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Neuroscience

गर्भाशय में Electroporation Neuronal उप-जनसंख्या के excitability और एकल कोशिका कनेक्टिविटी अध्ययन के लिए दृष्टिकोण

Published: February 15, 2017 doi: 10.3791/55139
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department for Molecular and Cellular Biology, Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), 2Molecular Neurobiology Department, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC-UAM)

Summary

यह पांडुलिपि प्रोटोकॉल है कि utero electroporation (IUE) में उपयोग एकल कोशिका के स्तर पर और fluorescently लेबल न्यूरॉन्स के excitability में न्यूरॉन्स की संरचनात्मक कनेक्टिविटी वर्णन करने के लिए प्रदान करता है। प्रोटोकॉल के वृक्ष के समान है और axonal अनुमानों को चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। तीव्र स्लाइस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग excitability जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

तंत्रिका तंत्र अलग neuronal प्रकार की एक विशाल रेंज से बना है। ये न्यूरोनल उप-जनसंख्या अन्य सुविधाओं, उनके अलग वृक्ष के समान morphologies, axonal कनेक्टिविटी की उनकी विशिष्ट पैटर्न, और उनके चयनात्मक फायरिंग की प्रतिक्रियाओं के बीच में, की विशेषता है। विकास के दौरान भेदभाव के इन पहलुओं के लिए जिम्मेदार आणविक और सेलुलर तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं।

यहाँ, हम लेबलिंग के लिए संयुक्त प्रोटोकॉल का वर्णन है और संरचनात्मक कनेक्टिविटी और cortical न्यूरॉन्स के excitability निस्र्पक। में utero electroporation (IUE) प्रोटोकॉल का संशोधन न्यूरॉन्स की एक विरल आबादी की लेबलिंग की अनुमति देता है। यह, बारी में, पहचान और dendrites और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, axonal अनुमानों के लामिना स्थान की सटीक लक्षण, और morphometric विश्लेषण के axons की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। IUE भी की उत्तेजना में परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताजंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या electroporated दिमाग की तीव्र स्लाइस से पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ संयोजन के द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित न्यूरॉन्स। इन दोनों तकनीकों संरचनात्मक और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के युग्मन के एक बेहतर समझ के लिए और विकास के दौरान न्यूरोनल विविधता को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र का योगदान करते हैं। ये विकास की प्रक्रिया axonal तारों, न्यूरॉन्स की कार्यात्मक विविधता, और संज्ञानात्मक विकारों के जीव विज्ञान पर महत्वपूर्ण प्रभाव है।

Introduction

वृक्ष के समान और axonal संरचनाओं के विकास सेरेब्रल कॉर्टेक्स में शामिल है, तंत्रिका तंत्र में सर्किट विनियमन का एक महत्वपूर्ण पहलू है। यह विविध न्यूरोनल उप-जनसंख्या के चुनिंदा तारों के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल ही में रिपोर्ट की एक संख्या है कि पता चला है, कनेक्टिविटी के अलावा, न्यूरॉन्स की आणविक विविधता गोलीबारी की अत्यधिक विशेष मोड के अधिग्रहण से परिलक्षित होता है। हालांकि, तंत्र के विकास के दौरान उत्तेजना और विशिष्ट न्यूरोनल उपप्रकार की कनेक्टिविटी का निर्धारण करने के साथ-साथ समन्वय के अपने डिग्री, अभी भी खराब 1, 2 समझ रहे हैं।

विवो नुकसान में और लाभ के समारोह के विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति के स्तर और सर्किट के विकास में उनके प्रभाव के बीच संबंधों के अध्ययन के लिए अनुमति देने का विश्लेषण करती है। Utero electroporation में (IUE) व्यापक रूप से अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक तकनीक हैविशिष्ट neuronal आबादी में ब्याज की एक जीन के समारोह और उनके कनेक्टिविटी के समग्र पैटर्न का अध्ययन करने के लिए। हालांकि, रहने वाले चूहों में एक्सोन और cortical परतों में dendrites के लक्षण निर्धारित करने के लिए, यह कम न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए आवश्यक है। एक Cre पुनर्संयोजन IUE के साथ संयुक्त प्रणाली के अनुमानों पहचान cortical laminas के व्यक्ति की कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित हल करने के लिए एक पर्याप्त रूप से कम घनत्व में न्यूरॉन्स की एक विरल आबादी चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि electroporated दिमाग (चित्रा 1) की उचित संख्या के विश्लेषण के बाद मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए कोर्टेक्स प्रति न्यूरॉन्स के लिए पर्याप्त संख्या में लेबल। यह पांडुलिपि कनेक्टिविटी की तरह ठीक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह भी एक इसी तरह की रणनीति प्रस्तुत विश्लेषण करने के लिए अलग प्रयोगों में, हरे प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) पर वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन से न्यूरॉन्स के बिजली के गुणों तीव्र cortical स्लाइस से कोशिकाओं -electroporated। ये समर्थकtocols न्यूरॉन्स में जो घाटा और समारोह की बढ़त IUE के दौरान अतिरिक्त plasmids से पेश कर रहे हैं की बहुमुखी हैं और excitability और गुम्मट और ट्रांसजेनिक जानवरों के न्यूरॉन्स की कनेक्टिविटी के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, और भी।

हालांकि इस प्रोटोकॉल भ्रूण दिन (ई) 15.5 पर चूहों की electroporation का वर्णन है, इस तकनीक E9.5 3 और प्रसव के बाद दिन (पी) 2 से 4 के बीच किसी भी उम्र में किया जा सकता है। प्रारंभिक दौर में electroporation न्यूरॉन्स और चेतक के व्यापारियों और कोर्टेक्स की गहरी परतों, बाद में चरण electroporation के निशान अधिक ऊपरी परत (जैसे, E15.5 IUE लक्ष्यों परत द्वितीय-तृतीय न्यूरॉन्स) को निशाना बनाता है। सारांश में, एकल कोशिका रूपात्मक विश्लेषण और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी साथ IUE के संयोजन तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स की भारी संरचनात्मक और कार्यात्मक विविधता अंतर्निहित आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं राष्ट्रीय और यूरोपीय कानून के अनुपालन में मैड्रिड पशु की देखभाल और उपयोग समिति के समुदाय द्वारा अनुमोदित किया गया (PROEX 118/14, 331/15 PROEX)। प्रक्रिया के दौरान बाँझ शर्तों को बनाए रखें।

