Summary
Dette manuskriptet gir protokoller som bruker i utero electroporation (IUE) for å beskrive strukturelle tilkobling av nerveceller ved encellede nivå og oppstemthet av fluorescensmerkede nevroner. Histologi brukes til å karakterisere dendrittiske og aksonal anslag. Hel-celle-opptak i akutte skiver blir brukt til å undersøke eksitabilitet.
Abstract
Nervesystemet er sammensatt av et enormt utvalg av forskjellige neuronale typer. Disse nerve subpopulasjoner kjennetegnes av blant andre funksjoner, deres distinkte dendrittiske morfologi, deres spesifikke mønstre av aksonal tilkobling, og deres selektive skyte svar. De molekylære og cellulære mekanismene som er ansvarlig for disse sidene ved differensiering under utvikling er fortsatt dårlig forstått.
Her beskriver vi kombinerte protokoller for merking og karakterisere den strukturelle tilkobling og oppstemthet av kortikale nevroner. Endring av i utero electroporation (IUE) protokollen tillater merking av en glissen befolkning av nerveceller. Dette i sin tur gjør det mulig for identifisering og sporing av dendritter og aksoner av individuelle nevroner, den presise karakteriseringen av den laminære plasseringen av aksonale projeksjoner, og morfometrisk analyse. Iue kan også brukes til å undersøke forandringer i eksitabilitet avvilltype (WT) eller genmodifiserte nevroner ved å kombinere den med hel-celle opptak fra akutte skiver av electroporated hjerne. Disse to teknikker for å bidra til en bedre forståelse av koplingen av strukturell og funksjonell tilkobling og av de molekylære mekanismer som kontrollerer neuronal mangfold under utvikling. Disse utviklingsprosesser har viktige implikasjoner på aksonal ledninger, den funksjonelle mangfold av nerveceller, og biologi kognitive forstyrrelser.
Introduction
Utviklingen av dendrittiske strukturer og aksonal er en viktig del av kretsen regulering i nervesystemet, inkludert i hjernebarken. Det spiller en avgjørende rolle under den selektive kabling av de ulike nevrale delpopulasjoner. En rekke nyere rapporter har vist at i tillegg til tilkobling, blir den molekylære mangfoldet av nerveceller som reflekteres ved anskaffelse av svært spesifikke modi for avfyring. Imidlertid er de mekanismene som bestemmer oppstemthet og tilkobling av forskjellige nevrale subtyper under utvikling, samt deres grad av koordinering, fortsatt dårlig forstått ett, to.
In vivo taps og gain-of-funksjonsanalyser gir mulighet for å studere forholdet mellom ekspresjonsnivået av spesifikke gener og deres innflytelse på utviklingen av kretsen. I utero electroporation (IUE) er en teknikk mye brukt til å studerefunksjonen av et gen av interesse i spesifikke nevronale populasjoner og for å studere de samlede mønstre av sin tilkobling. Imidlertid, for å bestemme de morfologiske egenskapene av aksoner og dendritter i kortikale lag i levende mus, er det viktig å merke neuroner tynt. Et Cre rekombinasjon system kombinert med iue kan brukes til å markere en sparsom populasjon av nerveceller ved en tilstrekkelig lav tetthet til å løse fremspringene som sendes ut fra de enkelte celler av de identifiserte kortikale lamellene. Denne metoden etiketter et tilstrekkelig antall neuroner pr cortex for å oppnå kvantitative data etter analyse av rimelige mengder elektroporerte hjerne (figur 1). Dette manuskriptet presenterer en metode for slike fine analyse av tilkoblingsmuligheter. Den presenterer også en lignende strategi for å analysere, i egne eksperimenter, de elektriske egenskapene av nerveceller ved å utføre dagens-clamp opptak på grønn fluorescens protein (GFP) -electroporated celler fra akutte cortical skiver. disse protokoler er allsidig og kan anvendes i studiet av eksitabilitet og tilkobling av neuroner av WT og transgene dyr, og også av neuroner i hvilken tap og gevinster av funksjon er innført av ytterligere plasmider under iue.
Selv om denne protokollen beskriver electroporation av mus ved embryonale dag (E) 15.5, kan denne teknikken utføres når som helst alder mellom E9.5 tre og postnatal dag (P) 2 4. Mens electroporation på tidlige stadier rettet nevroner og forløpere til thalamus og dype lag av hjernebarken, senere stadium electroporation merkene mer overflatiske lag (f.eks E15.5 IUE mål lag II-III nevroner). I sammendrag, er kombinasjonen av iue med enkelt-celle morfologisk analyse og elektrofysiologi er et nyttig verktøy for å belyse de molekylære mekanismer som ligger til grunn for den enorme strukturell og funksjonell diversitet av neuroner i nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Madrid Animal Care og bruk Committee, i samsvar med nasjonal og europeisk lovgivning (Proex 118/14; Proex 331/15). Opprettholde sterile forhold under prosedyren.
