Summary
我々は、新生児マウスから無傷の膵島を単離するために、本明細書のプロトコルを記述します。膵臓は、部分的に洗浄し、ハンドピッキング続いて、コラゲナーゼで消化しました。 20から80膵島クラスタは、いくつかの島の研究に適しており、新たに生まれたマウスから膵臓ごとに取得することができます。
Abstract
大型哺乳動物の膵臓からの灌流ベースの膵島分離プロトコルは十分に確立されています。このようなプロトコルは容易に準備ができて、コラゲナーゼ注入とその後の組織潅流を可能にする膵管の大きなサイズのため、多くの研究室で行われています。灌流は小さな膵臓で容易に達成可能ではないので、コントラスト、小さな膵臓から膵島単離では、新生児マウスのような、挑戦的です。ここでは、視覚的な支援を受けて、新たに生まれたマウスからの膵島の相当数を回復する詳細な簡単な手順について説明します。新たに切開全膵臓を微量遠心管中、37℃で、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に溶解し0.5ミリグラム/ mLのコラゲナーゼIVで消化しました。チューブは、組織の分散を助けるために、定期的にタップされました。組織の大部分を1mmの周りの小さいクラスタに分散させたときに、溶解物を、10％ウシ胎児血清（FBS）で培養培地で3〜4回洗浄しました。アイレットクラスター、認識腺房組織を欠く、その後ステレオスコープを解剖下で回収することができます。新たに生まれたマウスの膵臓あたりの大型小島に80小 - この方法は、20を回収します。これらの島は、インスリン分泌、遺伝子発現、および文化を含むほとんどの考えられる下流のアッセイに適しています。インスリン分泌アッセイの例は、単離プロセスを検証するために提示されています。遺伝的背景と消化の程度が収量を決定する最大の要因です。それは内分泌外分泌分離に役立つように、高い活性を有する新たに作られたコラゲナーゼ溶液が好ましいです。洗浄中のすべてのソリューションやウシ胎児血清中の陽イオンの存在[カルシウム（Ca 2+）とマグネシウム（Mg 2+）] /ピッキングメディアは、適切な整合性を持つ島の良好な収率のために必要です。良好なコントラストおよび倍率の解剖スコープにも役立ちます。
Protocol
動物の使用は、プロトコルM /区のためのヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会によって承認された181分の11で指定された手順に従います。 CD1またはCBA / BL6マウスは、市販業者から購入し、新生児マウスを得るために、ヴァンダービルトの動物施設で交配しました。
1.マウスの作製、ストックソリューション、および機器
- マウスのクロスの場合：マウスのクロスを設定し、実験計画を支援するために差し込む日付を記録します。 CD1マウスは、通常、交配後19日目の周りに出産します。使用CD1またはCBA / BL6は、それぞれ、CD1またはCBA / BL6新生児を得ることが横切ります。 2ライン間の交雑は、CD1雌及びCBA / BL6雄を利用します。
- コラゲナーゼ在庫について：高精密天秤で200mgのコラゲナーゼタイプIVの重量を量ります。 50 mL遠心管に移します。カルシウムと40 mLのHBSSに溶かし2+ / Mgの2+（それぞれ1.26および0.5 mMのは、）を5mg / mLのストック溶液を作製しました。
- へのコラゲナーゼを許可します穏やかに振盪しながら〜30分間溶解します。少なくとも1年間有効のままになりストックとして-20℃で凍結させた溶液を、アリコートとキープ。
- 解剖および島ピッキングのためのピンセット、はさみ、およびP20のヒントのいくつかのペアを滅菌するオートクレーブ。
- 1 Mグルコース在庫について：グルコースを溶解するために50mlのRPMI 1640培地を追加し、50 mL遠心管に9グラムのグルコースを量ります。使用するまで4℃に保ち、ない6カ月以上。
2.ワーキングソリューション
注：膵島単離の日は、以下の試薬を準備します。
- コラゲナーゼIV型作業溶液の場合：解凍し、氷上でコラゲナーゼの株式を希釈します。各1.7 mLのマイクロチューブに0.15 mLのストックを分注します。 Ca 2+ / Mgの2+で1.35 mLのHBSSを追加します。チューブを5回反転します。氷上で15分間のままにしておきます。
- 微量で3分間、高速で回転。上清を新しいチューブに移します。使用するまで氷上に残します。不溶性の破片でチューブを捨てます。
- 完全RPMI 1640培地の場合：500 mLのRPMI 1640培地に2.5 mLの1 Mグルコース、FBS不活化50 mLの熱、および5 mLの100倍ペン連鎖球菌の株式を追加します。使用するまで氷上におきます。
3.膵臓の単離と消化
- 承認されたプロトコルに従って断頭続いイソフルランと新生児を、安楽死させます。
