Summary
We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.
Abstract
-Perfusie gebaseerde eilandje-isolatie protocollen van grote zoogdieren pancreata zijn goed ingeburgerd. Dergelijke protocollen worden gemakkelijk uitgevoerd in vele laboratoria vanwege de grote omvang van de ductus pancreaticus die het mogelijk maakt om collagenase injectie en daaropvolgende weefselperfusie. Daarentegen eilandje isolatie van kleine pancreata, zoals die van pasgeboren muizen is uitdaging omdat perfusie is niet gemakkelijk verkrijgbaar in de kleine pancreata. Hier kunt u een gedetailleerde eenvoudige procedure die aanzienlijke aantallen eilandjes van pasgeboren muizen met visuele hulp herstelt beschrijven we. Vers ontleed gehele pancreata werden gedigereerd met 0,5 mg / ml collagenase IV opgelost in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) bij 37 ° C, in microcentrifugebuizen. Buizen werden regelmatig afgeluisterd om weefsel verspreiding te helpen. Wanneer de meeste van het weefsel werd gedispergeerd kleine clusters ongeveer 1 mm, werden lysaten 3:57 maal met kweekmedium gewassen met 10% foetaal runderserum (FBS). Islet clusters,verstoken van herkenbare acinar weefsels, kan vervolgens worden teruggewonnen onder ontleden stereoscoop. Deze methode herstelt 20-80 kleine tot grote eilandjes per pancreas van pasgeboren muizen. Deze eilandjes zijn geschikt voor de meeste denkbaar downstream assays, waaronder insuline secretie, genexpressie en cultuur. Een voorbeeld van insulinesecretie assay wordt aan de isolatie te valideren. De genetische achtergrond en de mate van vertering de grootste factoren die de opbrengst. Vers gemaakte collagenase oplossing met een hoge activiteit heeft de voorkeur, aangezien het helpt bij endocriene exocriene isolatie. De aanwezigheid van kationen [calcium (Ca2 +) en magnesium (Mg2 +)] in alle oplossingen en foetaal runderserum in de was / picking media nodig zijn voor een goed rendement eilandjes met goede integriteit. Een ontleden scope met een goed contrast en vergroting zal ook helpen.
Protocol
Dierlijk gebruik volgt de in protocol M procedures / 11/181 van de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite voor Gu goedgekeurd. CD1 of CBA / Bl6 muizen werden gekocht bij commerciële leveranciers en in de Vanderbilt dier faciliteit gekruist met pasgeboren muizen te verkrijgen.
1. Bereiding van Muizen, Stock Solutions en Equipment
- Voor de muis kruis: het opzetten van een muis kruis en noteer de inpluggen data om de experimentele planning te helpen. CD1 muizen meestal bevallen rond dag 19 na de paring. Gebruik CD1 of CBA / Bl6 kruist om CD1 of CBA / Bl6 pasgeborenen te verkrijgen, respectievelijk. Kruisingen tussen de twee lijnen te gebruiken CD1 vrouwtjes en CBA / Bl6 mannetjes.
- Voor de collagenase voorraad: weeg 200 mg collagenase type IV met een hoge precisie balans. Over te dragen aan een 50 ml centrifugebuis. Los op in 40 ml HBSS met Ca2 + / Mg2 + (1,26 en 0,5 mM, respectievelijk) een 5 mg / ml voorraadoplossing te maken.
- Laat collagenase aanontbinden gedurende ~ 30 min met zacht schudden. Aliquot en bewaar de oplossing bevroren -20 ° C als voorraad, die actief blijft gedurende ten minste één jaar.
- Autoclaaf meerdere paren pincetten, scharen en P20 tips steriliseren dissectie en eilandje plukken.
- Voor de 1 M glucose voorraad: weeg 9 g glucose in een 50 ml centrifugebuis, voeg 50 ml RPMI 1640 medium met glucose lossen. Laat van 4 ° C tot gebruik, maar niet meer dan 6 maanden.
2. Werken Solutions
LET OP: De dag van het eilandje isolatie, de voorbereiding van de volgende reagentia.