1. I Utero Electroporation
MERK: Denne protokollen for IUE er tilpasset fra andre som tidligere har blitt publisert 5, 6, 7. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for iue av E15.5 embryoer, med modifikasjoner i reporteren strategi som tillater studiet av morfologien av enkle nevroner 8 og deres elektrofysiologiske egenskaper i et separat forsøk ved bruk av standard GFP rapportør plasmider.
- Klar DNA
- Forbered DNA plasmider ved hjelp av et endotoksin-free isolasjon kit i henhold til produsentens instruksjoner og fortynne dem i 1x phosphate-bufret saltvann (PBS).
- For enkeltcellemerking, fremstille 10 ul av DNA blanding pr kirurgi (1 ul pr embryo) ved hjelp av følgende konstruksjonene og sluttkonsentrasjoner: plasmid kodende for en fluorescerende protein reporter (f.eks CAG-DsRed2 9), 1 ug / ul som en kontroll for electroporation effektivitet; eksperimentell plasmid som skal testes, typisk ved 1 ug / ul; LoxP-stop-loxP-fluorescerende protein plasmid (CALNL-GFP 10), 1 mikrogram / mL; og bygge-koding Cre 10, 1-4 ng / mL. Tilsett 1 mL av 0,1% Fast Grønn i vann (vekt / volum) for å visualisere det injiserte DNA.
MERK: Cre rekombinasjon av GFP konstruksjonen forekommer bare i noen nevroner, som gjør det mulig for visualisering og ombygging av enkelte aksonal projeksjoner (Figur 1a). - For standard patch-clamp studier, forberede 10 mL av DNA blanding per kirurgi (1 mL per embryo) av de følgende plasmid som koder for en fluorescerende protein (f.eks CAG-GFP 11), 1 ug / ul som en reporter kontroll; eksperimentell plasmid, vanligvis 1 ug / ul; og 1 ul 0,1% Fast Grønn i vann (vekt / volum).
MERK: Dette er standard electroporation forhold som analyserer akutte skiver som inneholder et stort antall merkede eksitatoriske nevroner innenfor den ønskede lamina. For å utføre patch-clamp studier i enkeltceller, forberede DNA som beskrevet i trinn 1.1.1.1.
- For enkeltcellemerking, fremstille 10 ul av DNA blanding pr kirurgi (1 ul pr embryo) ved hjelp av følgende konstruksjonene og sluttkonsentrasjoner: plasmid kodende for en fluorescerende protein reporter (f.eks CAG-DsRed2 9), 1 ug / ul som en kontroll for electroporation effektivitet; eksperimentell plasmid som skal testes, typisk ved 1 ug / ul; LoxP-stop-loxP-fluorescerende protein plasmid (CALNL-GFP 10), 1 mikrogram / mL; og bygge-koding Cre 10, 1-4 ng / mL. Tilsett 1 mL av 0,1% Fast Grønn i vann (vekt / volum) for å visualisere det injiserte DNA.
- Forbered DNA plasmider ved hjelp av et endotoksin-free isolasjon kit i henhold til produsentens instruksjoner og fortynne dem i 1x phosphate-bufret saltvann (PBS).
2. Forberedelse til kirurgi
- Utfør en overlevelse kirurgi ved hjelp av aseptiske prosedyrer. Sikre sterile forhold, blant annet masker, hansker, instrumenter og kirurgiske feltet. Sterilisere kirurgiske instrumenter (skalpell, Adson tang, herdet gode saks, buede saks, Dumont tang, og nål holder).
- Velg borsilikatglass kapillærer på 1 / 0,58 mm ytre / indre diameter. trekk hettenillaries tre. Mål for en optimal tips lengde på 1 cm etter å ha holdt. Skjær nålespissen på ca 30 ° vinkel ved hjelp av fine tang (Figur 1b).
- Forbered 500 ml sterilt isotonisk oppløsning (1 x PBS eller Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)). Legg penicillin-streptomycin 1: 100, og varme denne oppløsning til 37 ° C. Det kan lagres ved 4 ° C etter operasjonen.
- Subkutant injisere en preoperativ dose av smertestillende midler (f.eks, karprofen, 5 mg / kg kroppsvekt).
- Hold dyrene varme for kirurgi ved å plassere dem på en varmepute. Varm en ren bur til 37 ° C for postoperative utvinning.
