Summary
我们在此描述了一个协议，从新生小鼠分离胰岛完好无损。胰腺被部分用胶原酶消化，接着洗涤和手采摘。 20 - 80胰岛集群可以每胰腺从新生小鼠，这是适合于几个胰岛研究而获得。
Abstract
从大型哺乳动物的胰腺基于灌注胰岛隔离协议确立。这种协议是很容易地在许多实验室由于大尺寸的胰管，允许准备注射胶原酶和随后的组织灌注的进行。与此相反，从小型胰腺胰岛分离，像新生小鼠，是具有挑战性，因为灌注是不容易在小胰腺实现的。在这里，我们描述了从恢复视觉协助新生小鼠胰岛相当数量的详细的简单过程。新鲜解剖整个胰腺用在37℃下溶解在Hanks'平衡盐溶液（HBSS）0.5毫克/毫升胶原酶IV消化，在微量离心管。管定期窃听，以帮助组织扩散。当大部分组织的分散，以小簇约1毫米，裂解物，用10％胎牛血清（FBS）洗涤三到四倍用培养基。胰岛集群，缺乏可识别的腺泡组织，然后可以根据解剖立体镜来回收。这种方法恢复20 - 80小到每个刚出生的小鼠胰腺大型小岛。这些胰岛适合大多数可想到下游测定法，包括胰岛素分泌，基因表达，和培养。呈现胰岛素分泌测定法的实例，以验证隔离过程。遗传背景和消化的程度是决定产量的最大因素。高活性新鲜的胶原酶溶液是首选，因为它在内分泌外分泌隔离艾滋病。阳离子在洗涤所有的解决方案和胎牛血清存在下[钙（Ca 2+）和镁（Mg 2+）] /拾取介质所必需的具有适当的完整性胰岛的良好的产率。具有良好的对比度和放大倍率解剖范围也将有所帮助。
Protocol
动物的使用遵循协议中号规定的程序/一百八十一分之十一由范德比尔特机构动物护理和使用委员会批准谷。 CD1或CBA / BL6小鼠从商业供应商处购买和交叉在范德比尔特动物设施获得新生小鼠。
1.小鼠制备，股票解决方案和设备
- 对于鼠标交叉：成立一个跨鼠标并记录日期堵漏帮助实验计划。 CD1小鼠通常交配后给周围19天诞生。使用CD1或CBA / BL6穿越获得CD1或CBA / BL6新生儿，分别。两条线之间Intercrosses利用CD1雌性和CBA / BL6男性。
- 对于胶原酶股票：体重200毫克IV型胶原酶具有高精确度的平衡。转移至50毫升离心管中。溶解在40ml的HBSS用的 Ca 2+ / Mg 2+离子 （1.26和0.5mM，分别地）做出5毫克/毫升贮备液。
- 允许胶原酶溶解于轻轻摇动约30分钟。分装并保存在-20℃的股票，这对于至少一年保持有效冻结的解决方案。
- 高压灭菌消毒几双镊子，剪刀和P20技巧解剖和胰岛采摘。
- 对于1M的葡萄糖股票：称取9克葡萄糖50毫升离心管中，加入50毫升RPMI 1640媒体溶解葡萄糖。保持在4℃直至使用，但不超过6个月。
2.工作方案
注：胰岛分离的日子，准备以下试剂。
- 对于IV型胶原酶工作液：解冻，并稀释冰上胶原酶股票。免除0.15毫升股票进入各1.7毫升离心管。添加1.35毫升HBSS与钙 /镁离子 。倒置该管5次。留在冰上15分钟。
- 旋转以高速在微量3分钟。转移上清液至新管。留在冰上，直到使用。丢弃不溶性碎片管。
- 对于完全RPMI 1640培养基：添加2.5毫升的1摩尔葡萄糖，50毫升热灭活的FBS和5mL的100×青霉素 - 链霉素库存入500毫升的RPMI 1640培养基。留在冰上，直到使用。
3.胰腺分离和消化
- 安乐死用异氟烷新生儿，根据批准的方案随后断头。