- Voor het type collagenase IV werkende oplossing: dooi en verdun collagenase voorraad op ijs. Verdeel 0,15 ml bouillon in elk 1,7 ml microfugebuis. Voeg 1,35 ml HBSS met Ca 2+ / Mg 2+. Keer de buis 5 keer. Laat op ijs gedurende 15 min.
- Spin op hoge snelheid gedurende 3 minuten in een microcentrifuge. Transfer supernatant naar een nieuwe buis. Laat op ijs tot gebruik. Gooi de buis met onoplosbare puin.
- Voor de volledige RPMI 1640 media: voeg 2,5 ml 1 M glucose, 50 ml hitte-geïnactiveerd FBS en 5 ml 100x Pen-Strep voorraad in 500 ml RPMI 1640 media. Laat op ijs tot gebruik.
3. Pancreas Isolatie en de spijsvertering
- Euthanaseren pasgeborenen met isofluraan, gevolgd door onthoofding volgens de goedgekeurde protocollen.
- Leg de muis met zijn buik naar boven. Spray met 70% ethanol voor sterilisatie.
- Til het beenvlies met een pincet en snijd de huid en spierlagen lengterichting langs de middellijn met een schaar, uit het genitale gebied de ribbenkast. Dit opent de buikholte om alle interne organen bloot te leggen.
- Transfer alle inwendige organen een 100 cm schotel met een pincet. Zoek de pancreas, hetgeen een verspreide orgel met een dorsale gedeelte dat vast aan de maag en milt en ventrale gedeelte dat vast aan de twaalfvingerige darm 11. Voeg HBSS in de schaal om de organen onder te dompelen. In oplossing, de pancreas weefsels niet meer vast aan de twaalfvingerige darm, maag en milt. Het is gemakkelijk herkenbaar onder een dissectie scope vanwege zijn typische witte kleur. Gebruik een pincet om weg te komen uit de omliggende weefsel en de overdracht schil de pancreas weefsel om een nieuwe 60 mm schotel met HBSS.
- Snijd elke alvleesklier met een schaar in stukken kleiner dan 5 mm tegenover elke dimensies. Verwijzing naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Tot vijf pancreata (jonger dan P7) worden gedigereerd in een buis. Voor P8-P16 muizen, gebruiken één buis per alvleesklier.
- Voeg 0,5-1 ml collagenase werkende oplossing aan elke buis (0,2 ml per P1-P7 pancreas Gebruik 0,5 ml per P8-P16 pancreas.). Laat de buis in een 37 ° C incubator gedurende maximaal 15 minuten. Omkeren van de buis twee keer per min.
- Na ~ 5 min, tikt u op de buis naar de vertering status van de pancreas weefsel te controleren. Ga door het verteringsproces tot het grootste deel van de pancreasweefsel verschijnt als gefragmenteerd cel clusters, met een diameter van <2 mm. Het lysaat wordt troebel, wat te wijten is aan normale acinaire cel autolyse verschijnen.
4. Lysate Wassen
- Spin het lysaat bij 500 g gedurende 10 s in een microcentrifuge. Verwijder de bovendrijvende laag met een P1,000 Pipetman. De bovenstaande vloeistof moet verschijnen troebel, maar verstoken van de cel clusters. Gebruik geen aspiratie, die snel weg kunnen zuigen het weefsel fragmenten onderaan vanwege de aanwezigheid van enkele kleverige DNA.
- Voeg 1 ml RPMI 1640 compleet medium. Tik op de buis voorzichtig om de gefragmenteerde lysaat mengen. Te keren op en neer 10 keer. Herhaal stap 4.1.
- Herhaal stap 4.2 nog twee keer of totdat de bovenstaande blijkt duidelijk. Resuspendeer gewassen alvleesklier fragmenten in 1 ml compleet RPMI 1640 media.
5. Islet Isolatie
Opmerking: Voor kleine aantallen pancreata, directe hand oppakken zoals hieronder (5,1) kan worden gebruikt voor eilandje isolatie. Voor grote aantallen pancreata (> 6), de in 5,2 werkwijze heeft de voorkeur.
- Direct de hand-picking:
- Transfer lysaat uit stap 4.3 op een 60 mm schaal. Voeg 5 ml compleet RPMI 1640 media. Breng onder een dissectie microscoop.