1. में utero electroporation

नोट: IUE के लिए इस प्रोटोकॉल दूसरों है कि पहले से प्रकाशित किया गया है 5, 6, 7 से अनुकूलित है। यह पांडुलिपि रिपोर्टर की रणनीति है कि एकल न्यूरॉन्स 8 और एक अलग प्रयोग में उनकी electrophysiological गुण मानक GFP संवाददाता plasmids का उपयोग करने की आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देने में संशोधनों के साथ E15.5 की IUE भ्रूण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

  1. डीएनए तैयारी
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक endotoxin मुक्त अलगाव किट का उपयोग डीएनए plasmids तैयार है और उन्हें 1x पी में पतलाhosphate बफर खारा (पीबीएस)।
      1. प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (जैसे, कैग-DsRed2 9), 1 माइक्रोग्राम / μL एन्कोडिंग एक नियंत्रण के रूप में: एकल कोशिका लेबलिंग के लिए, सर्जरी प्रति डीएनए मिश्रण के 10 μL (भ्रूण प्रति 1 μL) निम्नलिखित निर्माणों और अंतिम सांद्रता का उपयोग कर तैयार electroporation दक्षता के लिए; प्रयोगात्मक प्लाज्मिड आम तौर पर परीक्षण किया जा करने के लिए 1 माइक्रोग्राम / μL; LoxP बंद LoxP फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्लाज्मिड (CALNL-GFP 10), 1 माइक्रोग्राम / μL; और निर्माण एन्कोडिंग Cre 10, 1 - 4 एनजी / μL। इंजेक्शन डीएनए कल्पना करने के लिए पानी में 0.1% फास्ट ग्रीन के 1 μL जोड़ें (वजन / मात्रा)।
        नोट: GFP निर्माण की Cre पुनर्संयोजन केवल कुछ न्यूरॉन्स, जो दृश्य और व्यक्तिगत axonal अनुमानों (चित्रा 1 ए) के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है में होता है।
      2. मानक पैच दबाना अध्ययन के लिए, सर्जरी प्रति डीएनए मिश्रण के 10 μL (embr प्रति 1 μL तैयारयो) निम्नलिखित प्लाज्मिड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, कैग-GFP 11), 1 माइक्रोग्राम / μL एक पत्रकार के नियंत्रण के रूप में एन्कोडिंग के; प्रयोगात्मक प्लाज्मिड, आम तौर पर 1 माइक्रोग्राम / μL; और पानी में 0.1% फास्ट ग्रीन के 1 μL (वजन / मात्रा)।
        नोट: ये मानक electroporation की स्थिति है कि तीव्र वांछित पटल भीतर लेबल उत्तेजक न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या से युक्त स्लाइस का विश्लेषण कर रहे हैं। एकल कक्षों में पैच दबाना के अध्ययन को करने के लिए कदम 1.1.1.1 में वर्णित के रूप में डीएनए तैयार करते हैं।

2. सर्जरी के लिए तैयारी

  1. सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं का उपयोग करके एक अस्तित्व सर्जरी प्रदर्शन। मास्क, दस्ताने, उपकरण, और शल्य चिकित्सा क्षेत्र सहित बाँझ शर्तों, सुनिश्चित करें। सर्जिकल उपकरण (छुरी, Adson संदंश, कठोर ठीक कैंची, घुमावदार कैंची, Dumont संदंश, और सुई धारक) जीवाणुरहित।
  2. 1 / 0.58 मिमी बाहरी / आंतरिक व्यास का चयन borosilicate ग्लास केशिकाओं। पुल टोपीillaries 3। खींच के बाद 1 सेमी की एक इष्टतम टिप लंबाई के लिए लक्ष्य। लगभग एक 30 डिग्री ठीक संदंश (चित्रा 1 बी) का उपयोग कोण पर सुई टिप कट।
  3. बाँझ isotonic समाधान के 500 एमएल (1x पीबीएस या Hank's बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS)) तैयार करें। 100 और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इस समाधान गर्म: पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन 1 जोड़ें। यह सर्जरी के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  4. Subcutaneously दर्दनाशक दवाओं की एक खुराक preoperative (जैसे, Carprofen, 5 मिलीग्राम / किग्रा वजन) इंजेक्षन।
  5. एक हीटिंग पैड पर उन्हें रखने के द्वारा जानवरों को सर्जरी के लिए गर्म रखें। पश्चात की वसूली के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक साफ पिंजरे गर्म।

3. सर्जरी

  1. एक C57BL / 6 E15.5 isoflurane के साथ गर्भवती माउस anesthetize। सबसे पहले, 0.8 एल / मिनट ऑक्सीजन पर 3% isoflurane के साथ एक बंद कक्ष दिखे और अंदर माउस छोड़ जब तक यह नींद में है। एक हीटिंग पैड करने के लिए माउस स्थानांतरण और एक मुखौटा के भीतर नाक और मुंह जगह के लिए उद्धारisoflurane के वाई। धीरे-धीरे मुखौटा के माध्यम से 1.5% isoflurane करने के लिए सर्जरी के पाठ्यक्रम पर संज्ञाहरण कमी। पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) का एक नुकसान को देख कर उचित anesthetization की पुष्टि करें। इष्टतम प्रक्रिया लगभग 20 मिनट और अधिक से अधिक 45 मिनट लगते हैं।
  2. प्रक्रिया के दौरान सुखाने से आंखों को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें।
  3. पेट (या तो एक बिजली के रेजर या लोमनाशक क्रीम का उपयोग) के एक ~ 3 सेमी क्षेत्र से बाल निकालें। 70% इथेनॉल के साथ संचार कपास swabs, एक आयोडीन-संचार कपास झाड़ू के द्वारा पीछा के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को धो लें। तीन बार दोहराएँ।
  4. संक्रमण को रोकने के लिए बाँझ धुंध के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र को कवर किया।
  5. एक ऊर्ध्वाधर 2 सेमी लंबे midline के लिए त्वचा के माध्यम से खोलने और समानांतर बनाने के लिए छुरी का प्रयोग करें। त्वचा और पेट कुंद घुमावदार कैंची का उपयोग करने की मांसपेशियों को अलग करें। संदंश के साथ मांसपेशियों को पकड़ो और linea अल्बा के माध्यम से यह कटौती उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए।
  6. मदद ओ के साथ भ्रूण का पता लगाएँसंदंश च। 2.3 कदम में तैयार बाँझ खारा समाधान के साथ दो गीला गीला कपास swabs और खोलने के बाहर एक सुलभ भ्रूण हेरफेर करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं। भ्रूण के चारों ओर कपास swabs प्लेस और धीरे उदर गुहा से दोनों गर्भाशय सींग निकाल सकते हैं। प्रक्रिया के दौरान भ्रूण और खोला उदर गुहा गर्म नमकीन घोल के साथ हाइड्रेटेड रखने के लिए उन्हें बाहर सुखाने से रोकने के लिए।