- 搁浅了，肚子朝上鼠标。用70％乙醇消毒喷雾。
- 提起腹部皮肤与镊子和纵向切开皮肤和肌肉层以及一对剪刀的中线，从生殖器区域到肋笼。这将打开腹腔暴露所有的内脏。
- 传输所有内脏100 cm的天线用一对镊子。定位胰腺，这是一个分散的器官与粘附到胃，脾和粘附到十二指肠11腹侧部的背部。 添加HBSS入菜淹没的器官。在溶液中，胰腺组织不再执着于十二指肠，胃或脾。这是因为其典型的白色下解剖范围容易识别。使用一对镊子的从周围组织和传送远离剥离胰腺组织到一个新的60mm培养皿用HBSS。
- 切用剪刀每个胰腺成片比在任何尺寸为5mm小。转移到1.5毫升离心管中。多达五个胰腺（年龄小于P7）可以在一个管被消化。对于P8-P16的小鼠，使用每个胰腺一管。
- 加0.5 - 1毫升胶原酶工作液到每个管（0.2毫升每个P1-P7胰腺使用0.5mL的每个P8-P16胰腺）。留在37℃培养箱管长达15分钟。反转管每分钟两次。
- 〜5分钟后，点击管监视胰腺组织的消化状态。继续消化过程，直到大部分胰腺组织表现为零散的细胞团，直径<2毫米。裂解液出现浑浊，这是由于正常的腺泡细胞自溶。
4.裂解液洗
- 在微型旋转溶解物在500×g离心10秒。用P1,000的Pipetman去除上清层。上清应该出现浑浊，但缺乏细胞团。不使用抽吸，其可以迅速地吸走在底部的组织碎片由于一些粘DNA的存在。
- 加入1毫升RPMI 1640完整的媒体。轻轻拍打管悬浮分散的裂解液。反转向上和向下10倍。重复步骤4.1。
- 重复步骤4.2两次或者直到上清出现明显的。在1毫升完全RPMI 1640培养基重悬水洗胰腺片段。
5.胰岛分离
注：对于胰腺小的数字，直接用手采摘如下（5.1），可用于胰岛ISOL通货膨胀。对于大量的胰腺（> 6），在5.2中列出的方法是首选。
- 直接手工采摘：
- 从步骤4.3传输裂解液60毫米的菜。加入5毫升完全RPMI 1640媒体。在解剖显微镜下把。
- 建立在显微镜明视场照明。调整光强度到最大功率的〜50％。在此条件下，胰岛显示为淡粉红色簇，而腺泡细胞为暗不规则形群集（ 图1A）。 〜50X（结合目标的能力和目镜）的放大倍数，建议提供可视化胰岛的最佳方法，同时将枪头开放采摘。
- 拿起胰岛与P20的枪头，同时避免腺泡集群。分配胰岛富集馏分到一个新的60mm培养皿的RPMI完全培养基（ 图1B）。
- 重复手工采摘过程中的两倍多。离开纯胰岛在新60毫米培养皿用4mL的完全RPMI培养基（ 图1C）。
- 梯度离心法：
- 制备是在10.77克/毫升的密度预装用2mL多聚蔗糖和钠泛影15毫升离心管中。离开冰管，直到使用。
- 传送来自步骤4.3的悬浮液到用巴氏吸管的多聚蔗糖和钠泛影葡胺溶液的顶部。请勿打扰底层。从多达10个新生或2 P17胰腺组织可以加载到每15毫升管中。
- 旋在〜600 XG所述管中的摆动转子15分钟，在4℃。使用制动开关设定。
- 离心后，转移媒体和相间层（请注意，理想的操作条件下，胰岛将位于离心后的多聚蔗糖和培养基之间的相间）到一个新的15毫升管中。加入10 mL媒体，轻轻但调匀 。
- 降速胰岛浓缩部分在300×g离心5分钟。取出洗净媒体。重复洗一次完全RPMI媒体。悬浮颗粒在4毫升媒体，它主要含有胰岛和导管（ 图1D）。
- 手工挑选胰岛如第5.1节所述。
6.化验GSIS在分离的胰岛