- Stel de helderveld verlichting op de microscoop. Pas de lichtintensiteit tot ~ 50% van het maximale vermogen. Onder deze voorwaarde, eilandjes verschijnen als lichtroze clusters, terwijl acinaire cellen zo donker onregelmatig gevormde clusters (Figuur 1A). Een vergroting van ~ 50X (het combineren van de kracht van de doelstelling en het oog stuk) wordt aanbevolen om de beste manier van visualiseren eilandjes en de pipet tip opening gelijktijdig voor het plukken bieden.
- Pick-up eilandjes met een P20 pipet tip terwijl het vermijden van acinar clusters. Verdeel eilandjes-verrijkte fracties in nieuw 60 mm schaal met RPMI compleet medium (Figuur 1B).
- Herhaal de hand picking-proces nog twee keer. Laat pure eilandjes in een nieuw 60mm schotel met 4 ml compleet RPMI media (figuur 1C).
- Gradiënt centrifugeren:
- Bereid een 15 ml centrifugebuis dat is voorgeladen met 2 ml polysucrose en natrium diatrizoaat met een dichtheid van 1,077 g / ml. Laat de buis op ijs tot gebruik.
- Breng de suspensie van stap 4.3 op de bovenkant van de polysucrose en natrium diatrizoaat oplossing met een Pasteur pipet. Niet storen de onderste laag. Weefsels van maximaal 10 pasgeboren of 2 P17 pancreata kan worden geladen in elke 15 ml buis.
- Spin de buis op ~ 600 xg in een swing rotor gedurende 15 min bij 4 ° C. Gebruik rem-off instellingen.
- Na centrifugeren overdracht van de media en de interfase lagen (merk op dat onder ideale bedrijfsomstandigheden, wordt de eilandjes worden in de interfase tussen de polysucrose en kweekmedia na centrifugeren) in een nieuwe 15 ml buis. Voeg 10 ml media, meng grondig, maar voorzichtig.
- Spin down the-eilandje verrijkte fractiebij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het wassen media. Herhaal het wassen nog een keer met een complete RPMI media. Resuspendeer pellets in 4 ml media, die meestal eilandjes en leidingen (figuur 1D) bevat.
- Hand-pick de eilandjes, zoals beschreven in paragraaf 5.1.
6. GSIS Testen in geïsoleerde eilandjes
- Incubeer de eilandjes uit stap 5.1.4 in volledige RPMI media 2 uur in een 37 ° C weefselkweek incubator.
- Gebruik een pipet om RPMI verwijderen onder een dissectie microscoop. Voeg 3 ml KRB oplossing met 2,8 mM glucose op de plaat 3. Swirl 10 keer om de eilandjes te wassen. Verwijder KRB oplossingen.
- Herhaal het wasproces keer. Incubeer de eilandjes met 3 ml KRB oplossing bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator.
- Aliquot 1 mL KRB in elk putje van een 12-wells plaat. Pre-warm de KRB voorraad en de plaat tot 37 ° C in een incubator.
- Was de eilandjes tweemaal met voorverwarmd KRB zoals in 6.2. Transfer 10 eilandjes aan elk putje van de voorverwarmde platen. Incubeer in een 37 ° C incubator.
- Na 45 minuten intrekken 50 pl supernatant. Bevat de insulineoplossing afgescheiden onder basale glucose.
- Voeg 32 ul 500 mM glucose. Swirl de plaat 20 keer om de oplossing te mengen. Incubeer in een 37 ° C incubator. Swirl de plaat 5 maal om de 5 min.
- Na 45 min, in te trekken 50 ul supernatant. Dit is de insuline afgescheiden onder hoge glucose.
- Breng alle eilandjes naar een 1,5 ml buis. Bevriezen in -20 ° C gedurende 30 minuten. Ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Herhaal het invriezen en ontdooien proces.
- Voeg 0,5 ml 70% ethanol met 20 mM HCl. Laat 's nachts. Dit is de insuline in eilandjes.