4. डीएनए और electroporation इंजेक्शन

  1. उंगलियों telencephalon का पता लगाने के साथ धीरे भ्रूण हेरफेर (स्पष्ट रूप से मस्तिष्क के दो और पूर्वकाल पुटिकाओं के रूप में आंखों से देखे जा सकते हैं)। एक मुँह पिपेट में एक तैयार borosilicate केशिका रखें। गर्भाशय के माध्यम से सुई की नोक से गुजरती हैं, रक्त वाहिकाओं से परहेज है, जब तक यह एक पार्श्व वेंट्रिकल तक पहुँचता है। धीरे-धीरे तेजी से हरे रंग का डीएनए समाधान के लगभग 1 μL इंजेक्षन जब तक एक बड़े नीले मौके मनाया जाता है।
  2. वें पर laterally 7 एमएम प्लैटिनम इलेक्ट्रोड की जगहभ्रूण (चित्रा 1 सी) के ई सिर।
    नोट: डीएनए नकारात्मक आरोप लगाया है; इसलिए, यह सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर ले जाता है जब वोल्टेज प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के बीच लागू किया जाता है। इलेक्ट्रोड का स्थान अलग करके, मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों को निशाना बनाया जा सकता है।
  3. (E15.5 भ्रूण के लिए।: 5 दालों, 38 वी, 50-एमएस अंतराल चक्र की लंबाई, 950-एमएस अंतराल ठहराव इन शर्तों विकास मंच के आधार पर बदलती) प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के माध्यम से वोल्टेज लागू 12।
    नोट: वोल्टेज की स्थिति और विभिन्न भ्रूण चरणों के लिए इलेक्ट्रोड के लिए 1 टेबल देखें।
  4. प्रत्येक भ्रूण के लिए 4.3 - 4.1 दोहराएँ।

5. सर्जरी और Postoperation का अंत

  1. मां में गर्भाशय वापस हेरफेर करने के लिए कपास swabs का प्रयोग करें। गर्म नमकीन घोल के साथ उदर गुहा को भरने के बारे में (2 एमएल जोड़)।
  2. सरल बाधित टांके या एक सतत सिलाई के साथ मांसपेशियों सीवन। उपयोग # 6-0 सीवनएस।
  3. स्टेपल का प्रयोग बाहरी घाव को बंद करने के लिए। स्टैपल से पहले पेशी से त्वचा को अलग करने के लिए सावधान रहें। नाक मुखौटा निकालें।
  4. माउस जानवरों की सुविधा के कमरे में रखने से पहले गरम, साफ पिंजरे में 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें। एक जानवर की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक जानवर है कि अन्य जानवरों की कंपनी में सर्जरी आया है जब तक पूरी तरह से ठीक जगह नहीं है।
  5. सर्जरी के बाद के दिनों के दौरान पशुओं की निगरानी। दर्दनाशक दवाओं subcutaneously लागू करें (Carprofen, 5 मिलीग्राम / किग्रा वजन) हर 12 एच 2 दिनों के लिए या जानवर कानून के अनुसार। कोई अतिरिक्त पश्चात की देखभाल पिल्ले के लिए आवश्यक है।

