Summary
हम नवजात चूहों से बरकरार टापू को अलग-थलग करने के लिए इस के साथ साथ एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। Pancreata आंशिक रूप से collagenase के साथ पचा रहे थे, कपड़े धोने और हाथ उठा द्वारा पीछा किया। 20 - 80 आइलेट समूहों नए पैदा हुए चूहों, जो कई आइलेट के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं से अग्न्याशय प्रति प्राप्त किया जा सकता है।
Abstract
छिड़काव आधारित बड़े स्तनधारी Pancreata से आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं। ऐसे प्रोटोकॉल आसानी से अग्नाशय वाहिनी कि तैयार कोलैजिनेज़ इंजेक्शन और बाद में ऊतक छिड़काव के लिए अनुमति देता है के बड़े आकार के कारण कई प्रयोगशालाओं में आयोजित की जाती हैं। इसके विपरीत, छोटे Pancreata से आइलेट अलगाव, नवजात चूहों की तरह, चुनौतीपूर्ण है क्योंकि छिड़काव आसानी से छोटे Pancreata में प्राप्त नहीं है। यहाँ हम एक विस्तृत सरल प्रक्रिया है कि दृश्य सहायता के साथ नए पैदा हुए चूहों से टापू की पर्याप्त संख्या ठीक वर्णन है। हौसले से विच्छेदित पूरे Pancreata microcentrifuge ट्यूब में, 0.5 मिलीग्राम / एमएल collagenase चतुर्थ 37 डिग्री सेल्सियस पर हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HbSS) में भंग के साथ पचा रहे थे। ट्यूब ऊतक प्रसार सहायता करने के लिए नियमित रूप से उपयोग किया गया। ऊतक के सबसे 1 मिमी के आसपास छोटे समूहों को तितर-बितर किया गया था, lysates 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ संस्कृति मीडिया के साथ तीन से चार बार धोया गया। आइलेट समूहों,पहचानने कोष्ठकी ऊतकों से रहित है, तो त्रिविमदर्शी विदारक के तहत बरामद किया जा सकता है। 80 छोटे नए पैदा हुए माउस से अग्न्याशय प्रति बड़े आकार के टापू के लिए - इस विधि को 20 ठीक हो जाए। ये टापू इंसुलिन के स्राव, जीन अभिव्यक्ति, और संस्कृति सहित ज्यादातर बोधगम्य बहाव assays, के लिए उपयुक्त हैं। इंसुलिन का स्राव परख का एक उदाहरण अलगाव की प्रक्रिया को मान्य करने के लिए प्रस्तुत किया है। आनुवंशिक पृष्ठभूमि और पाचन की डिग्री उपज का निर्धारण सबसे बड़ा कारक हैं। उच्च गतिविधि के साथ ताजा बना collagenase समाधान पसंद किया जाता है, के रूप में यह अंत: स्रावी-बहि अलगाव में एड्स। सभी समाधान और धोने में भ्रूण गोजातीय सीरम में फैटायनों की उपस्थिति [कैल्शियम (सीए 2) और मैग्नीशियम (2 मिलीग्राम +)] / उठा मीडिया उचित ईमानदारी के साथ टापू की अच्छी उपज के लिए आवश्यक हैं। अच्छा विपरीत और बढ़ाई साथ एक विदारक गुंजाइश भी मदद मिलेगी।
Protocol
/ 11/181 के लिए गुजरात वेंडरबिल्ट संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु उपयोग प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल एम में निर्दिष्ट निम्नानुसार है। CD1 या CBA / BL6 चूहों वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा और नवजात चूहों प्राप्त करने के वेंडरबिल्ट जानवरों की सुविधा में पार कर रहे थे।
1. चूहे की तैयारी, स्टॉक समाधान, और उपकरण
- माउस पार करने के लिए: एक माउस पार की स्थापना की और प्रायोगिक योजना बनाने में सहायता करने के plugging तिथियों रिकॉर्ड है। CD1 चूहों आमतौर पर संभोग के बाद 19 दिन के आसपास जन्म देते हैं। उपयोग CD1 या CBA / BL6 क्रमश CD1 या CBA / BL6 नवजात शिशुओं प्राप्त करने के लिए, पार करती है। दो पंक्तियों के बीच Intercrosses CD1 महिलाओं और CBA / BL6 पुरुषों का उपयोग।
