PSA / creatinina x 10 6 reading. La variazione della dimensione del tumore è correlato al trattamento i topi ricevuto. Figura 3, pannelli AD rappresentano i topi da 3 diversi bracci di trattamento. Una strategia alternativa per PSA modifica delle cellule è l'etichettatura di cellule con un colorante. Questa strategia elimina la necessità di trasformazione cellulare e selezione. Labeling di cellule MB49-PSA con un colorante fluorescente è facile da eseguire (Figura 4A), e nel monitoraggio vitro dimostrato promettente in termini di sopravvivenza del segnale, nonostante la replicazione cellulare (Figura 4B e C). Tuttavia, imaging in vivo non ha avuto successo, in quanto l'alimentazione del mouse aveva anche naturale fluorescenza rossa (Figura 4D), che ha provocato la fluorescenza non specifica nella regione addominale. Il confronto è stato effettuato tra immagini ecografiche, PSA secrezione urinaria, e l'analisi PSA end-point. Ecografia della vescica (Figura 5A-H) era buono per l'identificazionetumori di grandi dimensioni, ma non era così tanto successo con piccoli tumori.
Figura 1. PSA secrezione da cellule MB49-PSA e la determinazione dei limiti di rilevamento utilizzando ELISA e analisi in tempo reale PCR. (A) 1 x 10 6 MB49-PSA cellule sono state coltivate in diversi media la crescita, e la secrezione del PSA nel surnatante è stato rilevato 2 giorni dopo da ELISA. I media di crescita sono stati: RPMI con FBS- (RPMI), RPMI con Premium FBS (RPMI (P)), RPMI con una FBS alternativi (RPMI (H)), e DMEM con FBS (DMEM). cellule MB49-PSA coltivate in DMEM media avevano maggiore secrezione di PSA. (B) cellule MB49-PSA (10 6 cellule per 1 cella) sono stati mescolati con cellule MB49 parentali (1 cellulari per 10 6 cellule) e piastrate per 24 h. PSA ELISA è stata eseguita sul supernatante, e l'RNA è stato estratto dalle cellule. Un minimo di 1 x 10 5 6 cellule erano rilevabili mediante ELISA. (C) 100 cellule PSA-secernenti / 1 x 10 6 cellule erano rilevabili mediante real-time PCR. I valori degli assi y rappresentano la media RQ (quantificazione relativa) ± deviazione standard. I valori RQ sono cambiamenti piega relativi, ottenuti normalizzando i valori C T di PSA al gene della beta actina e confrontati con una camera d'aria di controllo che è impostato a 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. vescica crescita tumorale e di rilevamento. (A) L'esame istologico di una vescica 13 giorni dopo l'impianto del tumore. La vescica incluso in paraffina è stato sezionato e macchiato con ematossilina (blu scuro), che stains i nuclei, e eosina (rosa), che colora le componenti cellulari rimanenti. Il PSA / creatinina x 10 6 valore per questo vescica nei giorni 5 e 13 sono mostrati come 7/2688. L'ingrandimento è a 44.8X. La barra di scala rappresenta 1 mm. (B) L'urina è stato raccolto da una delle topi messa in gabbie metaboliche durante la notte e il trasferimento della urina dal tubo di raccolta in 2 mL (pannello superiore) o con on-the-spot raccolta delle urine di topi anestetizzati (pannello inferiore) in provette da 1,5 ml , che sono stati poi trasferiti a 0,6 mL. (C) Dopo l'impianto del tumore, i topi di peso è stato monitorato due volte alla settimana (pannello superiore). PSA urinaria è stata misurata per monitorare l'impianto del tumore e la crescita nei topi (pannello inferiore). L'asse y PSA / Crea rappresenta PSA urinaria normalizzata in creatinina x 10 6. I topi sono stati chiusi una volta c'è stata una perdita di oltre il 20% del peso corporeo. Nota: l'espressione del gene PSA è stato rilevato nella vescica del mouse a 2 al giorno 40, quando era Termi NATed, anche se aveva bassa PSA urinario. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. PSA e della vescica crescita tumorale. (AD) sezioni istologiche di vesciche topi raccolte a giorno 19 (A e B), al giorno 17 (C) e il giorno 13 (D) dopo l'impianto del tumore. Il giorno 4 e il giorno 13 o il giorno 14 urinaria PSA / creatinina x 10 6 valori per ogni vescica viene visualizzato sul lato destro di ogni immagine nel formato giorno 4 / giorno 13 o 14. Il PSA urinaria / creatinina valori aumentano con le dimensioni del tumore . I topi in immagini dC ricevuto diverse terapie contabilità per le differenze di dimensioni del tumore. L'ingrandimento è a 41.4X. La barra di scala rappresenta 1 mm.target "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55078/55078fig3large.jpg" = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Profilo