6. तैयारी और नमूनों के विश्लेषण

  1. वैकल्पिक: p2 पर, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग electroporated पिल्ले में प्रतिदीप्ति की अभिव्यक्ति के लिए जाँच; जब IUE सफल होता है, प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से मैं देखा जा सकता हैसिर 13 एन। मार्क या चूहों कि सकारात्मक निम्न चरणों में उपयोग के लिए कर रहे हैं electroporated अलग। बांध और मानक जानवरों की सुविधा की स्थिति में पिल्ले रखें।
  2. अध्ययन के वांछित स्तर पर, transcardially चूहों छिड़कना। आमतौर पर, वृक्ष के समान और axonal विकास की सबसे सक्रिय चरण पहले तीन हफ्तों के प्रसव के बाद 2, 14, 15 से मेल खाती है।
    1. माउस प्रति 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 30 एमएल तैयार है और यह बर्फ पर ठंडा।
      चेतावनी: पीएफए ​​एक ज्ञात allergen और कैसरजन है। यह विषैला होता है। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
      नोट: पीएफए की राशि की जरूरत माउस (जैसे, P16 के लिए, छिड़काव के लिए 20 एमएल और postfixation के लिए 10 एमएल की जरूरत है) की उम्र पर निर्भर करता है।
    2. 1: 100 माइक्रोग्राम / एमएल ketamine के 8 बड़ा अनुपात: एक 1 के साथ पशु anesthetize करने के लिए एक ketamine-xylazine मिश्रण तैयार 100 माइक्रोग्राम / एमएल xylazine: पीबीएस (माउस प्रति चारों ओर 0.2 एमएल तैयार)।
    3. intraperitoneally कदम 6.2.2 में तैयार मिश्रण की 0.2 एमएल इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize।
    4. अपनी पीठ पर anesthetized माउस रखें। छाती एक छुरी का उपयोग कर के ऊपर एक क्षैतिज चीरा। ठीक कैंची के साथ मांसपेशियों और डायाफ्राम कट जब तक दिल मनाया जा सकता है।
      1. ठीक कैंची के साथ सही आलिंद में एक चीरा। धीरे धीरे खून को दूर करने के क्रम में एक 25 गेज सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल में पीबीएस के 20 एमएल इंजेक्षन। 20 एमएल पीएफए ​​(कदम 6.2.1) इंजेक्षन जब तक माउस कठोर है और अंगों सफेद हो जाते हैं।
      2. इसके तत्काल बाद सिर को हटाने और खोपड़ी के लिए गर्दन से त्वचा में एक midline चीरा बनाते हैं। धीरे घुमावदार संदंश का उपयोग खोपड़ी दूर छील और मस्तिष्क निकाल सकते हैं। पंचर या खोपड़ी के हटाने के दौरान मस्तिष्क को नुकसान नहीं विशेष ध्यान रखना। यह पोस्टफिक्स करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​के 10 एमएल में दिमाग रखो रात भर।
  3. Cryoprotec2 दिनों तक वे सिंक - टी दिमाग 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में 30% sucrose के 10 एमएल में तय की। 1-3 सेमी एल्यूमीनियम पन्नी क्यूब्स तैयार करें। क्यूब्स अक्टूबर के साथ जिस तरह का 2/3 भरें। दिमाग के अंदर डाल दिया और सूखी बर्फ पर क्यूब्स डाल कर उन्हें रोक। -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए दिमाग स्टोर।
  4. नमूना डिस्क की सतह पर अक्टूबर के प्लेस ड्रॉप, ऊतक विज्ञान क्यूब से एल्यूमीनियम पन्नी छील, और तरल अक्टूबर के शीर्ष पर नमूना डिस्क के लिए वांछित अभिविन्यास में घन स्थिति। फर्म दबाव लागू करें जब तक यह तय हो गई है। cryostat का नमूना सिर में नमूना डिस्क डालें। नमूना Orient (यह चाकू / ब्लेड के लिए एक अनुकूल स्थिति में ले जाने के रिश्तेदार)।
    1. धारा cryostat पर दिमाग। एक ठीक ब्रश का उपयोग कर 100 माइक्रोन मोटी अस्थायी cryosections 16 और उन्हें पीबीएस में जगह - 50 का चयन करें।
  5. दाग अगर वांछित।
    नोट: axonal आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए, एक GFP एंटीबॉडी के साथ धुंधला पुरजोर सिफारिश की है
  6. 1 घंटे के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स 100 (अवरुद्ध समाधान) युक्त पीबीएस में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ कमरे के तापमान पर वर्गों ब्लॉक। 1 के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते: 500 प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, खरगोश विरोधी GFP) समाधान को रोकने में पतला।
  7. पीबीएस में वर्गों तीन बार धोएं। 1 जोड़ें: 500 माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा स्त्राव 488) समाधान को रोकने के लिए और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते में पतला। पीबीएस में वर्गों तीन बार धोएं।
  8. पीबीएस ट्राइटन एक्स 100 10 मिनट के लिए 0.5% युक्त: DAPI (10,000 1) के साथ Counterstain। पीबीएस के साथ वर्गों कुल्ला। एक जलीय बढ़ते मध्यम 16 में वर्गों माउंट।

7. इमेजिंग और विश्लेषण

  1. प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी
    1. पूरा न्यूरॉन्स को फिर से संगठित करने के लिए, छवियों को एक उच्च वृद्धि (कम से कम 40X) और उच्च संकल्प (न्यूनतम 1024 x 1024) के साथ अधिग्रहण। को चुनिए "टाइल स्कैन "या अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में बराबर विकल्प हित के क्षेत्र, सभी dendrites और axonal प्रक्रियाओं में फैले कवर करने के लिए। जेड अक्ष पर ढेर के लिए पर्याप्त संख्या में मोल जानकारी का एक नुकसान से बचने के लिए।
      नोट: आम तौर पर, माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर एक "अनुकूलित ढेर" का विकल्प है, लेकिन अगर यह मामला नहीं है, परीक्षण मैन्युअल निर्धारित करने के लिए कितने कदम जरूरी हैं छवियों के आदेश को सही ढंग से अलग-अलग अनुमानों को परिभाषित करने में ओवरलैप करने के लिए। दो महत्वपूर्ण मापदंडों को पिनहोल और उद्देश्य हैं; खाते में ले "उच्च वृद्धि, अधिक संकल्प, और अधिक आवश्यक Z-कदम।"
  2. विश्लेषण
    नोट: हालांकि कई मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है, कदम 7.2.1 दो पर केंद्रित है: डेन्ड्राइट आकृति विज्ञान और अक्षतंतु शाखाओं में बंटी। डाउनलोड फिजी ( http://fiji.sc/ )।
    1. छवि खोलें, मेनू से "खंडों लाइन" विकल्प का चयन करें। एक लाइन ड्रा (तक चलती है और नीचे वीं साथई जेड अक्ष माउस स्क्रॉल) न्यूरॉन की संरचना का पालन करके। रेखा को बचाने के लिए "विश्लेषण, उपकरण, रॉय प्रबंधक जोड़ने," करने के लिए जाओ (वैकल्पिक रूप से, प्रेस "टी")। हर अक्षतंतु या विश्लेषण किया न्यूरॉन 2 की डेन्ड्राइट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    2. रॉय प्रबंधक मेनू प्रेस में "उपाय" बटन लंबाई (या अतिरिक्त पैरामीटर) पाने के लिए। एक पाठ फ़ाइल या स्प्रेडशीट के लिए माप निर्यात उन्हें विश्लेषण करने के लिए।

8. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी

नोट: इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य द्वितीय / तृतीय पिरामिड सेल GFP-electroporated माउस दिमाग (या किसी भी अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले electroporated) में GFP अभिव्यक्ति द्वारा नेत्रहीन पहचान न्यूरॉन्स परत से पूरे सेल वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए है। यह पहले प्रकाशित तरीकों 17, 18 का रूपांतरण है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह एक आनुवांशिक modif के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संभव हैication न्यूरॉन के बिजली के गुणों पर IUE द्वारा शुरू की। विशिष्ट फायरिंग मोड के अधिग्रहण के भेदभाव के एक क्रमिक प्रक्रिया है कि आयन चैनल की एक विस्तृत प्रदर्शनों की सूची के गतिशील अभिव्यक्ति शामिल है और है कि देर से प्रसव के बाद के चरणों से पहले क्षणिक फायरिंग मोड की अभिव्यक्ति में परिणाम है। उदाहरण के लिए, परिपक्व बिजली प्रतिक्रियाओं P16 2, 19 से पहले परत somatosensory माउस कॉर्टेक्स के द्वितीय / तृतीय में नहीं मनाया जाता है।