3. Surgery
- Anesthetize en C57BL / 6 E15.5 gravid mus med isofluran. Først sette et lukket kammer med 3% isofluran på 0,8 l / min oksygen og forlate musen inne til den er i hvilemodus. Overfør musen til en varmepute og plasser nese og munn i en maske for å leverey av isofluran. Gradvis avta anestesi i løpet av operasjonen til 1,5% isofluran via maske. Bekreft riktig anesthetization ved å observere et tap av pedalen refleks (tå klype). Den optimale fremgangsmåten tar omtrent 20 minutter og ikke mer enn 45 min.
- Påfør øye salve for å hindre at øynene tørker under prosedyren.
- Fjern hår fra et ~ 3 cm region av magen (enten ved hjelp av en elektrisk barbermaskin eller Hårfjerningskrem). Vask den kirurgiske området med bomullspinner infused med 70% etanol, etterfulgt av en jod-tilført bomullspinne. Gjenta tre ganger.
- Dekk den kirurgiske området med steril kompress for å hindre infeksjoner.
- Bruk skalpell for å lage en vertikal åpning gjennom huden 2 cm lang og parallelt med midtlinjen. Skill hud og muskel av magen med butte buede saks. Hold muskelen med tang og klippe det gjennom linea alba å avsløre bukhulen.
- Finn embryoene med hjelp of pinsett. Fukte to våte bomullspinner med steril saltoppløsning fremstilt i trinn 2.3 og bruke dem til å manipulere en rullestol embryo ut av åpningen. Plasser bomullspinner rundt embryoet og forsiktig trekke både livmor horn fra bukhulen. Hold embryoene og åpnet bukhulen hydrert med varmt saltvann gjennom hele prosedyren for å hindre dem fra å tørke ut.
4. Injeksjon av DNA og Electroporation
- Manipulere embryoene forsiktig med fingrene for å finne telencephalon (kan tydelig visualisert ved øyet som de to fremre vesikler i hjernen). Plasser en forberedt borosilikat kapillær i en munn pipette. Passerer spissen av nålen gjennom livmoren, å unngå blodårer, inntil den når en lateral ventrikkel. Sakte injisere ca 1 mL av Fast Green-farget DNA løsning til en stor blå flekk er observert.
- Plasser 7 mm platinaelektroder lateralt på the hodet av embryoet (figur 1C).
MERK: DNA er negativt ladet; Derfor beveger den mot den positive elektrode når spenning påtrykkes mellom platinaelektroder. Ved å variere plasseringen av elektrodene, kan forskjellige områder av hjernen være målrettet. - Påfør spenning via platinaelektroder (for E15.5 embryoer:. 5 pulser, 38 V, 50 ms intervall sykluslengden, 950 ms intervall pause Disse forholdene varierer avhengig av utviklingsstadiet) 12.
MERK: Se tabell 1 for spenningsforhold og elektroder for ulike embryo stadier. - Gjenta trinn 04.01 til 04.03 for hvert embryo.
5. Slutten av kirurgi og etter operasjonen
- Bruk bomullspinner for å manipulere livmoren tilbake til moren. Fylle bukhulen med den varme saltoppløsning (tilsett ca. 2 ml).
- Suturer muskelen med enkle avbrutte sting eller en kontinuerlig sting. Bruk # 6-0 suturs.
- Bruk stifter å lukke ekstern såret. Vær nøye med å skille huden fra muskelen før stifting. Ta av nesemaske.
- La musen til å gjenopprette i 30 minutter i det oppvarmede, rent bur før du plasserer det i dyre anlegget rommet. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke plasser et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Overvåke dyret under dagene etter operasjonen. Påfør analgetika subkutant (carprofen, 5 mg / kg kroppsvekt) hver 12. time for 2 dager eller etter dyr lovgivning. Ingen ekstra postoperativ omsorg er nødvendig for valpene.
6. Utarbeidelse og analyse av prøvene
- Valgfritt: På P2, sjekk for uttrykket av fluorescens i electroporated unger som bruker en fluorescerende mikroskop; når IUE er vellykket, kan fluorescens tydelig sees in hodet 13. Merk eller skille mus som er positivt electroporated for bruk i følgende trinn. Hold dam og valper i standard dyr anlegg forhold.
- På den ønskede fasen av studien, perfuse musene transcardially. Vanligvis er det mest aktive fasen av dendrittisk og aksonal vekst svarer til de tre første ukene etter fødselen 2, 14, 15.
- Forbered 30 ml 4% paraformaldehyde (PFA) i 1x PBS per mus og chill det på is.