di celle MB49-PSA marcato con un colorante fluorescente. (A) cellule colorate sono state analizzate mediante citometria di flusso prima della placcatura. cellule marcate sono state raccolte ogni pochi giorni per analizzare l'intensità del colorante fluorescente. (B) percentuale di cellule MB49-PSA etichettati all'interno della porta P2 da (A) a giorni specifici post-etichettatura. (C) Intensità del colorante fluorescente misurato dalla fluorescenza media intensità (MFI) del segnale. (D) Immagini di topi 10 giorni dopo l'impianto con celle MB49-PSA etichettati utilizzando un sistema di imaging in vivo in mostravano fluorescenza non specifica nella regione addominale.Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. ultrasuoni Immagini di murini vesciche. Vesciche Mice (A) prima dell'impianto del tumore e (B) 8 giorni dopo l'impianto del tumore. (C) a (H) sono immagini ecografiche di topi vesciche due settimane dopo l'impianto. PSA / Crea: PSA urinaria normalizzata in creatinina (10 6). PSA gene: l'espressione genica del PSA nelle vesciche (log RQ) sono indicati per ogni vescica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| PSA urinaria | imaging di fluorescenza | Ultrasound Imaging | |
| Passi (tempo necessario) | Anestetizzare topi. Raccogliere 110 ml di urina. (~ 1 h) Eseguire PSA ELISA (tempo di incubazione totale: 2 h 30 min) dosaggio della creatinina (tempo di incubazione: 5 min) | Anestetizzare topi. Radere pelliccia sulla regione addominale. Eseguire l'imaging. | Anestetizzare topi. Radere pelliccia sulla regione addominale. Cateterizzare e infondere 100 ml di soluzione fisiologica nella vescica. Applicare gel conduttivo a basso addome e ottenere immagini ecografiche. |
| attrezzature specializzate | lettore di piastre ELISA (a lunghezza d'onda di 450 nm e 510 nm) | Imaging System | Ultrasound Imaging System |
| Modifica delle cellule tumorali | required (PSA espressione) | Richiesto (fluorescenza) | Non richiesto |
| vantaggi | Affidabile | Semplice e veloce | In grado di rilevare tumori di grandi dimensioni |
| limitazioni | Non può ottenere abbastanza urina Un valore negativo non significa assenza di tumore (PSA analisi di espressione genica aumenta la sensibilità, ma è limitata al punto finale di analisi) | è necessaria la selezione accurata dei colorante fluorescente per evitare fondo elevato. | Impossibile rilevare piccoli tumori. Un mouse alla volta. |
Tabella 1. Confronto di metodi di sorveglianza crescita tumorale nel topo le vesciche.
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Discussion
Le fasi più critiche nel protocollo sono 1) mantenere correttamente la tumorigenicità della linea cellulare; 2) garantire la secrezione di PSA misurabile prima dell'impianto delle cellule tumorali nei topi; 3) generare una cella singola sospensione per l'impianto in modo da ridurre la variazione della dimensione del tumore; e 4) instillare cellule a bassa velocità per evitare vescico-ureterale reflusso, con conseguente impianto di cellule tumorali nel rene.
Dopo passaggio prolungata in vitro, cellule MB49 / MB49-PSA possono perdere la loro tumorigenicità, come dimostrato dalla loro incapacità di produrre tumori nei topi. Questo potrebbe essere un fattore di confusione sul fatto o meno i topi sono guariti dopo la terapia. In assenza di tumori, non è possibile differenziare topi vulcanizzati per terapia da topi guariti spontaneamente per tumori immunogenici o da topi con nessun tumore affatto perché la linea cellulare è in grado di formare tumori. Un modo per contrastare questo è quello di ri-passage le cellule in topi producendo suB-cutanea tumori. Se questa ri-passaging viene eseguita troppo frequentemente, i tumori troppo aggressivi vengono generati. Un delicato equilibrio è necessario per determinare quando le cellule hanno bisogno di essere ri-diversi passaggi. Generalmente, prima di una importante serie di esperimenti, la linea cellulare viene ripreso e poi impiantato in topi per via sottocutanea per confermare la loro capacità di formare tumori. I tumori sono monitorati per diverse settimane per assicurare che non ci sono cure spontanee. Tuttavia, se si osservano le cure spontanee, quindi il protocollo al punto 3 deve essere eseguita. Analogamente, la capacità delle cellule MB49-PSA per produrre PSA deve sempre essere confermato prima che le cellule sono utilizzati per l'impianto del tumore.