- Gebruik conventionele ELISA voor insuline niveaus te testen, eerder 3 beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onder optimale omstandigheden kan de onderhavige methode verkregen 20-80 eilandjes van elke kleine muis alvleesklier. Dit aantal is afhankelijk van de genetische achtergrond, leeftijd van de muizen, en de grootte van de eilandjes te vorderen. Onder de meest gebruikte, CD1 out-gefokt en C57BL / 6J raszuivere muizen produceren minder eilandjes met een kleinere omvang dan hybriden tussen CD1 en C57BL / 6 of commerciële B6CBAF1 / J muizen doen. Directe hand oppakken algemeen heeft een kleiner aantal eilandjes, waarschijnlijk vanwege het weglaten van de kleine eilandjes die moeilijk kan zijn om opgenomen wanneer gemengd met exocriene weefsel (Figuur 1 A-C). Gradiëntcentrifugering Meer eilandjes, inclusief enkele eilandjes in het mengsel (figuur 1D) werd verkregen. Oudere muizen produceren ook meer en grotere eilandjes, zoals verwacht uit voortgezette eilandje proliferatie na de geboorte. Interessant is het eilandje aantal herstelde niet direct gecorreleerd met de alvleesklier size: CD1 muizen hebben meestal groter alvleesklier dan F1 progCongénies van CD1 en C57BL / 6J muizen oversteken. Toch CD1 muizen produceren gewoonlijk minder eilandjes zijn dan de F1 nakomelingen.
Ofwel insufficient- of over-digestie met collagenase resulteert in suboptimale eilandje isolement. In het eerste geval kunnen grote eilandjes gemakkelijk worden gevisualiseerd, maar sommige eilandjes niet volledig gescheiden van acinaire weefsel (Figuur 2A). Dit zal de opbrengst van eilandjes verminderen, maar grotere eilandjes worden gewoonlijk geproduceerd. In het laatste geval kan acinaire weefsel volledig gescheiden van eilandjes. Nog compromitteert dit het eilandje structuur, wat resulteert in vele eilandjes met ruwe oppervlakken (figuur 2B).
Neonatale eilandjes geïsoleerd met deze werkwijze hebben insulinesecretie profielen verwacht. Bijvoorbeeld, weergegeven zowel P1 en P7 eilandjes hoge basale insuline secretie (figuur 3, vergelijk het niveau van insuline secretie bij 2,8 mm glucose between P1-P7 en volwassen P24 eilandjes), typische GSIS profielen van onrijpe eilandje beta-cellen 7, 9. Dit suggereert dat onze eilandje isolèringsproces grotendeels behoudt de functionele eigenschappen van neonatale eilandjes. We verwachten dan ook dat deze eilandjes zijn waarschijnlijk fit voor andere in-vitro-gebaseerde studies, met inbegrip van genexpressie, metabolische analyses, overleving assays en stressreacties.
Figuur 1. Verschijning van Eilandjes tijdens de Isolation Process. (A) P1 pancreata na collagenase digestie. Pijl wijst op een relatief grote eilandje. Pijlpunten wijzen naar twee relatief kleine eilandjes. (B) P1 eilandjes na de eerste ronde de hand-picking. (C) Eilandjes na de 3de round hand plukken. (D) Islet fracties na centrifugatie. Arrow, een grote eilandje. Pijlpunt, eenkleine eilandje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Eilandjes na Insufficient- of Over- knippen met Collagenase. (A) met de hand geplukt eilandjes na onder-vergisting, let op de relatie tussen een aantal eilandjes (roze clusters, pijlen) en acinaire cellen (donkere clusters, pijlpunten). (B) Eilandjes na meer dan-vergisting, let op de eilandjes met gekartelde oppervlakken (pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. GSIS Results uit Geïsoleerde eilandjes. Weergegeven gegevens zijn gemiddelden ± SEM. Zij vertegenwoordigen het percentage insuline (hoeveelheid insuline afgegeven gedurende de totale hoeveelheid insuline in vanaf eilandjes) binnen een 45 min test venster met aangegeven glucoseconcentratie. Eilandjes van ICR muizen, via direct de hand plukken, werden gebruikt voor deze testen. Merk op dat P1 en P7 eilandjes onvolwassen werden beschouwd, terwijl P24 eilandjes zijn volwassen 7, 9. De P-waarden worden berekend tussen groepen middels t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier geven we een stap-voor-stap protocol eilandje isolatie van pancreata die te klein om conventionele perfusie. Naar verwachting eilandjes klaar voor eilandjes gebaseerde studies zoals beta-cel zuivering genexpressie analyse eilandje beta-cel maturatie, proliferatie, cel-stress responsen, celoverleving, metabolisme en functioneel beheer GSIS, enz verkregen. Dit zal, naar ons beste weten is de eerste gedetailleerde visuele protocol dat nieuwe onderzoekers gidsen voor eilandje isolatie uit te voeren vanaf neonatale muizen. Zonder deze visuele hulpmiddelen, wordt uitgebreid trial and error verwacht voor de meeste onderzoekers aan succesvolle eilandje isolatie van kleine alvleesklieren bereiken.