- その腹を上に向けてマウスを置きます。殺菌のための70％エタノールでスプレーします。
- ピンセットで腹の皮膚を持ち上げ、陰部から胸郭に、ハサミで正中線に沿って縦方向に皮膚や筋肉層を切ります。これは、すべての内臓を露出させるために腹腔を開きます。
- ピンセットで100センチの皿にすべての内臓を転送します。胃と脾臓と十二指腸11にしがみつい腹部分にしがみつい背部分で散乱臓器である膵臓を、見つけます。 臓器を沈めるために皿にHBSSを追加します。溶液中では、膵臓組織はもはや十二指腸、胃、または脾臓にしがみつくません。それは、その典型的な白い色の解剖範囲の下で容易に認識可能です。 HBSSで新しい60ミリメートル皿に離れて周囲の組織と転送から膵臓組織を剥離するためにピンセットを使用してください。
- 任意のディメンション間5ミリメートルより小さな部分にハサミで各膵臓をカットします。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移します。 5膵臓（P7より若い）まで1チューブ内で消化することができます。 P8-P16マウスの場合、膵臓あたり1チューブを使用しています。
- 各チューブに1 mLのコラゲナーゼ作業溶液（それぞれP1-P7の膵臓用0.2 mLの各P8-P16膵臓のために0.5 mLのを使用してください。） - 0.5を追加します。最大15分間37℃のインキュベーター内でチューブを残します。チューブを2回毎分を反転。
- 〜5分後、膵臓組織の消化状況を監視するためにチューブをタップします。膵臓のほとんどまで消化プロセスを続行組織は、直径<2ミリメートルで、断片化された細胞塊として表示されます。溶解物を、通常の腺房細胞の自己消化によるものである、曇って表示されます。
4.溶解物の洗濯
- 微量で10秒間500×gで溶解液をスピン。 P1,000ピペットマンで上澄み層を除去。上清は濁ったが、細胞クラスターを欠いて表示されます。すぐに起因するいくつかの粘着性のDNAの存在に下部の組織片を離れて吸引し得る、吸引を使用しないでください。
- 1 mLのRPMI 1640完全培地を追加します。断片化した溶解物を再懸濁するために静かにチューブをタップします。アップ裏返し、10回ダウン。繰り返し手順4.1。
- 繰り返しステップ4.2をさらに2回または上清が透明になるまで。 1 mLの完全RPMI 1640培地で洗浄した膵臓の断片を再サスペンド。
5.膵島単離
注：膵臓の小さな番号については、直接手で摘み、以下のように（5.1）は、膵島ISOLのために使用することができますエーション。膵臓の多数のために（> 6）、5.2に概説された方法が好ましいです。
- 直接手でピッキング：
- 60ミリメートル皿にステップ4.3からの溶解物を転送します。 5 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。解剖顕微鏡下で持参してください。
- 顕微鏡での明視野照明を設定します。最大電力の約50％の光量を調整します。この状態で、島は腺房細胞のような暗い不規則な形のクラスターのに対し（ 図1A）、など少しピンクのクラスタを表示されます。 （対物レンズと接眼のパワーを組み合わせる）〜50Xの倍率は、小島とピッキングに対して同時に開くピペットチップを可視化する最良の方法を提供することをお勧めします。
- 腺房クラスタを避けながら、P20のピペットチップで膵島をピックアップ。 RPMI完全培地（ 図1B）を持つ新しい60ミリメートル皿に小島-濃縮された画分を分注します。
- 二回以上手でピッキングプロセスを繰り返します。新しい60で純粋な島を残します4 mLの完全RPMI培地（ 図1C）とmmディッシュ。
- 勾配遠心分離：
- 1.077グラム/ mlの密度で2mLのポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウムがプリロードされた15 mL遠心チューブを準備します。使用するまで氷上でチューブを残します。
- パスツールピペットでポリスクロースおよびナトリウムジアトリゾ液の上部にステップ4.3からサスペンションを転送します。底層を乱さないでください。最大10の組織が新生または2 P17膵臓を各15mLの管に装填することができます。
- 4℃で15分間、スイングローターで〜600×gでチューブをスピン。ブレーキオフの設定を使用します。
- 遠心分離した後、新しい15mLのチューブに（理想的な動作条件の下で、島は遠心分離後ポリスクロースと文化の媒体間の相間に配置されますことに注意してください）メディアと相間層を転送します。 10 mLのメディアを追加し、穏やかに、しかし完全に混合します。
- 膵島濃縮画分をスピンダウン5分間、300×gで。洗浄培地を除去します。完全RPMI培地で洗浄をもう一度繰り返します。主に膵島およびダクト（ 図1D）が含まれている 4 mLのメディアへの再懸濁ペレット。