PSA urinaria può essere utilizzato per monitorare la crescita dei tumori della vescica stabilita utilizzando cellule MB49-PSA. Tuttavia, un valore di PSA urinaria negativo o "normale" non significa necessariamente l'assenza di cellule tumorali, ma solo che meno di 1 x 10 5 cellule sono presenti. Come PSA urinaria è determinato intorno al giorno 4al 7 ° giorno, i topi che sembrano avere alcun tumore, sulla base del valore di topi normali + 3 SD, possono essere rimossi dall'esperimento. Alcuni di questi topi possono sviluppare un tumore in un secondo momento. Rimozione di topi con tumori non garantisce che i tumori sono molto simili per dimensioni prima di iniziare qualsiasi terapia. Questo riduce la variazione a causa delle dimensioni del tumore in risposta alla terapia. Una delle principali cause di variazione dimensioni del tumore è l'aggregazione delle cellule prima dell'impianto, in modo da sforzo dovrebbe essere fatto per ri-sospendere le cellule prima dell'impianto.
Tuttavia, quando si impiega un numero di topi, può essere necessario mantenere tutti i topi nello studio, anche se i tumori non sono misurabili in giorni 4 - 7. Monitorando PSA il giorno 11, può essere ancora possibile classificare questi topi come aver avuto piccoli tumori, e l'analisi end-point può essere eseguita rispetto alla dimensione del tumore (basato sulla presenza di PSA urinaria misurabile nei giorni 4 - 7 rispetto al giorno 11). Il vantaggio di essere in grado di quantificare tumoricon differenti valori di PSA è che tutti i topi possono essere inclusi nello studio, e la risposta alla terapia può essere determinato in base ai loro valori di PSA / creatinina rispetto alla dimensione del tumore originale. Un altro punto di preoccupazione è vescico-ureterale reflusso. Ciò può causare lo sviluppo del tumore nei reni. La riduzione del volume da instillato da 100 ml a 50 ml e di eseguire l'instillazione riduce lentamente la probabilità che ciò si verifichi.
Un problema associato con analisi dell'urina-based è la raccolta delle urine ridotta osservato come tumori ortotopico sviluppano nella vescica. Mentre urina può essere facilmente raccolti da topi durante le prime settimane dopo l'impianto, con il tempo, il volume di urina raccolto può non essere sufficiente per PSA misurazioni e creatinina. Il volume minimo di urina necessaria è di 110 microlitri, ma più è meglio. Così, le letture del PSA potrebbero non essere disponibili per tutti i mouse in momenti successivi. Inoltre, la lisi dei globuli rossi nelle urine dà falsamentemassimo sul PSA ELISA. Un test non-urina-based potrebbe superare questo problema. Purtroppo, però imaging di fluorescenza è semplice da utilizzare, abbiamo scoperto che l'alimentazione del mouse aveva fluorescenza rossa pure. Questo ha dato un fondo alto contro cui la vescica non poteva essere facilmente visibile. È possibile che utilizzando un colorante fluorescente verde o proteina può superare questo problema, come descritto da Sweeney et al. 10 Sia per fluorescenza e ultrasuoni, topi devono essere rasata sulla superficie ventrale.
immagini ecografiche sembrano essere buono come l'espressione genica del PSA nel localizzare i tumori. Tuttavia, lo svantaggio di ecografia è che la vescica deve essere dilatata durante l'imaging per ottenere una buona visualizzazione del tumore. Mentre le immagini sono chiare quando il tumore della vescica è grande, è difficile distinguere piccoli tumori nei topi dall'assenza di tumori. E 'stato riportato che l'ultrasuono può rilevare tumori di circa 1,5 mm di diametro 22, ma il giorno 4dopo l'impianto, i tumori sono molto più piccoli di questo. Così, questo metodo non può essere buono per la rilevazione di tumori sul giorno 4. Tabella 1 confronta le 3 diversi sistemi di monitoraggio del tumore; PSA ELISA è il più semplice da utilizzare e non richiede sistemi di imaging piccole-animale, che non possono essere disponibili presso tutti gli impianti di animali.