FORSIKTIG: PFA er et kjent allergen og kreftfremkallende. Det er giftig. Bruk egnet personlig verneutstyr.
MERK: Mengden av PFA som trengs avhenger av alder av musen (f.eks for P16, 20 ml for perfusjon og 10 ml for postfixation er nødvendig). - Fremstille en ketamin-xylazin blanding for å bedøve dyret med en 1: 1: 8 volumforhold på 100 mikrogram / ml ketamin: 100 ug / ml xylazine: PBS (forberede rundt 0,2 ml per mus).
- Anesthetize musen ved intraperitoneal injeksjon av 0,2 ml av blandingen fremstilt i trinn 6.2.2.
- Plasser bedøvet musen på ryggen. Lag en horisontal snitt over brystkassen ved hjelp av en skalpell. Skjær muskel og membranen med fine saks til hjertet kan observeres.
- Lag et snitt i høyre atrium med fine saks. Sakte injisere 20 ml PBS i venstre ventrikkel med en 25 gauge nål for å fjerne blodet. Injisere 20 ml PFA (trinn 6.2.1) til musen er stiv og organene blir hvite.
- Fjern omgå hodet og lage en midtlinjen snitt i huden fra halsen til skallen. Forsiktig skrelle bort skallen bruker buede tang og trekke hjernen. Vis forsiktighet for ikke å punktere eller skade hjernen under fjerning av skallen. Sette hjernen i 10 ml 4% PFA ved 4 ° C over natten for å postfiks den.
- Forbered 30 ml 4% paraformaldehyde (PFA) i 1x PBS per mus og chill det på is.
- Cryoprotect fast hjerne i 10 ml 30% sukrose i PBS ved 4 ° C i 1 - 2 dager, før de synker. Forbered en cm 3 aluminiumsfolie kuber. Fyll kuber 2/3 av veien med oktober Sett hjernen inne og fryse dem ved å sette kuber på tørris. Oppbevar frosne hjernen ved -80 ° C.
- Sted dråpe oktober på overflaten av prøveplaten, skrelle folien fra histologi kuben, og posisjonere kuben i den ønskede orientering til prøven disk på toppen av væsken oktober Påfør fast trykk til det er løst. Sett prøveplaten inn i prøvehodet av kryostaten. Orientere prøven (flytte den inn i en gunstig stilling i forhold til kniven / bladet).
- § hjernen på cryostat. Velg 50-100 mikrometer tykke flytende frysesnitt 16 med en fin pensel og plassere dem i PBS.
- Flekk hvis ønskelig.
MERK: For studiet av aksonal morfologi, farging med en GFP antistoff anbefales sterkt- Sperre delene i 1 time ved romtemperatur med 5% føtalt bovint serum i PBS inneholdende 0,5% Triton-X 100 (blokkeringsløsning). Inkuber over natten ved 4 ° C med 1: 500 primært antistoff (for eksempel kanin anti-GFP) fortynnet i blokkeringsløsning.
- Vask seksjonene tre ganger i PBS. Tilsett 1: 500 sekundært antistoff (som geite-anti-kanin-Alexa Fluor 488) fortynnet i blokkeringsløsning og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask seksjonene tre ganger i PBS.
- Counterstain med DAPI (1: 10000) i PBS inneholdende 0,5% Triton-X-100 i 10 min. Skyll delene med PBS. Monter delene i en vandig monteringsmedium 16.
7. Imaging and Analysis
- Fluorescens eller konfokalmikroskopi
- For å rekonstruere fullstendig nerveceller, erverve bilder med høy forstørrelse (minst 40X) og høy oppløsning (minimum 1024 x 1024). Velg "Tile scan "eller tilsvarende alternativ i anskaffelsesprogrammet for å dekke området av interesse, som spenner over alle dendritter og aksonal prosesser. Anskaffe et tilstrekkelig antall stabler på z-aksen for å unngå tap av informasjon.
MERK: Vanligvis har mikroskop programvare en "optimalisert stack" alternativet, men hvis dette ikke er tilfelle, test manuelt for å finne ut hvor mange tiltak som er nødvendige for at bildene skal overlappe for å riktig definere individuelle projeksjoner. To viktige parametere er pinhole og målet; ta hensyn til "høyere forstørrelse, mer oppløsning, og flere nødvendige z-trinn."
- For å rekonstruere fullstendig nerveceller, erverve bilder med høy forstørrelse (minst 40X) og høy oppløsning (minimum 1024 x 1024). Velg "Tile scan "eller tilsvarende alternativ i anskaffelsesprogrammet for å dekke området av interesse, som spenner over alle dendritter og aksonal prosesser. Anskaffe et tilstrekkelig antall stabler på z-aksen for å unngå tap av informasjon.