- कोलैजिनेज़ शेयर के लिए: एक उच्च परिशुद्धता के संतुलन के साथ 200 मिलीग्राम collagenase प्रकार चतुर्थ तौलना। एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरण। सीए के साथ 40 एमएल HBSS में भंग 2 + / 2 मिलीग्राम + (1.26 और 0.5 मिमी, क्रमशः) एक 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाने के लिए।
- करने के लिए अनुमति दें कोलैजिनेज़कोमल झटकों के साथ ~ 30 मिनट के लिए भंग। अशेष और समाधान स्टॉक के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस है, जो कम से कम एक वर्ष के लिए सक्रिय रहता में जमे रहते हैं।
- विच्छेदन और आइलेट चुनने के लिए चिमटी, कैंची, और P20 सुझावों में से कई जोड़े बाँझ आटोक्लेव।
- 1 एम ग्लूकोज शेयर के लिए: एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में वजन 9 ग्राम ग्लूकोज ग्लूकोज भंग करने के लिए 50 एमएल RPMI 1640 मीडिया जोड़ें। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस रखें, लेकिन कोई अधिक से अधिक 6 महीने।
2. काम समाधान
नोट: आइलेट अलगाव के दिन, निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार करते हैं।
- collagenase प्रकार चतुर्थ काम समाधान के लिए: पिघलना और बर्फ पर कोलैजिनेज़ शेयर पतला। प्रत्येक 1.7 एमएल microfuge ट्यूब में बांटना 0.15 एमएल शेयर। 1.35 एमएल HBSS सीए 2/2 मिलीग्राम + के साथ जोड़े। ट्यूब पलटना 5 बार। 15 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
- एक microcentrifuge में 3 मिनट के लिए उच्च गति पर स्पिन। एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। उपयोग करें जब तक बर्फ पर छोड़ दो। अघुलनशील मलबे के साथ ट्यूब त्यागें।
- पूरा RPMI 1640 मीडिया के लिए: 500 एमएल RPMI 1640 मीडिया में जोड़ने के 2.5 एमएल 1 एम ग्लूकोज, 50 एमएल गर्मी निष्क्रिय FBS, और 5 एमएल 100x कलम strep शेयर। उपयोग करें जब तक बर्फ पर छोड़ दें।
3. अग्न्याशय अलगाव और पाचन
- isoflurane के साथ नवजात शिशुओं को मंजूरी दे दी प्रोटोकॉल के अनुसार कत्ल के द्वारा पीछा euthanize।
- उसके पेट का सामना करना पड़ के साथ माउस निर्धारित करना। नसबंदी के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे।
- चिमटी के साथ पेट त्वचा उठा और त्वचा और मांसपेशियों की परतों longitudinally कटौती कैंची की एक जोड़ी के साथ midline के साथ, रिब पिंजरे के जननांग क्षेत्र से। यह सभी आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए उदर गुहा को खोलता है।
- चिमटी की एक जोड़ी के साथ एक 100 सेमी डिश के लिए सभी आंतरिक अंगों स्थानांतरण। अग्न्याशय, जो एक पृष्ठीय भाग है कि पेट और प्लीहा और एक उदर भाग कि ग्रहणी 11 को पकड़ लेता को पकड़ लेता है के साथ एक बिखरे हुए अंग है पता लगाएँ। अंगों डूब डिश में HBSS जोड़ें। समाधान में, अग्नाशय के ऊतकों नहीं रह ग्रहणी, पेट, या तिल्ली से जुड़े हुए हैं। क्योंकि यह अपनी ठेठ सफेद रंग का एक विदारक दायरे के तहत आसानी से पहचानने योग्य है। HBSS के साथ एक नया 60 मिमी डिश के लिए आसपास के ऊतकों और हस्तांतरण से दूर अग्नाशय के ऊतकों छील करने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- किसी भी आयाम भर में 5 मिमी की तुलना में छोटे टुकड़ों में एक कैंची के साथ प्रत्येक अग्न्याशय कट। एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब पर स्थानांतरण। अप करने के लिए पांच Pancreata (P7 की तुलना में छोटी) एक ट्यूब में पचा जा सकता है। P8-P16 चूहों के लिए, अग्न्याशय प्रति एक ट्यूब का उपयोग करें।
- प्रत्येक ट्यूब 1 एमएल collagenase काम समाधान - 0.5 जोड़ें (प्रत्येक P1-P7 अग्न्याशय के लिए 0.2 एमएल प्रत्येक P8-P16 अग्न्याशय के लिए 0.5 एमएल का प्रयोग करें।)। अप करने के लिए 15 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ट्यूब छोड़ दें। ट्यूब पलटना दो बार हर मिनट।