  1. तीव्र स्लाइस के लिए किसी और चीज की
    1. चूहों से दिमाग को दूर करने के लिए बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार: सिर को हटाने के लिए एक गिलोटिन; छोटे कैंची, खोपड़ी के माध्यम से कटौती करने के लिए; संदंश, ऊतक से खोपड़ी को अलग करने के लिए; एक रंग, नाजुक इसके आवरण से मस्तिष्क के ऊतकों को दूर करने के लिए; एक धातु स्लाइसर, दो बराबर हिस्सों में कोर्टेक्स टुकड़े करना; और एक पाश्चर विंदुक, vibratome (उन्हें एक समाधान कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव युक्त में जगह से स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए (एसीएस एफ) के निरीक्षण के लिए, और फिर एक ऊष्मायन जोत क्षेत्र के लिए ACSF से स्लाइस हस्तांतरण)।
    2. उच्च शुद्धता (डबल आसुत जल) का पानी युक्त 119 मिमी NaCl, 26 मिमी NaHCO 3 का उपयोग ACSF के 1 एल तैयार, 11 मिमी ग्लूकोज, 2.5 मिमी KCl, 1.2 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी 2 CaCl, और 1 मिमी नः 2 पीओ 4। 7.3 पीएच titrate - एचसीएल या NaOH के साथ 7.4। 290 mOsm को परासारिता को समायोजित करें।
    3. Carbogen के साथ बुलबुला ACSF (95% 2 हे / 5% सीओ 2) 15 के लिए - 7.4 - Teflon ट्यूब (~ 1 मिमी) का उपयोग करते हुए 7.3 पीएच को स्थिर करने के लिए 20 मिनट।
    4. 15 मिनट के एक हलका विच्छेदन समाधान उत्पन्न करने के लिए - ACSF समाधान के लिए 10 -80 डिग्री सेल्सियस पर carbogen के साथ संतृप्त की 200 मिलीलीटर रुक। बर्फ पर एक 100- x 20 मिमी टिशू कल्चर पकवान मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के लिए रखें।
    5. अभी प्रयोग के शुरू होने से पहले 1% कम पिघलने बिंदु agarose समाधान के 100 एमएल तैयार करें। समाधान कूल, agarose (आयाम: 1 एक्स 1 x 0.5 मिमी) का एक चौकोर टुकड़ा बाहर कटौती, और यह करने के लिए superglueमंच के पीछे, ठीक पीछे जहां मस्तिष्क कटा हुआ है (agarose जेल समर्थन मस्तिष्क के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान प्रदान करता है)। मोर्चे के रूप में संभव के रूप में फ्लैट बनाओ।
  2. तीव्र स्लाइस प्राप्त
    1. माउस स्थिर करना और साथ isoflurane 2% यह anesthetize। गिलोटिन खोलने में सिर की जगह है और यह तेजी से सिर काटना। हड्डी रेंजरों या ठीक संदंश के उपयोग के साथ जितनी जल्दी हो सके अपनी खोपड़ी निकालें। ठंडा ACSF में मस्तिष्क रखो।
      नोट: यह इस कदम जल्दी से प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    2. ठंडा संस्कृति डिश में मस्तिष्क रखें। छोटी कैंची से सेरिबैलम काट दिया।
    3. एक रंग के साथ मस्तिष्क उठाओ और यह एक कागज तौलिया पर सूखी दाग।
    4. एक vibratome धारक पर मस्तिष्क की ventrocaudal विमान गोंद। ठंडा ACSF से भरा एक vibratome पर धारक रखें।
    5. काटने के 300 माइक्रोन राज्याभिषेक वर्गों (प्रक्रिया के दौरान जारी रखा carbogenation सुनिश्चित करने, उदाहरण के लिए, एक bubbler जगह (1 मिमी से तीव्र स्लाइस प्राप्तpolytetrafluoroethylene ट्यूब) vibratome कक्ष में) के बाद vibratome सेटिंग्स का उपयोग: 0.06 मिमी आयाम और 0.08 - 0.10 मिमी / s गति। धीमी गति संभव (~ पारित प्रति 22 एस) के अग्रिम सेट करें। इन इष्टतम सेटिंग्स को संशोधित करने और अनुभव से यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक मशीन के लिए इष्टतम स्थितियों प्राप्त करते हैं।
    6. ACSF में कम से कम 60 मिनट 3 मिमी म्यो -inositol के साथ पूरक, 0.4 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड, और 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट के लिए तीव्र स्लाइस सेते 95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस के साथ बुदबुदाती है। 25 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें।
    7. कम से कम 15 मिनट में टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया करते हैं। उपयोग के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित किया जा रहा से पहले 7 एच - अगर वांछित, स्लाइस 1 के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  3. पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए किसी और चीज की
    1. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टेशन एक रिकॉर्डिंग कक्ष, एक छिड़काव प्रणाली, एक माइक्रोस्कोप, इलेक्ट्रोड (रिकॉर्डिंग, उत्तेजक, और जमीन), स्थूल और माइकर के साथ सुसज्जित है बनाओomanipulators, एक कठोर कंपन प्रतिरोधी टेबल टॉप और फैराडे पिंजरे, एक उत्तेजक, एक एम्पलीफायर और एनालॉग से डिजिटल (ए / डी) कनवर्टर, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर और एक GFP (या किसी भी अन्य fluorochrome) का विश्लेषण करने के लिए फिल्टर आनुवंशिक रूप से संशोधित न्यूरॉन्स 18 (2A चित्रा)।
    2. 115 मिमी पोटेशियम gluconate, 2 मिमी MgCl 2, 10 मिमी HEPES, 20 मिमी KCl, 4 मिमी ना 2 एटीपी, और 0.3 मिमी ना 3 जीटीपी, KOH द्वारा और KCl द्वारा 290 mOsm पीएच 7.2 करने के लिए समायोजित युक्त, intracellular समाधान तैयार है।
    3. borosilicate ग्लास केशिकाओं खींच कर पैच pipettes बनाओ। एक micropipette खींचने का उपयोग पैच इलेक्ट्रोड तैयार। उपयोग borosilicate केशिकाओं (1.5 मिमी बाहरी व्यास, 0.86 एमएम भीतरी व्यास, 10 सेमी लंबाई)। जब intracellular समाधान के साथ भरा पैच इलेक्ट्रोड 3-10 MΩ का प्रतिरोध दिखा बनाओ।
    4. 2 एमएल / मिनट की दर से ACSF के साथ रिकार्डिंग कक्ष छिड़कना। approxim पर चैम्बर के तापमान को बनाए रखेंately 33 डिग्री सेल्सियस।
  4. पूरे सेल रिकॉर्डिंग
    1. एक पाश्चर विंदुक (लंबी टिप काट) या एक छोटे से ब्रश का उपयोग कर रिकार्डिंग कक्ष में स्लाइस स्थानांतरण। वीणा के साथ टुकड़ा दबाए रखें। 2 एमएल / मिनट की दर से लगातार ACSF के साथ स्लाइस छिड़कना।
    2. एक GFP पॉजिटिव न्यूरॉन पैच।
      1. रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा रखो और कम बढ़ाई (10X) में माइक्रोस्कोप के माध्यम से हित के क्षेत्र हैं। फिर, 60x उद्देश्य का उपयोग पैच करने के लिए एक GFP पॉजिटिव सेल पाते हैं।
      2. intracellular समाधान के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें। सिरिंज फिल्टर (4 मिमी फिल्टर) से जुड़ा हुआ है और माइक्रो-लोडर टिप का उपयोग intracellular समाधान के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को भरने के लिए।
      3. पिपेट धारक में कांच पिपेट रखें। स्नान में पिपेट टिप प्लेस और टिप पर ध्यान केंद्रित। एक बार पिपेट स्नान में है, वापस दबाव नियंत्रण प्रणाली के माध्यम से सकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
      4. एक न्यूरॉन कि फ्लोरोसेंट है पैच (अंजीरUre 2 बी)।
        1. दृश्य मार्गदर्शन के तहत ब्याज की सेल दृष्टिकोण समय पहले पिपेट में दबाव बनाए रखने। कोशिका की सतह पर एक छोटा सा डिंपल की उपस्थिति पर, दबाव जारी है। इस बिंदु पर, एक तंग सील (प्रतिरोध 1 GΩ से बड़ा) का गठन किया जा सकता है। अन्यथा, यह सुविधाजनक बनाने के लिए एक प्रकाश नकारात्मक दबाव (चूषण) लागू होते हैं।
        2. सील गठन किया जा रहा है, वहीं -60 एम वी पकड़े वोल्टेज दबाना लाने के लिए। एक बार जब GΩ मुहर का गठन किया है, पिपेट के नीचे कोशिका झिल्ली टूटना और पूरे सेल मोड में जाने के लिए सक्शन की एक नाड़ी लागू होते हैं। संदर्भित 20 अधिक जानकारी के लिए देखें।
      5. गतिविधि वर्तमान दबाना शर्तों 21 का उपयोग कर रिकॉर्ड। एक बार जब पूरे सेल मोड में, वर्तमान दबाना मोड में वोल्टेज दबाना से स्विच और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। उदाहरण के लिए, सेल excitability रिकॉर्ड करने के लिए लागू होते हैं, 500 एमएस लंबी वर्तमान इंजेक्शन depolarizing (100 - 400 से देहात)।
        1. गणना फायरिंग दरों खY इनपुट धाराओं को बढ़ाने के लिए ट्रेन के साथ कार्रवाई की क्षमता की संख्या की साजिश रचने।
          नोट: आराम झिल्ली क्षमता, इनपुट प्रतिरोध, और झिल्ली समाई भी रिकॉर्डिंग 21 से गणना की जा सकती है।