De belangrijkste factor voor een succesvolle eilandje isolatie de juiste mate van pancreatische digestie zoals beschreven in stappen 3,6-3,8. In het algemeen, zowel onder- en over-de spijsvertering te verminderen eilandje opbrengst. Over-vergisting verdere compromissen eilandje architectuur, die makes hen ongeschikt voor functionele assays. Om zo goed mogelijk de spijsvertering resultaten te bereiken, de reactie moet voortdurend worden bewaakt om het weefsel fragmentatie proces te visualiseren. Tellen van de duur van digestie op de acinaire-eilandje scheiding beoordelen is de minst betrouwbare methode, omdat elke partij collagenase is verschillend en de leeftijd / grootte van het uitgangsmateriaal pancreas diepgaand effect het verteringsproces. In het geval van onder-vergisting, kunnen grote endocrine-exocriene clusters worden gewassen in HBSS en opnieuw verteerd met collagenase. De digestie kan direct worden gecontroleerd onder een dissectie microscoop om de tijd van voortdurende spijsvertering te bepalen. Gentle pipetteren kan ook worden gebruikt om te helpen het weefsel dissociatie. In dit geval, een P1,000 tip met brede opening behoeften worden gebruikt, waarbij de afschuifkracht die het eilandje architectuur kunnen vernietigen vermindert. Over gedigereerde eilandjes zijn niet geschikt voor de meeste verdere studies, maar kan worden gebruikt voor sommige bepalingen, zoals genexpressie analyse careful controles.
Naast de bovengenoemde voorzichtigheid, aandacht te besteden aan een aantal procedurele factoren kunnen een verdere verbetering van de uiteindelijke eilandje opbrengst en kwaliteit. Eerst, Ca2 + en Mg2 + moeten in alle oplossingen, als niet-commerciële bronnen werden gebruikt. Deze kationen zijn noodzakelijk om eilandje integriteit. Ten tweede, verse collagenase oplossing met een hoge activiteit is essentieel. Collagenase oplossing met een lage activiteit resulteert in een langere tijd voor het weefsel dissociatie. Dit veroorzaakt aanzienlijke exocriene cel autolyse en eilandje vernietiging. Daartoe gebruikmaking collagenase aandelen met meer dan drie ronden van invriezen-ontdooien wordt afgeraden. Ten derde, lage snelheid centrifugeren tijdens weefsel wassen is aan te bevelen. De vuistregel is ag kracht (<500 xg) die voldoende is om de cel clusters bezinken terwijl handhaven celresten in de bovenstaande vloeistof in stap 4.1 van het protocol. Deze snelheid niet alleen voorkomt vernietigen eilandjes, maar helpt ook om remove cel puin makkelijker eilandje visualisatie tijdens de hand plukken mogelijk te maken. Ten slotte kan collagenase niet worden geïnactiveerd door serum 12. Dus de verwijdering door wassen is essentieel om de integriteit eilandje in latere studies te waarborgen.
Tenslotte zij opgemerkt dat de gepresenteerde protocol moet worden beperkt tot muizen alvleesklieren van P1 tot P17. Het werkt niet goed voor alvleesklieren ouder dan P18. Gebruikelijke perfusie van deze oudere muizen wordt aanbevolen voor betere opbrengsten en gezonder eilandjes. Bovendien is de genetische achtergrond en leeftijd muizen diepgaand effect het eilandje opbrengst 13,14. Daarom zal zelfs optimale omstandigheden verschillend aantal eilandjes per alvleesklier, dat is normaal en te verwachten opbrengst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I.