- 孵育从步骤5.1.4在完全RPMI培养基的胰岛在37℃组织培养孵化2小时。
- 使用移液管除去在解剖显微镜下的RPMI。添加3与2.8毫米的葡萄糖毫升KRB溶液到板3。摇动10次洗小岛。删除KRB解决方案。
- 重复洗涤过程中一次。孵育用3mL KRB溶液胰岛在37℃在培养箱中1小时。
- 等分试样1毫升KRB到12孔板的每个孔中。预暖KRB的股票和板块37℃的孵化器。
- 与预热KRB洗两次胰岛按照6.2。横贯FER 10胰岛到预热板的各孔中。孵育在37℃培养箱。
- 45分钟后，撤上清50μL的。这包含在基础葡萄糖分泌胰岛素溶液。
- 加入32微升500毫米的葡萄糖。摇动板20倍到该溶液中混合。孵育在37℃培养箱。摇动板5次每隔5分钟。
- 45分钟后，撤50微升上清液。这是高糖分泌胰岛素。
- 传输所有胰岛1.5mL管。冻结在-20℃30分钟。解冻在室温下5分钟。重复冷冻和解冻过程。
- 添加0.5mL的70％乙醇的20mM HCl中。留下过夜。这是留在小岛的胰岛素。
- 用常规ELISA法测定胰岛素水平，先前3所述。
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Representative Results
从每个小老鼠胰腺胰岛80 - 在最佳条件下，该方法可以产生20。这个数量取决于遗传背景，年龄的小鼠，并加以回收胰岛的大小。这些常用的，CD1出孕育和C57BL / 6J纯种小鼠产生比CD1和C57BL / 6或商业B6CBAF1之间的杂交尺寸更小更少的胰岛/ J小鼠做的。直接用手采摘一般了数量较少的小岛，可能是由于小岛排除这可能是很难当外分泌组织（ 图1A-C）混合的认可。梯度离心法可以产生更多的胰岛，包括混合（ 图1D）小小岛。年纪较大的老鼠也产生更多和更大的小岛，因为出生后从持续扩散胰岛预期。有趣的是，回收的胰岛数目并不直接与胰大小有关：CD1小鼠通常比F1 PROG更大胰腺CD1和C57BL的enies / 6J小鼠交配。然而，CD1小鼠通常会产生比F1后代更少的小岛。
无论insufficient-或过度消化在次优的胰岛分离胶原酶结果。在前者的情况下，大的胰岛可以容易地可视化，但某些胰岛不能完全从腺泡组织（ 图2A）分离。这将减少胰岛的产率，但较大的胰岛通常产生的。在后一种情况下，腺泡组织可以完全从胰岛解离。然而，这损害了胰岛结构，导致与粗糙表面（ 图2B）许多小岛。
通过这种方法分离出胰岛新生所预期的胰岛素分泌曲线。例如，P1和P7的胰岛显示高基础胰岛素分泌（ 图3中 ，在2.8毫米的葡萄糖betwee比较胰岛素分泌的水平ÑP1-P7和成熟P24胰岛），未成熟的胰岛β细胞7,9的典型GSIS轮廓。这表明我们的胰岛分离过程很大程度上节约新生儿胰岛的功能特性。因此，我们预计这些小岛有可能适用于其他体外基于研究，包括基因表达，代谢分析，生存试验，和应激反应。
图中的隔离过程中1.外观胰岛。 （A）胶原酶消化后P1胰腺。箭头指向一个比较大的小岛。箭头指向两个比较小的小岛。第一轮手工采摘后（B）P1小岛。 （C）胰岛第三轮后，手工采摘。梯度离心后（D）的胰岛馏分。箭头，大小岛。箭头，一小小岛。 请点击此处查看该图的放大版本。