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Representative Results

विस्तार में और विकास भर में न्यूरॉन्स की रूपात्मक परिवर्तन को चिह्नित करने के लिए, यह कम न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए आवश्यक है। केवल इतना है कि उन न्यूरॉन्स कि इस एंजाइम को शामिल GFP (चित्रा 1 ए) एक्सप्रेस एक Cre पर recombinase पतला प्रणाली, न्यूरॉन्स की एक विरल आबादी में ब्याज की एक जीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। इस रणनीति का प्रयोग, परत द्वितीय-तृतीय को निशाना बनाया और E15.5 में IUE द्वारा लेबल है। कैग-DsRed2 1 माइक्रोग्राम / μL पर, सह electroporated एक नियंत्रण के रूप में और रहने वाले जानवरों में सकारात्मक electroporated दिमाग की पहचान है। महत्वपूर्ण बात है, विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ धुंधला के बाद, संकेत काफी मजबूत उनकी वृक्ष के समान morphologies और एक्सोन (चित्रा -1 और ई) का स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए है।

IUE और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के बाद, पूरे सेल रिकॉर्डिंग से प्राप्त मापदंडों का विश्लेषण सह करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंफायरिंग की प्रतिक्रियाओं और electroporated कोशिकाओं के excitability अलग अलग परिस्थितियों में mpare। कई मापदंडों प्राप्त किया जा सकता है। मापदंडों के विशिष्ट पैच दबाना विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। चित्रा -2 सी इनपुट वर्तमान के खिलाफ कार्रवाई की क्षमता एक गुम्मट परत द्वितीय-तृतीय न्यूरॉन कि E15.5 पर electroporated था की रिकॉर्डिंग से प्राप्त की साजिश का एक उदाहरण है।