- ~ 5 मिनट के बाद, अग्नाशय के ऊतकों की पाचन स्थिति पर नजर रखने के लिए ट्यूब नल। अग्नाशय के सबसे तक पाचन प्रक्रिया को जारी रखेंऊतकों के रूप में खंडित सेल समूहों, व्यास <2 मिमी के साथ प्रकट होता है। lysate बादल छाए रहेंगे, जो सामान्य कोष्ठकी सेल autolysis की वजह से है दिखाई देगा।
4. Lysate धुलाई
- 10 एस के लिए 500 XG पर lysate स्पिन एक microcentrifuge में। एक P1,000 Pipetman साथ सतह पर तैरनेवाला परत निकालें। सतह पर तैरनेवाला पंकिल लेकिन सेल समूहों से रहित दिखाई देनी चाहिए। आकांक्षा का उपयोग न करें, जो जल्दी से कुछ चिपचिपा डीएनए की उपस्थिति के कारण तल पर ऊतक टुकड़े दूर aspirate सकता है।
- 1 एमएल RPMI 1640 पूरा मीडिया जोड़ें। खंडित lysate resuspend करने के लिए धीरे ट्यूब नल। ऊपर पलटना और 10 गुना कम है। दोहराएँ कदम 4.1।
- दोहराएँ कदम 4.2 दो बार या जब तक सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट प्रतीत होता है। 1 एमएल पूरा RPMI 1640 मीडिया में धोया अग्नाशय के टुकड़े फिर से निलंबित।
5. आइलेट अलगाव
नोट: Pancreata की कम संख्या के लिए, सीधे हाथ से उठा नीचे के रूप में (5.1) आइलेट isol के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासमझना। Pancreata की बड़ी संख्या के लिए (> 6), विधि 5.2 में उल्लिखित पसंद किया जाता है।
- प्रत्यक्ष हाथ उठा:
- 4.3 चरण से एक 60 मिमी डिश के लिए स्थानांतरण lysate। 5 एमएल पूरा RPMI 1640 मीडिया जोड़ें। एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत लाने के।
- माइक्रोस्कोप पर उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी सेट करें। प्रकाश की तीव्रता अधिकतम बिजली की ~ 50% करने के लिए समायोजित करें। इस शर्त के तहत, टापू के रूप में थोड़ा गुलाबी समूहों दिखाई देते हैं, जबकि कोष्ठकी कोशिकाओं के रूप में अंधेरे अनियमित आकार समूहों (चित्रा 1 ए)। ~ 50X (उद्देश्य की शक्ति और आंख टुकड़ा संयोजन) के एक बढ़ाई visualizing टापू का सबसे अच्छा तरीका है और चुनने के लिए pipet टिप उद्घाटन एक साथ की पेशकश करने की सिफारिश की है।
- एक P20 विंदुक टिप के साथ टापू उठाओ, जबकि कोष्ठकी समूहों से परहेज। RPMI पूरा मीडिया (चित्रा 1 बी) के साथ एक नया 60 मिमी डिश के लिए बग़ैर टापू समृद्ध अंशों।
- हाथ उठा प्रक्रिया दो बार अधिक दोहराएँ। एक नया 60 में शुद्ध टापू छोड़ दो4 एमएल पूरा RPMI मीडिया (चित्रा 1 सी) के साथ मिमी पकवान।
- ढाल centrifugation:
- एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब कि 1.077 g / एमएल के घनत्व पर 2 एमएल polysucrose और सोडियम diatrizoate के साथ preloaded है तैयार करें। उपयोग करें जब तक बर्फ पर ट्यूब छोड़ दें।
- पाश्चर विंदुक के साथ polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान के शीर्ष पर 4.3 चरण से निलंबन स्थानांतरण। नीचे की परत को परेशान मत करो। अप करने के लिए नए पैदा हुए 10 या 2 P17 Pancreata से ऊतकों प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब में लोड किया जा सकता है।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए एक स्विंग रोटर में ~ 600 XG पर ट्यूब स्पिन। ब्रेक बंद सेटिंग्स का उपयोग करें।
- centrifugation के बाद, एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया और अंतरावस्था परतों (ध्यान दें कि आदर्श ऑपरेशन की शर्तों के तहत, टापू centrifugation के बाद polysucrose और संस्कृति मीडिया के बीच interphase में स्थित हो जाएगा) हस्तांतरण। 10 एमएल मीडिया जोड़ें, धीरे लेकिन अच्छी तरह मिला लें।