图Insufficient-或超额胶原酶消化后2小岛。 （A）钦点胰岛下消化后，注意的一些小岛之间（粉红色簇箭头）和腺泡细胞（暗集群，箭头）的关联。 （B）胰岛后过度消化，注意到锯齿状面（箭头）的小岛。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. GSIS Resul从分离的胰岛TS。给出的数据是平均值±SEM。它们代表胰岛素释放（释放超过包含在起始胰岛的胰岛素总量胰岛素的量）的与指示葡萄糖浓度的45分钟测定窗口内的百分比。从ICR小鼠胰岛， 通过直接用手采摘，被用于这些实验。需要注意的是P1和P7胰岛被认为是不成熟的，而P24胰岛成熟7,9。在P值用t检验组之间计算的。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们提供胰岛分离的一步一步的协议，从是传统灌注太小胰腺。据预计产量胰岛准备好所有基于胰岛研究，如β细胞的纯化，基因表达分析，胰岛β细胞的成熟，增殖，细胞应激反应，细胞存活，代谢和功能GSIS维护等 。这将是，以我们所知，第一次详细目视协议，引导新的研究人员从新生小鼠进行胰岛分离的。如果没有这些视觉助手，广泛的试验和错误是预期的大多数研究人员实现了从小型胰腺胰岛成功分离。
对于一个成功的胰岛分离的最关键因素是胰腺消化的正确度如步骤3.6中概述 - 3.8。一般来说，无论不足和过度消化减少胰岛产量。过度消化进一步妥协胰岛架构，麦他们上课不适合功能分析。为了达到最好的消化的结果，该反应必须不断监测到可视化组织破碎过程。指望消化的持续时间来判断腺泡胰岛分离是最不可靠的方法，因为胶原酶每批是不同和起始胰深刻影响消化过程的年龄/大小。在下消化的情况下，大内分泌外分泌集群可以在HBSS洗涤并用胶原酶再次消化。消化然后可在解剖显微镜下直接监测，以确定持续消化的时间。温和移液也可以使用于助手组织离解。在这种情况下，具有广泛的打开需要一P1,000前端被利用，这减轻了剪切力可能破坏胰岛架构。过消化胰岛不推荐用于大多数随后的研究，但可用于某些测定法，如用carefu基因表达分析升控制。
除上述谨慎，注意一些程序因素可以进一步提高最终胰岛产量和质量。首先，钙离子和镁离子中应包括所有的解决方案中，如果被使用的非商业来源。这些阳离子是必要的，以保持胰岛完整性。第二，具有高活性的新鲜胶原酶溶液是必要的。在对组织分离较长时间低活性的结果胶原酶的解决方案。这会导致大量的外分泌细胞自溶和胰岛破坏。为此，不建议使用胶原个股超过三回合冻融。建议组织在洗涤过程中三，低速离心。经验法则是使用AG力（<500 XG）足以沉淀细胞团，而在协议的步4.1上清维持细胞碎片。这个速度不仅避免破坏胰岛细胞，还有助于圣雷莫已经细胞碎片，使手采摘过程中更容易胰岛可视化。最后，胶原酶不能由血清12失活。因此，它的去除通过洗涤是必要的，以确保在以后的研究中胰岛的完整性。
最后，应该指出的是，所提出的协议应当限于小鼠胰腺从P1到P17。它不超过P18年长胰腺工作良好。推荐更好的收益和更健康的胰岛这些老年小鼠常规灌注。另外，小鼠的遗传背景和年龄深刻影响胰岛产量13,14。因此，即使最佳条件将产生不同数量的每胰岛，这是正常的和预期。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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