आकृति 1
चित्रा 1. एक Cre पर recombinase पतला रणनीति cortical न्यूरॉन्स के विरल लेबलिंग सक्षम बनाता है। रणनीति के ए योजनाबद्ध सारांश। दोनों CALNL-GFP और सीआरई ले जाने के न्यूरॉन्स में, LoxP बंद LoxP कैसेट CALNL-GFP के बाहर excised है, और GFP मजबूत सीएजी प्रमोटर द्वारा व्यक्त की है। एक borosilicate केशिका के बी योजनाबद्ध ड्राइंग एक micropipette खींचने का उपयोग खींच लिया। टिप के लिए से कट जाता हैrceps, एक 30 डिग्री के कोण बनाने। केशिका के संकरा भाग की शुरुआत करने के लिए टिप से 1 सेमी को मापने। सी इलेक्ट्रोड की स्थिति somatosensory प्रांतस्था निशाना बनाने के लिए। प्लैटिनम इलेक्ट्रोड लगभग भ्रूण के कान पर रखा जाता है। इसके नकारात्मक चार्ज के कारण, डीएनए सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर चला जाता है जब वोल्टेज लागू किया जाता है। इलेक्ट्रोड की स्थिति में भिन्नता अलग मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित अनुमति देता है। डी वैक्टर के बाद प्राप्त छवियों भ्रूण दिन 15.5 पर utero electroporation में से परत द्वितीय-तृतीय न्यूरॉन्स के लिए दिया गया था; राज्याभिषेक वर्गों प्रसव के बाद दिन 16. कैग-DsRed2 वेक्टर एक नियंत्रण (बाएं) के रूप में सह ट्रांसफ़ेक्ट गया था पर किए गए थे। GFP (मध्य) केवल उन न्यूरॉन्स भी है कि Cre शामिल में व्यक्त किया जाता है, CALNL-GFP वेक्टर में LoxP साइटों के पुनर्संयोजन की इजाजत दी। विरल लेबलिंग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स (तीर) प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ई उच्च बढ़ाई टी के confocal छविवह एक और कम लेबल GFP न्यूरॉन के वृक्ष के समान arbors। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी सेटिंग और उदाहरण एक फायरिंग प्रतिक्रिया की। ए फोटोग्राफ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तीव्र स्लाइस में पैच दबाना प्रयोगों के लिए इस्तेमाल सेटअप पता चलता है। सेटअप शोर को खत्म करने के लिए एक फैराडे पिंजरे में शामिल किया गया है, और उपकरणों के लिए एक विरोधी कंपन तालिका के शीर्ष पर है। इलेक्ट्रोड के लिए मोटर micromanipulators के नियंत्रकों छोड़ दिया पर मनाया जाता है। एक माउस GFP के साथ electroporated के बी पिरामिड न्यूरॉन, उज्ज्वल क्षेत्र और हरे रंग की रोशनी की शर्तों के तहत मनाया। रिकॉर्डिंग पिपेट एक GFP + सेल से जुड़ी ध्यान देने योग्य है। स्केल बार = 10 & #181, एम। सीएजी-GFP के सी फायरिंग पैटर्न electroporated ठेठ नियमित रूप से spiking प्रतिक्रिया दिखा नियंत्रण परत द्वितीय-तृतीय न्यूरॉन। कार्रवाई क्षमता का वितरण इनपुट वर्तमान (एक्स अक्ष) की अवधि के साथ एक नियमित रूप से वितरण करने के लिए अनुमान लगाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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मंच वोल्टेज इलेक्ट्रोड्स संदर्भ
E9.5 7 वी, 100 एमएस, 3 दालों छड़ी प्लैटिनम इलेक्ट्रोड मात्सुई एट अल। 2011 3
E12.5 30 वी, 50 एमएस, 3 - 5 दालों संदंश प्रकार इलेक्ट्रोड 3 मिमी उल्लेख किया गया था, टी, 2006 12
E15.5 35-48 वी, 50 एमएस, 5 दालों संदंश प्रकार इलेक्ट्रोड 5-7 मिमी रोड्रिगेज-Tornos एट अल। 2016 2, उल्लेख किया गया था, टी, 2006 12
इस p2 100 वी, 50 एमएस, 5 दालों संदंश प्रकार इलेक्ट्रोड 5-7 मिमी Sonego एट अल। 2013 4

तालिका 1: वोल्टेज की स्थिति और इलेक्ट्रोड भ्रूण की electroporation के लिए।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन C75BL / 6 चूहों के somatosensory प्रांतस्था के न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए कैसे क्रम में उनकी कनेक्टिविटी और उनकी उत्तेजना का विश्लेषण करने के लिए। मौजूदा तरीकों के संबंध में, यह इस तरह के न्यूरॉन प्रति axonal शाखाओं की संख्या, उनके सटीक स्थलाकृति, और उनके संरचनात्मक स्थान के रूप में कनेक्टिविटी के भेदभाव पहलुओं, visualizes। इलेक्ट्रोड की स्थिति में फेरबदल करके, यह इस तरह के सिंगुलेट प्रांतस्था के रूप में अन्य न्यूरॉन आबादी, लक्षित करने (इलेक्ट्रोड और मस्तिष्क के बीच एक ही कोण रखने के लिए, लेकिन डंडे का रुख बदल) या हिप्पोकैम्पस 5, और इसी तरह के प्रदर्शन के लिए संभव है प्रयोगों व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या व्यापक आबादी, वांछित रणनीति के आधार पर लेबलिंग। हालांकि, इस के लिए सीमाएं, के रूप में नहीं सभी आबादी को समान रूप से सुलभ या समान रूप से चुनिंदा लेबल रहे हैं। उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस में, यह संभव चुनिंदा सीए 1 क्षेत्र की देर जन्मे न्यूरॉन्स निशाना बनाने के लिए है, लेकिन ईएरेलवे electroporation भीतरी और बाहरी पिरामिड कोशिकाओं की विषम आबादी के निशान। सेरेब्रल कॉर्टेक्स में, न्यूरॉन्स एक अनुक्रमिक तरीके से पैदा होते हैं, इसलिए IUE दौरान गर्भ दिन निर्धारित करता है जो cortical परत प्रभावित है। प्रदर्शन पहले IUE लक्ष्यों को गहरी न्यूरॉन्स (जैसे, E14 पर IUE परत चतुर्थ न्यूरॉन्स लेबल) 22।

एक सफल IUE के लिए, यह खाते कुछ विचार में लेने के लिए सिफारिश की है। सबसे पहले, यह क्रम में मां पर तनाव को कम करने और पिल्ले के जीवित रहने की संभावना को बढ़ाने के लिए कम से कम 30 मिनट में सर्जरी करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा है के इंजेक्शन के रूप में धीरे संभव के रूप में borosilicate केशिकाओं के माध्यम से इंजेक्शन डीएनए प्रदर्शन करते हैं। भ्रूण भी मुश्किल दबाया जाता है, तो वे नुकसान पहुंचाया जा सकता है। , डीएनए इंजेक्शन के दौरान भ्रूण की मौत के निवारण के beveling एक 30 डिग्री के कोण के साथ टिप इस समर्थक की प्रभावकारिता में वृद्धि कर सकते हैं के संदर्भ मेंउपकर। एक beveller उपलब्ध नहीं है और केशिकाओं संदंश के साथ पूरी तरह से काट रहे हैं, तो सही कोण विदारक माइक्रोस्कोप में पुष्टि की जा सकती है। अपर्याप्त केशिकाओं त्यागें। अंत में, भ्रूण के चरण के लिए electroporation की स्थिति अनुकूल ढालने के क्रम में जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है (1 टेबल देखें)।