- Analyse
MERK: Selv om flere parametere kan analyseres, trinn 7.2.1 fokuserer på to: dendrite morfologi og axon forgrening. Last ned Fiji ( http://fiji.sc/ ).- Åpne bildet, velg "segmentert line" fra menyen. Tegn en linje (flytte opp og ned langs the z-aksen ved å rulle muse) etter strukturen i nervecellen. Gå til "Analyser, Verktøy, ROI Manager Add" (alternativt trykk "t") for å lagre linjen. Gjenta denne prosessen for hver axon eller dendrite av de analyserte neuron to.
- I ROI Manager-menyen trykker du på "Mål" -knappen for å få lengden (eller flere parametere). Eksportere målingene til en tekstfil eller regneark for å analysere dem.
8. Elektro
MERK: Målet med denne protokollen er å oppnå hel-celle strøm-klemme opptak fra lag II / III pyramidale celle nevroner identifisert visuelt av GFP uttrykk i GFP-electroporated mus hjernen (eller noen annen fluorescerende protein tidligere electroporated). Det er en tilpasning av tidligere publiserte metoder 17, 18. Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å studere virkningen av en genetisk modification introdusert av IUE på de elektriske egenskapene til nervecellen. Oppkjøpet av spesifikke skytemoduser er en gradvis prosess med differensiering som involverer den dynamiske uttrykk for et bredt repertoar av ionekanaler og som resulterer i uttrykket av forbigående skytemoduser før sent postnatal stadier. For eksempel er modne elektriske responser ikke observert i sjiktet II / III av mus somatosensory cortex før P16 2, 19.
- Forutsetninger for de akutte skiver
- Forbered sterile kirurgi for å fjerne hjernen fra mus: en giljotin, for å fjerne hodet; liten saks, for å skjære gjennom skallen; tang, for å skille skallen fra vev; en slikkepott, til delikat fjerne hjernevev fra sin ermet; en metallisk slicer, å dissekere cortex i to like halvdeler; og en Pasteur-pipette, for å flytte skiver fra vibratome (plassere dem i en løsning inneholdende kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for inspeksjon, og deretter overføre skivene fra ACSF til en inkubasjon holde området).
- Fremstille 1 liter av ACSF ved hjelp av vann av høy renhet (dobbeltdestillert vann) inneholdende 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 og 1 mM NaH 2PO 4. Titrere pH til 7,3 til 7,4 med HCl eller NaOH. Juster osmolaritet til 290 mOsm.
- Boble ACSF med karbogen (95% O2 / 5% CO2) i 15 - 20 min ved hjelp av Teflon-rør (~ 1 mm), for å stabilisere pH-verdien til 7,3 til 7,4.
- Fryse 200 ml ACSF oppløsning mettet med karbogen ved -80 ° C i 10 - 15 minutter for å generere en kramme disseksjon løsning. Plasser en 100- x 20 mm vev kultur tallerken på is for å ha klippet hjernen.
- Fremstille 100 ml av 1% lavt smeltepunkt agarose løsning like før starten av forsøket. Avkjøl løsningen, klippe ut en firkantet stykke agarose (dimensjoner: 1 x 1 x 0,5 mm), og superlim det tilbaksiden av plattformen, rett bak hvor hjernen er skiver (agarosegel gir støtte til hjernen under kutting). Gjør fronten så flat som mulig.
- Innhenting akutte skiver
- Immobilisere musen og bedøve den med isofluran 2%. Plasser hodet inn i giljotinen åpning og halshogge det raskt. Fjern skallen så fort som mulig med bruk av bein rangers eller fin pinsett. Sett hjernen i avkjølt ACSF.
MERK: Det er viktig å utføre dette trinnet raskt. - Sett hjernen i kjølt kultur parabolen. Klipp av lillehjernen med liten saks.
- Plukk opp hjernen med en slikkepott og tørk det tørt på et papirhåndkle.
- Lim ventrocaudal planet av hjernen på en vibratome holder. Plasser holderen på en vibratome fylt med iskald ACSF.
- Skaff akutte skiver ved å kutte 300 mikrometer koronale seksjoner (sikre fortsatt carbogenation hele prosedyren, for eksempel plassere en bubbler (1 mmpolytetrafluoretylen rør) i vibratome kammer) ved hjelp av følgende vibratome innstillinger: 0,06 mm amplitude og 0,08 til 0,10 mm / s hastighet. Sett videre til lavest mulig hastighet (~ 22 s per pass). Endre disse optimale innstillingene og få optimale forhold for hver maskin empirisk om nødvendig.