- セクション5.1に概説された膵島を手で選びます。
単離された膵島6. GSISアッセイ
- 37℃の組織培養インキュベーター中で2時間、完全RPMI培地中でステップ5.1.4から膵島を培養します。
- 解剖顕微鏡下でRPMIを削除するには、ピペットを使用してください。プレート3に2.8 mMグルコースと3 mLのKRBのソリューションを追加します。膵島を洗浄するために10回渦巻。 KRBソリューションを削除します。
- 一度洗浄工程を繰り返します。インキュベーター中で1時間、37℃で3 mLのKRB溶液で島をインキュベートします。
- 12ウェルプレートの各ウェルにアリコート1mLのKRB。インキュベーター中で37℃にKRBストックとプレートを事前に温めます。
- 6.2のように予熱したKRBで二回の膵島を洗ってください。トランスFER予熱したプレートの各ウェルに10の島。 37℃のインキュベーター中でインキュベートします。
- 45分後、50μLの上清を撤回。これは、基礎グルコースの下で分泌されるインスリンのソリューションが含まれています。
- 32μL500 mMグルコースを追加します。溶液を混合するためにプレートを20回渦巻。 37℃のインキュベーター中でインキュベートします。プレートを5回ごとに5分を渦巻。
- 45分後、50μLの上清を撤回。これは、高グルコース下で分泌されるインスリンです。
- 1.5 mLのチューブに、すべての膵島を転送します。 30分間-20℃で凍結します。 5分間、室温で解凍します。凍結融解処理を繰り返します。
- 20mMのHClで0.5 mLの70％エタノールを追加します。一晩おきます。これは、ランゲルハンス島に残されたインスリンです。
- インスリンレベルをアッセイするために、従来のELISAを使用して、先に説明した3。
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Representative Results
各小マウスの膵臓から80小島 - 最適な条件の下では、提示された方法は、20を得ることができます。この数は、マウスの遺伝的背景、年齢に依存し、島の大きさは、回収されます。一般的に使用され、CD1の中で繁殖させたアウトとC57BL / 6J純血マウスCD1とC57BL / 6の間のハイブリッドまたは商業B6CBAF1 / Jマウスが何よりも小さいサイズの小さい島を生産します。一般的にピッキング直接手が原因で外分泌組織（ 図1A-C）と混合した場合に認識するのは難しいかもしれない小さな島の排除に膵島の数が少ない、可能性を与えました。勾配遠心分離は、ミックスの小さい小島（ 図1D）を含む、より多くの島を得ることができます。出産後も継続膵島増殖から予想されるように古いマウスはまた、より多くの、より大きな島を生産します。興味深いことに、回収された膵島の数は、直接膵臓の大きさと相関していない：CD1マウスは、通常、F1プログレよりも大きな膵臓を持っています交配CD1とC57BL / 6Jマウスのエニエス。しかし、CD1マウスは、通常のF1子孫よりも小さい島を生産します。
insufficient-または過消化次善の膵島単離におけるコラゲナーゼの結果とのいずれか。前者の場合には、大きな島は容易に可視化することができる、まだいくつかの島を完全に腺房組織（ 図2A）から分離することができません。これは、膵島の収率が低下しますが、より大きな島は、通常、製造されています。後者の場合には、腺房組織を完全に島から解離させることができます。しかし、これは粗い表面（ 図2B）と、多くの島で、その結果、膵島構造を損ないます。
この方法によって単離された新生児膵島は、インスリン分泌プロファイルを期待しています。例えば、P1及びP7膵島の両方が高い基礎インスリン分泌（ 図3、2.8 mmにインスリン分泌のレベルを比較グルコースbetweeを表示しましたnはP1-P7と成熟したP24膵島）、未熟膵島β細胞の典型的なGSISプロファイル7、9。これは、膵島単離プロセスを大幅新生児膵島の機能的特性を保存することを示唆しています。したがって、我々は、これらの島は、遺伝子発現、代謝分析、生存アッセイ、およびストレス応答を含む他のin vitroベースの研究、に適合可能性があることを期待しています。