- स्पिन आइलेट-समृद्ध अंश5 मिनट के लिए 300 XG पर। धोने मीडिया निकालें। पूरा RPMI मीडिया के साथ धो दोहराएँ एक बार और। 4 एमएल मीडिया है, जो ज्यादातर टापू और नलिकाओं (चित्रा -1) शामिल करने में Resuspend छर्रों।
- धारा 5.1 में उल्लिखित टापू हाथ उठाओ।
6. पृथक आइलेट्स में GSIS Assays
- एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए पूरा RPMI मीडिया में कदम 5.1.4 से टापू सेते हैं।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत RPMI दूर करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें। 2.8 मिमी ग्लूकोज के साथ 3 एमएल KRB समाधान प्लेट 3 में जोड़े। 10 बार भंवर टापू धोने के लिए। KRB समाधान निकालें।
- कपड़े धोने की प्रक्रिया एक बार दोहराएँ। एक मशीन में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 एमएल KRB समाधान के साथ टापू सेते हैं।
- अशेष 1 एमएल KRB एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में। एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म KRB शेयर और प्लेट।
- 6.2 में के रूप में पूर्व गर्म KRB के साथ दो बार टापू धो लें। ट्रांसफेर पूर्व गर्म प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 टापू। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- 45 मिनट के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 50 μL वापस ले लें। इस इंसुलिन समाधान बेसल ग्लूकोज के तहत स्रावित होता है।
- 32 μL 500 मिमी ग्लूकोज जोड़ें। समाधान मिश्रण को थाली ज़ुल्फ़ 20 बार। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं। प्लेट भंवर 5 बार बार हर 5 मिनट।
- 45 मिनट के बाद, 50 μL सतह पर तैरनेवाला वापस ले लें। इस इंसुलिन उच्च ग्लूकोज के तहत स्रावित होता है।
- एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सभी टापू स्थानांतरण। 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस में रुक। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पिघलना। ठंड और विगलन प्रक्रिया को दोहराएं।
- 20 मिमी एचसीएल के साथ 0.5 एमएल 70% इथेनॉल जोड़ें। रात भर छोड़ दें। इस इंसुलिन टापू में छोड़ दिया है।
- इंसुलिन का स्तर परख करने के लिए पारंपरिक एलिसा का प्रयोग करें, पहले 3 में वर्णित है।
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Representative Results
प्रत्येक छोटे माउस अग्न्याशय से 80 टापू - इष्टतम शर्तों के तहत, प्रस्तुत विधि 20 उपज कर सकते हैं। यह संख्या आनुवंशिक पृष्ठभूमि, चूहों की उम्र पर निर्भर करता है, और टापू का आकार वसूले जाएंगे। बीच में आमतौर पर इस्तेमाल किया, CD1 बाहर नस्ल और C57BL / 6J शुद्ध नस्ल चूहों CD1 और C57BL / 6 या वाणिज्यिक B6CBAF1 के बीच संकर की तुलना में छोटे आकार के साथ कम टापू उत्पादन / जम्मू चूहों से करते हैं। प्रत्यक्ष हाथ आम तौर पर उठा छोटे टापू का बहिष्कार कि जब बहि ऊतकों (चित्रा 1 ए सी) के साथ मिश्रित मान्यता प्राप्त करने के लिए कठिन हो सकता है के कारण टापू की एक छोटी संख्या है, आमतौर पर दे दी है। ढाल centrifugation मिश्रण (चित्रा -1) में छोटे टापू सहित अधिक टापू, उपज कर सकते हैं। बड़े चूहों को भी जन्म के बाद जारी रखा आइलेट प्रसार से अपेक्षा के अनुसार, अधिक से बड़े टापू का उत्पादन। दिलचस्प बात यह है आइलेट बरामद संख्या सीधे अग्न्याशय के आकार के साथ सहसंबद्ध नहीं है: CD1 चूहों आमतौर पर F1 ठेला से भी बड़ा है अग्न्याशयCD1 और C57BL की enies / 6J चूहों को पार। फिर भी CD1 चूहों आमतौर पर F1 संततियों से कम टापू का उत्पादन।