- Inkuber akutte skiver i minst 60 minutter i ACSF supplert med 3 mM myo-Inositol, 0,4 mM askorbinsyre, og 2 mM natriumpyruvat, mens bobling med 95% O2 / 5% CO2 gass. Holde temperaturen på 25 ° C.
- Utføre skjæreprosedyren i mindre enn 15 min. Om ønsket, kan skivene lagres for 1 - 7 timer før den ble overført til registreringskammeret for bruk.
- Immobilisere musen og bedøve den med isofluran 2%. Plasser hodet inn i giljotinen åpning og halshogge det raskt. Fjern skallen så fort som mulig med bruk av bein rangers eller fin pinsett. Sett hjernen i avkjølt ACSF.
- Forutsetninger for hel-celle innspilling
- Kontroller at elektro stasjonen er utstyrt med et opptak kammer, en perfusjon system, et mikroskop, elektroder (opptak, stimulerende, og bakken), makro- og micromanipulators, en stiv vibrasjonssikker table-top og Faraday-bur, en stimulator, en forsterker og analog-til-digital (A / D) omformer, en datamaskin med anskaffelse programvare, og et GFP (eller en hvilken som helst annen fluorokrom) filter for å analysere genmodifiserte neuroner 18 (figur 2A).
- Fremstille den intracellulære løsning, inneholdende 115 mM kaliumglukonat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na to ATP, og 0,3 mM Na-3-GTP, justert til pH 7,2 med KOH, og til 290 mOsm ved KCl.
- Gjør patch pipetter ved å trekke borsilikatglass kapillærer. Forbered patch elektroder med en mikropipette avtrekker. Bruk borsilikat kapillærer (1,5 mm ytre diameter, 0,86 mm indre diameter, 10 cm lengde). Gjør patch elektroder viser motstander av 3-10 Megohm når de er fylt med intracellulære løsning.
- Perfuse opptakskammeret med ACSF med en hastighet på 2 ml / min. Opprettholde temperaturen i kammeret ved approximbart 33 ° C.
- Hel-celle innspilling
- Overfør skivene i innspillingen kammeret ved hjelp av en Pasteur pipette (avskåret lang spiss) eller en liten børste. Hold nede skive med en harpe. Perfuse skiver stadig med ACSF med en hastighet på 2 ml / min.
- Patch en GFP-positive nevroner.
- Sett skive i innspillingen kammeret og finne arealet av interesse gjennom mikroskopet ved lav forstørrelse (10x). Deretter finne en GFP-positive celle å lappe med 60x objektiv.
- Fyll innspillingen elektroden med intracellulære løsning. Bruk sprøyte koblet til filteret (4-mm filter) og mikro-lasteren spiss for å fylle opptaks elektrode med intracellulær løsning.
- Plasser glass pipette i pipetten holderen. Sett pipettespissen i badekaret og fokus på spissen. Når pipetten er i badekaret, anvende positivt trykk gjennom den bakre trykkreguleringssystemet.
- Patch et nevron som er fluorescerende (Figure 2B).
- Approach cellen av interesse i henhold til visuell veiledning og samtidig opprettholde mottrykket i pipetten. Dersom det forekommer en liten fordypning på celleoverflaten, slippe ut trykket. På dette punktet, kan en tett forsegling (motstand større enn en GΩ) bli dannet. Ellers gjelder et lett undertrykk (sug) for å legge til rette for det.
- Mens forseglingen dannes, bringe holdespenningsklemmen til -60 mV. Når GΩ forseglingen er dannet, bruke en puls med sug for å sprekke cellemembranen under pipette og gå inn i hel-celle-modus. Se referanse 20 for mer informasjon.
- Spill aktiviteten ved å bruke strøm-klemme forhold 21. En gang i hel-celle-modus, bytter fra spennings klemme til strøm klemme modus og starte innspillingen. For eksempel, for å spille inn celleeksiterbarhet, gjelder 500 ms-lang depolariserende aktuelle injeksjoner (100-400 PA).
- Beregn avfyring priser by plotte antall handlingspotensialer langs toget for å øke inngangsstrømmer.
MERK: hvilemembranpotensialet, inngang motstand, og membran kapasitans kan også beregnes fra opptakene 21.