कुछ कारणों से axons और dendrites के पुनर्निर्माण के संबंध में आवश्यक हैं। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबल, Cre प्लाज्मिड की उचित एकाग्रता एक अच्छा है, विरल अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए और विभिन्न न्यूरॉन्स से संबंधित न्यूरोनल अनुमानों के confounding ओवरलैप से बचने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल 4 एनजी / μL के उपयोग का प्रस्ताव है, इसे इस्तेमाल प्रमोटर पर निर्भर करता है, एक प्रयोग के लिए प्लाज्मिड एकाग्रता समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, डीएनए तैयारी की गुणवत्ता, मात्रा का ठहराव और डीएनए की विधि (जैसे, यह करने के लिए कम 2 एनजी / μL लेबलिंग भी कई न्यूरॉन्स है)। additi मेंपर, axonal नज़र रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण आदेश में एक ही विमान में पूरे न्यूरॉन है करने के लिए एक उचित कोण पर कटौती करने के लिए है।

सफल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण कदम तीव्र स्लाइस के ऊतक के स्वास्थ्य और स्थान और electroporated GFP पॉजिटिव न्यूरॉन्स की बहुतायत है। पट्टी चरण विफल या न्यायपालिका प्रतिक्रियाएं रिकॉर्डिंग के दौरान पाए जाते हैं, तो तीव्र स्लाइस के प्रसंस्करण के लिए समय कम। GFP न्यूरॉन्स तीव्र टुकड़ा में उनके कम संख्या के कारण की पहचान और पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है, तो यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त कैग-GFP प्लाज्मिड electroporation मिश्रण में शामिल किया गया है। यहाँ बताया दृष्टिकोण के मुख्य सीमाओं के संबंध में, पैच दबाना तकनीक न्यूरॉन के excitability का वर्णन कई अलग अलग मानकों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, लेकिन यह पहलुओं है कि पूरे सर्किट पर निर्भर का मूल्यांकन नहीं करता। इसके अलावा, और जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, नहीं सभी न्यूरोनल उप-जनसंख्या IUE के माध्यम से सुलभ हैं। सारांश में, वीं मेंई भविष्य, इन तकनीकों मस्तिष्क में विभिन्न न्यूरोनल उप-जनसंख्या के संरचनात्मक और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के आगे के विश्लेषण के लिए योगदान कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखक किसी प्रकार के हित संघर्ष की घोषणा नहीं करते।

Acknowledgments

हम उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए और संपादन के लिए ला वेइस के लिए आर Gutiérrez और ए मोरालेस के आभारी हैं। CGB स्पेनिश Ministerio de Ciencia ई Innovación (MICINN), एफपीआई-bes-2012-056011 वित्त पोषित है। इस काम के एम Navarrete के लिए BBVA फाउंडेशन और SAF2014-58598-जिन (MINECO) से अनुदान द्वारा और रेमन Areces फाउंडेशन और अनुदान SAF2014-52119 आर और BFU2014-55738-REDT (MINECO से) करने से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया एम Nieto।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCAG-Cre Addgene 13775
pCALNL-GFP Addgene 13770
pCAG-DsRed2 Addgene 15777
pCAG-GFP Addgene 11150
Fast Green Carl Roth 301.1
EndoFree Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12362
Carprofen (Rimadyl) Pfizer GmbH 1615 ESP
Isoflurane (IsoFlo) Abbott (Esteve) 1385 ESP
Ketamine (Imalgene) Merial 2528-ESP
Xylazine (Xilagesic) Calier 0682-ESP
Povidone Iodine Meda 694109.6
Eye Ointment (Lipolac) Angelini 65.277
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco by Life Technologies 24020-091
Penicillin-Streptomycin Sigma -Aldrich P4333
Scalpel Handle # 3 - 12 cm Fine Science Tools 10003-12
Scalpel Blades # 10 Fine Science Tools 10010-00
Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm Fine Science Tools 1106-12
Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm Fine Science Tools 14090-11
Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm Teleflex PO143281
Thin curved tips - Style 7 Dumoxel Dumont 0303-7-PO
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11251-20
Mathieu Needle Holder - Serrated Fine Science Tools 12010-14
AutoClip Applier Braintree scientific, Inc ACS APL
9 mm AutoClips MikRon Precision, Inc. 205016
Sutures - Polysorb 6-0 Covidien UL-101
Electric Razor  Panasonic ER 240
Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma -Aldrich A5177-5EA
Gauze (Aposan) Laboratorios Indas, S.A.U. C.N. 482232.8
Cotton Swabs (Star Cott) Albasa -
Needle 25 G (BD Microlance 3) Becton, Dickinson and Company 300600
Sucrose Sigma -Aldrich S0389
Paraformaldehyde Sigma -Aldrich 158127
OCT Compound Sakura 4583
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Falcon 353003
GFP Tag Polyclonal Antibody Thermo Fisher Scientific A-11122
Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11008
DAPI Sigma-Aldrich D9542 
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270106 
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Electroporator ECM 830  BTX Harvard Apparatus 45-0002
Platinum electrodes 650P 7 mm Nepagene CUY650P7
Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F Leica -
VIP 3000 Isofluorane Vaporizer Matrx -
TCS-SP5 Laser Scanning System Leica -
Axiovert 200 Microscope Zeiss -
Cryostat - CM 1950 Leica -
P-97 Micropette Puller Sutter Instrument Company P-97
Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) Molecular Devices -
Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) Molecular Devices DD1440A
Motorized Micromanipulator + Rotating Base  Sutter Instrument MP-225
Air Table Newport -
Miniature Peristaltic Pumps WPI -

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References

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Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), e55139, doi:10.3791/55139 (2017).

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