या तो insufficient- या अधिक पाचन सबऑप्टिमल आइलेट अलगाव में कोलैजिनेज़ परिणाम के साथ। पूर्व मामले में, बड़े टापू आसानी से देखे जा सकते हैं, अभी तक कुछ टापू पूरी तरह से कोष्ठकी ऊतकों (2A चित्रा) से अलग नहीं किया जा सकता है। इस टापू की उपज कम हो जाएगा, लेकिन बड़े टापू आमतौर पर उत्पादित कर रहे हैं। उत्तरार्द्ध मामले में, कोष्ठकी ऊतकों पूरी तरह से टापू से अलग किया जा सकता है। अभी तक इस आइलेट संरचना समझौता, किसी न किसी सतहों (चित्रा 2 बी) के साथ कई टापू में जिसके परिणामस्वरूप।
इस विधि द्वारा पृथक नवजात टापू इंसुलिन का स्राव प्रोफाइल की उम्मीद है। उदाहरण के लिए, दोनों P1 और P7 टापू उच्च बेसल इंसुलिन के स्राव (चित्रा 3 प्रदर्शित, 2.8 मिमी ग्लूकोज betwee पर इंसुलिन का स्राव के स्तर की तुलनाn P1-P7 और परिपक्व P24 टापू), अपरिपक्व आइलेट बीटा कोशिकाओं 7, 9 की खासियत GSIS प्रोफाइल। यह पता चलता है कि हमारे आइलेट अलगाव की प्रक्रिया काफी हद तक नवजात टापू के कार्यात्मक संपत्तियों का संरक्षण। इसलिए हम उम्मीद करते हैं कि इन टापू जीन अभिव्यक्ति, चयापचय का विश्लेषण करती है, अस्तित्व assays, और तनाव प्रतिक्रियाओं सहित अन्य इन विट्रो आधारित अध्ययन, के लिए की संभावना फिट हैं।
चित्रा 1. आइलेट्स की सूरत अलगाव की प्रक्रिया के दौरान। (ए) collagenase पाचन के बाद P1 Pancreata। एक अपेक्षाकृत बड़े आइलेट को अंक तीर। तीर दो अपेक्षाकृत छोटे टापू को इंगित करें। (बी) P1 के पहले दौर हाथ उठा के बाद islets। (सी) के बाद 3 आरडी दौर handpicking टापू। ढाल centrifugation के बाद (डी) आइलेट अंशों। तीर, एक बड़े आइलेट। Arrowhead, एकछोटे आइलेट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Insufficient- या कोलेजिनेस साथ अति पाचन के बाद 2. आइलेट्स चित्रा। (ए) के तहत पाचन के बाद हाथ उठाया टापू, कोष्ठकी कोशिकाओं (अंधेरे समूहों, तीर) कुछ टापू के बीच एसोसिएशन (गुलाबी समूहों, तीर) और ध्यान दें। (बी) के टापू के बाद के ऊपर-पाचन, दांतेदार सतहों (तीर) के साथ टापू पर ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. GSIS रेसुलपृथक आइलेट्स से TS। प्रस्तुत डाटा ± SEM मतलब हैं। उन्होंने संकेत दिया ग्लूकोज एकाग्रता के साथ एक 45 मिनट परख खिड़की के भीतर इंसुलिन रिलीज (शुरू टापू में निहित इंसुलिन की कुल राशि पर जारी इंसुलिन की मात्रा) का प्रतिशत प्रतिनिधित्व करते हैं। आईसीआर चूहों से आइलेट्स, सीधे हाथ उठा के माध्यम से, इन assays के लिए उपयोग किया गया। 9 ध्यान दें कि P1 और P7 टापू अपरिपक्व विचार किया गया, जबकि P24 टापू परिपक्व 7 रहे हैं। पी मूल्यों टी परीक्षण का उपयोग कर समूहों के बीच गणना कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ, हम Pancreata कि पारंपरिक छिड़काव के लिए बहुत छोटे हैं से आइलेट अलगाव पर एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह इस तरह के बीटा सेल शुद्धि, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, आइलेट बीटा सेल परिपक्वता, प्रसार, सेल तनाव प्रतिक्रियाओं, सेल अस्तित्व, चयापचय, और कार्यात्मक GSIS रखरखाव, आदि के रूप में सभी आइलेट आधारित अध्ययन के लिए तैयार टापू उपज की उम्मीद है। यह हमारे ज्ञान, पहली विस्तृत दृश्य प्रोटोकॉल नए शोधकर्ताओं गाइड है कि नवजात चूहों से आइलेट अलगाव प्रदर्शन करने का सबसे अच्छा करने के लिए किया जाएगा। इन दृश्य सहयोगियों के बिना, व्यापक परीक्षण और त्रुटि के सबसे शोधकर्ताओं के लिए की उम्मीद है लघु Pancreata से सफल आइलेट अलगाव को प्राप्त करने के लिए।