分離プロセス中に膵島の1外観図。コラゲナーゼ消化後の（A）P1膵臓。比較的大きな島にポイントを矢印。矢頭は、2つの比較的小さな小島を指します。 （B）P1は、第一ラウンドの手摘みの後に膵島。 （C）は 第3ラウンドhandpicking後に小島。 （D）勾配遠心分離後の膵島画分。矢印、大きな島。アローヘッド、小さな島。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コラゲナーゼとInsufficient-または過消化後の2島図。 （A）の下で、消化後の手摘みの島、いくつかの小島（ピンククラスター、矢印）および腺房細胞（ダーククラスター、矢じり）との間の関連に注意してください。 （B）は、ギザギザの表面（矢印）で膵島を注意し、過剰消化後に小島。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. GSIS Resul単離された膵島からのts。提示されたデータは、平均±SEMです。それらは、指示されたグルコース濃度の45分の分析ウィンドウ内のインスリン放出（出発膵島に含まれるインスリンの総量にわたって放出されたインスリンの量）の割合を表します。 ICRマウスからの膵島は、直接手摘みを経由して 、これらのアッセイのために利用されました。 P24島は9、7成熟しているのに対し、P1およびP7の島は、未熟と考えられていたことに注意してください。 P値はt検定を用いて群間で算出されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、従来の灌流のためには小さすぎる膵臓から膵島単離にステップバイステップのプロトコルを提供します。このような等 β細胞の精製、遺伝子発現解析、膵島β細胞の成熟、増殖、細胞ストレス応答、細胞生存率、代謝、機能GSISの維持、などのすべての島ベースの研究のための準備ができて膵島をもたらすことが期待されます。これは、我々の知る限りに、新生仔マウスからの膵島単離を実行するために、新しい研究者を案内する第1の詳細視覚的なプロトコルになります。これらの視覚的な側近がなければ、大規模な試行錯誤が小さな膵臓から成功した膵島単離を達成するために、ほとんどの研究者のために期待されています。
3.8 - 手順3.6で概説されるように成功した膵島単離のための最も重要な要因は、膵臓の消化の適切な度合いです。一般的には、アンダーとオーバー消化の両方が膵島収量が減少します。オーバー消化さらなる妥協膵島アーキテクチャ、MAKそれらは、機能アッセイには不適当ES。最良の消化の結果を達成するために、反応は、常に組織断片化プロセスを視覚化するために監視されなければなりません。コラゲナーゼの各バッチが異なると、出発膵臓の年齢/サイズ深く影響消化プロセスであるため、腺房 - 膵島分離を判断するために、消化の期間にカウントすること、少なくとも信頼できる方法です。アンダー消化の場合には、大規模な内分泌外分泌クラスターは、HBSS中で洗浄することができ、コラゲナーゼで再び消化しました。消化は、次に続け消化の時間を決定するために、解剖顕微鏡下で直接監視することができます。穏やかにピペッティングも側近組織解離するために利用することができます。この場合には、広い開口部のニーズにP1,000先端は膵島アーキテクチャを破壊する可能性がせん断力を軽減する、利用すること。オーバー消化島は、ほとんどのその後の研究のために推奨されていませんが、そのようなcarefuによる遺伝子発現解析などのいくつかのアッセイのために使用することができますリットルを制御します。
上記の注意のほかに、いくつかの手続きの要因に注意を払うことは、さらに、最終的な膵島収量と品質を向上させることができます。非商業的な供給源を利用した場合、最初のCa 2+およびMg 2+、すべてのソリューションに含まれるべきです。これらの陽イオンは、膵島の整合性を維持するために必要です。第二に、活性の高い新鮮なコラゲナーゼ溶液が不可欠です。組織解離のためのより長い時間で低活性の結果とコラゲナーゼ溶液。これは、実質的な外分泌細胞の自己消化と膵島破壊を引き起こします。この目的のために、凍結融解の3以上のラウンドでコラゲナーゼ株式を利用することは推奨されません。第三に、組織洗浄中低速遠心分離が推奨されます。経験則は、プロトコルのステップ4.1で上清中に細胞の破片を維持しながら、細胞クラスターを沈降するのに十分であるAG力（<500×gで）を使用することです。この速度は、膵島を破壊回避するだけでなく、レモに役立つだけでなく、ハンドピッキング時に簡単に島の可視化を可能にするために、細胞破片をVEの。最後に、コラゲナーゼは血清12により不活性化することはできません。このように、洗浄によるその除去は、その後の研究では、膵島の整合性を確保することが不可欠です。
最後に、提示されたプロトコルは、P1からP17に、マウスの膵臓に限定されるべきであることに留意すべきです。これは、P18よりも古い膵臓ではうまく機能しません。これらの古いマウスのための従来の灌流は、より良い収率と健康な膵島のために推奨されます。また、マウスの遺伝的背景や年齢が深く膵島収量13,14に影響を与えます。このため、最適な条件は、通常と期待されている膵臓あたりの膵島の異なる数を、得られます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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