- Beregn avfyring priser by plotte antall handlingspotensialer langs toget for å øke inngangsstrømmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å karakterisere de morfologiske endringer av nerveceller i detalj og hele utvikling, er det viktig å merke nevroner tynt. En Cre-rekombinase utvannet systemet tillater for uttrykket av et gen av interesse i en glissen bestand av nerveceller, slik at bare de nevroner som inneholder dette enzymet uttrykker GFP (figur 1A). Ved hjelp av denne strategien, er laget II-III målrettet og merket av IUE på E15.5. CAG-DsRed2 på 1 pg / mL, er co-electroporated som en kontroll og å identifisere positive electroporated hjerne i levende dyr. Viktigere, etter farging med anti-GFP-antistoff, er det signal sterk nok til å tillate den klare visualisering av de dendrittiske morfologi og aksoner (figur 1D og E).
Etter iue og elektrofysiologi, er analyse av parameterne som oppnås fra hel-celle-opptak som brukes til å coMpare avfyrings svar og oppstemthet av electroporated celler under forskjellige forhold. Flere parametere kan oppnås. Parametrene bør tilpasses til den spesielle undersøkelse ved hjelp av spesifikk patch-clamp-analyse-programvare. Figur 2C gir et eksempel på tomten av aksjonspotensialer mot inngangsstrømmen hentet fra opptak av en WT lag II-III nervecellen som ble electroporated på E15.5.
Figur 1. En Cre-rekombinase Utvannet Strategi Aktiverer Sparse Merking av kortikale nevroner. A. Skjematisk oppsummering av strategien. I neuroner som bærer både CALNL-GFP og CRE, er loxP-STOP-loxP kassett skåret ut av CALNL-GFP, og GFP er uttrykt ved den sterke CAG promoter. B. Skjematisk tegning av en borosilikat kapillær trekkes ved hjelp av en mikropipette avtrekker. Spissen er kuttet av forceps, skaper en 30 ° vinkel. Mål 1 cm fra spissen til begynnelsen av den smalere del av kapillaren. C. Plassering av elektrodene for å målrette den somatosensoriske cortex. De platinaelektroder er plassert omtrent over ørene til embryoet. På grunn av sin negative ladning, går DNA mot den positive elektrode når spenningen påføres. Variasjon i den stilling av elektrodene tillater målretting forskjellige hjerneområder. D. Images oppnådd etter vektorer ble levert til lags II-III nevroner etter in utero electroporation på embryonale dag 15,5; koronale snitt ble gjort ved postnatal dag 16. CAG-DsRed2 vektor ble kotransfektert som en kontroll (til venstre). GFP (midten) uttrykkes bare i de nevroner som også innlemmet Cre at rekombinasjon av loxP nettsteder i CALNL-GFP vektor. Sparsom merking gjør at enkelte nerveceller skal skilles (pilspisser). E. Høy forstørrelse confocal bilde av than dendrittiske lysthus av en annen spredt merket GFP neuron. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. elektro Innstillinger og Eksempel på en Firing Response. A. Foto viser elektro oppsett brukes for patch clamp eksperimenter i akutte skiver. Oppsettet er inkludert i et Faraday-bur for å eliminere støy, og utstyret er på toppen av en anti-vibrasjonsbord. Kontrollere av motoriserte micromanipulators for elektrodene er observert på venstre side. B. Pyramideformet nevron med musen electroporated med GFP, observert i sterkt felt og grønne fluorescens forhold. Opptaket pipette festet til en GFP + celle er merkbar. Scale bar = 10 & #181; m. C. Firing mønstre av et CAG-GFP electroporated Brems II-III nervecellen som viser typiske vanlige-spiking respons. Fordelingen av aksjonspotensialer er tilnærmet lik en regelmessig fordeling langs varigheten av inngangsstrømmen (X-aksen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Scene | Spenning | elektroder | Referanser |
| E9.5 | 7 V, 100 ms, 3 pulser | Hold deg platinaelektroder | Matsui et al. 2011 3 |
| E12.5 | 30 V, 50 ms, 3 - 5 pulser | Tang-type elektroder 3 mm | Saito, T., 2006 12 | </ Tr>
| E15.5 | 35-48 V, 50 ms, 5 pulser | Tang-type elektroder 5-7 mm | Rodriguez-Tornos et al. 2016 2, Saito, T., 2006 12 |
| P2 | 100 V, 50 ms, 5 pulser | Tang-type elektroder 5-7 mm | Sonego et al. 2013 4 |
Tabell 1: Spennings betingelser og Elektroder for Electroporation av embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du merke nevroner av somatosensoriske cortex av C75BL / 6 mus for å analysere sine tilkoblingsmuligheter og deres oppstemthet. Med hensyn til eksisterende metoder, synliggjør det diskriminerende aspekter ved tilkobling, slik som antallet aksonal grener pr neuron, deres presise topografi, og deres anatomisk lokalisering. Ved å endre posisjonen av elektrodene, er det mulig å målrette andre nervepopulasjoner, som cingulate cortex (beholde den samme vinkel mellom elektrodene og hjernen, men endre retningen av polene) eller hippocampus 5, og foreta tilsvar eksperimenter merking enkelte nevroner eller bredere befolkningsgrupper, avhengig av ønsket strategi. Det er imidlertid begrensninger i denne, som ikke alle populasjoner er like tilgjengelig eller like selektivt merket. For eksempel, i hippocampus, er det mulig å selektivt målrette sen-born neuroner fra CA1 regionen, men early electroporation markerer heterogene populasjoner av indre og ytre pyramidale celler. I hjernebarken, blir neuroner født på en sekvensiell måte, slik at drektighets dag under iue bestemmer hvilken kortikalsjiktet påvirkes. Utføre tidligere IUE mål dypere nevroner (f.eks IUE på E14 etiketter lag IV nevroner) 22.