एक सफल आइलेट अलगाव के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक अग्नाशय पाचन की उचित डिग्री के रूप में कदम 3.6 में उल्लिखित है - 3.8। सामान्य तौर पर, दोनों के तहत और अधिक पाचन आइलेट उपज कम हो। ओवर-पाचन आगे समझौता आइलेट वास्तुकला, जो पहुंचउन्हें कार्यात्मक assays के लिए अनुपयुक्त तों। सबसे अच्छा पाचन परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रतिक्रिया लगातार ऊतक विखंडन प्रक्रिया कल्पना करने के लिए निरीक्षण किया जा रहा है। पाचन की अवधि पर गिनती कोष्ठकी-आइलेट जुदाई न्याय करने के लिए, कम से कम भरोसेमंद तरीका है क्योंकि कोलैजिनेज़ के प्रत्येक बैच अलग है और शुरू अग्न्याशय गहराई से प्रभाव डालता है पाचन प्रक्रिया की उम्र / आकार। अंडर पाचन के मामले में, बड़े अंत: स्रावी-बहि समूहों HBSS में धोया और collagenase के साथ फिर से पच जा सकता है। पाचन तो जारी रखा पाचन के समय निर्धारित करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सीधे नजर रखी जा सकती है। कोमल pipetting भी सहयोगी ऊतक हदबंदी के लिए उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, व्यापक खोलने की जरूरत के साथ एक P1,000 टिप उपयोग किया जा है, जो बाल काटना बल है कि आइलेट वास्तुकला नष्ट कर सकता है कम। ओवर-पच टापू सबसे बाद में पढ़ाई के लिए सिफारिश नहीं कर रहे हैं, लेकिन इस तरह के carefu साथ जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में कुछ assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएल नियंत्रित करता है।
ऊपर सावधानी के अलावा, कई प्रक्रियागत कारकों पर ध्यान देने के लिए आगे अंतिम आइलेट उपज और गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं। सबसे पहले, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + सभी समाधान में शामिल किया जाना चाहिए, अगर गैर-वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग किया गया। ये फैटायनों आइलेट अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। दूसरा, उच्च गतिविधि के साथ नए सिरे collagenase समाधान आवश्यक है। ऊतक हदबंदी के लिए एक लंबे समय में कम गतिविधि परिणामों के साथ collagenase समाधान। यह पर्याप्त बहि सेल autolysis और आइलेट विनाश का कारण बनता है। यह अंत करने के लिए, ठंड विगलन के अधिक से अधिक तीन राउंड के साथ कोलैजिनेज़ शेयरों का उपयोग अनुशंसित नहीं है। ऊतक धोने के दौरान तीसरा, कम गति centrifugation की सिफारिश की है। अंगूठे का नियम एजी बल (<500 XG) कि सेल समूहों तलछट के लिए प्रोटोकॉल के 4.1 कदम में सतह पर तैरनेवाला में सेल मलबे को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है, जबकि फायदा नहीं है। यह गति न केवल टापू को नष्ट करने से बचा जाता है, लेकिन यह भी रेमो में मदद करता हैसेल मलबे ve हाथ उठा दौरान आसान आइलेट दृश्य सक्षम करने के लिए। अन्त में, कोलैजिनेज़ सीरम 12 से निष्क्रिय नहीं किया जा सकता। इस प्रकार, धोने से अपने को हटाने के बाद में पढ़ाई में आइलेट अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल P1 से P17 के लिए माउस Pancreata तक सीमित किया जाना चाहिए। यह P18 से अधिक पुराने Pancreata के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है। इन बड़े चूहों के लिए पारंपरिक छिड़काव बेहतर पैदावार और स्वस्थ टापू के लिए सिफारिश की है। इसके अलावा, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और चूहों की उम्र गहराई से आइलेट उपज 13,14 प्रभावित करते हैं। इसलिए, इष्टतम स्थितियों अग्न्याशय प्रति टापू की अलग संख्या है, जो सामान्य है और उम्मीद है निकलेगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
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