Data la maggiore sensibilità di analisi in tempo reale PCR dell'espressione genica PSA, può essere usato al posto di immunoistochimica per confermare se i topi sono stati curati quando l'esperimento è stato terminato. Con l'immunoistochimica, un tumore di 0,2 - 0,3 millimetri è rilevabile dal giorno 4 dopo l'impianto 15. Tuttavia, questo è un metodo di analisi end-point che non può essere utilizzato per monitorare l'impianto del tumore. In questo studio, la RM non è stata valutata, ma è stato segnalato per essere in grado di identificare la presenza di tumori giorno 10 dopo l'impianto 8. Modificando le cellule per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP), che is possibile confermare l'impianto del tumore di giorno 7. Una combinazione di PSA urinaria presto per rilevare l'impianto del tumore e analisi in tempo reale PCR a cessazione fornisce la conferma di impianto del tumore e l'efficacia terapeutica tra i diversi gruppi di trattamento.
Un inconveniente del nostro protocollo è principalmente che il saggio ELISA non può confermare la presenza di tumori quando il numero di cellule presenti è inferiore a 10 5 cellule. Così dosaggi più sensibili necessario sviluppare e saggi rapidi per ridurre il tempo necessario per il rilevamento PSA. ELISA richiede diverse ore per eseguire. Un metodo rapido, come il test creatinina che si basa sul metodo Jaffe 23 e dura circa 5 minuti per eseguire semplificherebbe notevolmente il monitoraggio della crescita tumorale. A questo scopo, un metodo a base di enzimi per rilevare l'attività PSA è stata valutata, ma non ha avuto successo. L'uso di oro colloidale e sistemi di dosaggio nanoparticelle basato potrebbe ridurre il tempo necessario per eseguire il test di unND aumentare la sensibilità 24. A questo proposito, sensori elettrodi base e sensori basati elettrochimici utilizzando nanoparticelle sono stati sviluppati per saggiare PSA umana 25-27 e se il costo è ragionevole può essere applicabile al modello animale. Il sistema di analisi potrebbe anche essere migliorata utilizzando un diverso sistema di secrezione di proteine come GFP o luciferasi in cui il dosaggio viene effettuato in condizioni ottimali in vitro piuttosto che a seconda imaging in vivo che dipende ossigenazione dei tessuti.
Mentre carcinogenesi chimica nei topi genera tumori con somiglianza tumori umani in termini di mutazioni 28, che richiedono più tempo per produrre e non sono di dimensioni paragonabili tra animali, richiedono un maggior numero di topi che aumenta il costo della sperimentazione. Quando ci si rivolge agenti che riconoscono proteine umane sono da valutare, xenotrapianti umani impiantati per via sottocutanea nella nude o Immunodeficienza combinata grave(SCID) topo è l'unica opzione. Sebbene questi modelli forniscono prova di concetto di riconoscimento anticorpale, la mancanza di un sistema immunitario intatto ostacola valutazione attivazione immunitaria. Il recente sviluppo di un modello umanizzato del mouse per il cancro della vescica utilizzando xenotrapianti umani 29, fornisce alcune intuizioni del sistema immunitario, ma come le cellule sono impiantati per via sottocutanea in realtà non ricapitolare l'ambiente malattia umana. E 'tecnicamente difficile da produrre tumori ortotopico nei topi deficienti immunitarie. Così il modello ortotopico singenici, nonostante i suoi limiti è ancora un buon modello per la valutazione e lo sviluppo di una terapia per il cancro della vescica in quanto fornisce la posizione del tessuto corretta consentendo esposizione controllata alla terapia modellare la situazione clinica e la capacità di valutare l'impatto delle cellule immunitarie dell'ospite durante la terapia del cancro. Tutto questo combinato con lo sviluppo del tumore nei topi rapida e la capacità di monitorare i risultati di crescita tumorale in un modello conveniente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4 - 6 wk old | |
| Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack - HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24 G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye - VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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