For en vellykket IUE, anbefales det å ta hensyn til visse hensyn. For det første er det viktig å gjøre operasjonen i løpet av mindre enn 30 minutter, for å redusere belastningen på mor og å øke sjansene for overlevelse av valpene. For det andre, den vanskeligste delen av fremgangsmåten er injeksjonen av DNA-utføre injeksjonen via borsilikat kapillærene så skånsomt som mulig. Dersom embryoene presses for hardt, kan de bli skadet. Når det gjelder feilsøking død embryoene under DNA-injeksjoner, skråtsnitt over normalsnitt tuppen med en 30 ° vinkel kan øke effekten av denne prosessen. Hvis en beveller er ikke tilgjengelig og kapillærene er kuttet utelukkende med tang, kan riktig vinkel bekreftes dissekere mikroskop. Kast utilstrekkelig kapillærer. Endelig tilpasse electroporation forholdene til stadiet av embryoet er viktig for å øke overlevelsesraten (se tabell 1).
Noen betraktninger er nødvendig med hensyn til gjenoppbygging av aksoner og dendritter. For å markere de enkelte neuroner, den riktige konsentrasjon av Cre plasmidet er avgjørende for å oppnå en god, sparsom ekspresjon og for å unngå den forvirrende overlapping av neuronal anslag som tilhører ulike nerveceller. Selv om denne protokollen foreslår anvendelse av 4 ng / ul, kan det være nødvendig å justere plasmidet konsentrasjonen for hvert eksperiment, avhengig av promoteren som brukes, kvaliteten av DNA-preparat, og fremgangsmåten for DNA-kvantifisering (for eksempel redusere den til 2 ng / mL om merking for mange nevroner). i additipå, for aksonal sporing, er det viktig å skjære ved en passende vinkel for å ha hele neuron i samme plan.
Kritiske trinn for vellykket patch-clamp opptak er helsen til vevet av de akutte skiver og plassering og overflod av electroporated GFP-positive nevroner. Hvis patching trinnene mislykkes eller avvikende svar er funnet under opptakene, redusere tiden for behandling av akutte skiver. Dersom GFP neuroner er vanskelig å identifisere og lokalisere på grunn av deres reduserte tall i den akutte skive, sikre at tilstrekkelig CAG-GFP plasmid er inkludert i blandingen electroporation. Med hensyn til de største begrensningene tilnærminger som er beskrevet her, gjør det mulig for patch-clamp teknikk opptak av mange forskjellige parametere som beskriver eksitabilitet av nervecellen, men det trenger ikke å evaluere forhold som er avhengig av hele kretsen. Også, og som nevnt ovenfor, ikke alle nerve subpopulasjoner er tilgjengelig gjennom IUE. I sammendraget, i the fremtiden, kan disse teknikkene bidra til en videre analyse av den strukturelle og funksjonelle tilkobling av forskjellige neuronale subpopulasjoner i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for R. Gutiérrez og A. Morales for deres utmerkede teknisk assistanse og til LA Weiss for redigering. CN er finansiert av den spanske Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra BBVA Foundation og SAF2014-58598-JIN (MINECO) til M. Navarrete og ved en bevilgning fra Ramón Areces Foundation og tilskudd SAF2014-52119-R og BFU2014-55738-REDT (fra MINECO) til M. Nieto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Scalpel Handle # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Adson Forceps-Serrated - Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Hardened Fine Scissors - Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14.5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Thin curved tips - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Needle Holder - Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 | |
| Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 | |
| Borosilicate glass capillaries (100 mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | - | |
| Needle 25 G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope for Fluorescent Imaging - MZ10F | Leica | - | |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | - | |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | - | |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | - | |
| Cryostat - CM 1950 | Leica | - | |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | - | |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A | |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Air Table | Newport | - | |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | - |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
