Summary
Vi beskriver en protokoll her for å isolere intakt holmer fra neonatale mus. Pankreata ble delvis spaltet med kollagenase, fulgt av vasking og håndplukking. 20 - 80 islet klynger kan fås per bukspyttkjertel fra nyfødte mus, som er egnet for flere studier holmen.
Abstract
Perfusjon baserte holme-isolasjon protokoller fra store pattedyr pankreata er godt etablert. Slike protokoller er lett utføres i mange laboratorier på grunn av den store størrelsen på bukspyttkjertelkanalen som gjør det mulig for klar kollagenase injeksjon og perfusjon påfølgende vev. I kontrast, holme isolasjon fra små pankreata, som det av neonatale mus, er utfordrende fordi perfusjon er ikke lett oppnåelig i den lille pankreata. Her beskriver vi en detaljert enkel prosedyre som gjenoppretter et betydelig antall holmer fra nyfødte mus med visuell hjelp. Ferskt dissekert hele pankreata ble spaltet med 0,5 mg / ml kollagenase IV oppløst i Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) ved 37 ° C, i mikrosentrifugerør. Rør ble tappet regelmessig for å hjelpe vev spredning. Når det meste av vevet ble dispergert til små klaser rundt 1 mm, ble lysater vasket tre til fire ganger med kulturmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Holmen klynger,blottet for gjenkjennelige acinar vev, deretter kan utvinnes i henhold dissekere stereoskop. Denne metoden gjenvinner 20-80 små til store øyer pr bukspyttkjertel av nyfødte mus. Disse øyene er egnet for de fleste tenkelige nedstrøms analyser, inkludert insulin sekresjon, genekspresjon, og kultur. Et eksempel på insulinsekresjon analysen er presentert for å validere isolasjonsprosess. Den genetiske bakgrunn og grad av fordøyelse er de største faktorene som bestemmer utbyttet. Nylaget collagenase løsning med høy aktivitet er å foretrekke, som det hjelpemidler i endokrin-eksokrin isolasjon. Nærværet av kationer [kalsium (Ca2 +) og magnesium (Mg2 +)] i alle oppløsninger og føtalt bovint serum i vaske / plukking media er nødvendige for godt utbytte av øyer med riktig integritet. En dissekere omfang med god kontrast og forstørrelse vil også hjelpe.
Protocol
Animal bruk følger prosedyrene angitt i protokollen M / 11/181 godkjent av Vanderbilt Institutional Animal Care og bruk komité for Gu. CD1 eller CBA / BL6 mus ble kjøpt fra kommersielle leverandører og krysset i Vanderbilt dyret anlegget for å få neonatale mus.
1. Utarbeidelse av mus, Stock Solutions og utstyr
- For musa korset: sette opp en mus kors og registrere plugging datoer for å hjelpe forsøksplanlegging. CD1 mus vanligvis føder rundt dag 19 etter parring. Bruk CD1 eller CBA / BL6 krysser å få CD1 eller CBA / BL6 nyfødte, henholdsvis. Intercrosses mellom de to linjene utnytte CD1 hunner og CBA / BL6 menn.
- For kollagenase lager: veier 200 mg kollagenase type IV med en høy presisjonsvekt. Overføring til en 50 ml sentrifugerør. Oppløs i 40 ml HBSS med Ca 2 + / Mg2 + (1,26 og 0,5 mM, respektivt) for å lage et 5 mg / ml stamløsning.
- Tillat kollagenase tiloppløses i ~ 30 minutter med forsiktig risting. Alikvot og holde løsningen fryses på -20 ° C som lager, som forblir aktiv i minst ett år.
- Autoklav å sterilisere flere par pinsett, saks og P20 tips for disseksjon og holme plukking.
- For 1 M glukose lager: veier 9 g glukose i et 50 ml sentrifugerør, tilsett 50 ml RPMI 1640 medium for å oppløse glukose. Hold 4 ° C til bruk, men ikke mer enn 6 måneder.
2. Arbeids Solutions
MERK: Dagen for holmen isolasjon, forberede følgende reagenser.
- For IV fungerende løsning kollagenase Type: tine og fortynne kollagenase lager på is. Tilsett 0,15 ml lager i hver 1,7 ml mikrosentrifugerør. Legg 1,35 ml HBSS med Ca 2+ / Mg 2+. Snu røret 5 ganger. La på is i 15 min.
- Spinner ved høy hastighet i 3 min i en mikrosentrifuge. Overfør supernatanten til et nytt rør. La på is inntil bruk. Kast tuben med uløselig rusk.
- For komplett RPMI 1640 media: legg 2,5 ml 1 M glukose, 50 ml varmeinaktivert FBS, og 5 ml 100x Pen-strep lager i 500 ml RPMI 1640 medium. La på is inntil bruk.
3. Pancreas Isolering og fordøyelse
- Avlive nyfødte med isofluran, etterfulgt av halshogging i henhold til godkjente protokoller.
- Lå musen med buken opp. Spray med 70% etanol for sterilisering.
- Løft magen huden opp med pinsett og kutte hud og muskel lag i lengderetningen langs midtlinjen med en saks, fra underlivet til brystkassen. Dette åpner bukhulen for å avsløre alle indre organer.
- Overfør alle de indre organene til en 100 cm tallerken med en pinsett. Lokaliser bukspyttkjertelen, som er et spredt-organ med et ryggparti som klynger seg til magen og milt og en ventral del som klynger seg til tolvfingertarmen 11. Legg HBSS i formen til å dukke organer. I oppløsning, de pankreatiske vev ikke lenger klamre seg til tolvfingertarmen, mage, eller milt. Det er lett gjenkjennelig under et disseksjonsmikroskop omfang på grunn av dets typiske hvit farge. Bruk en pinsett til å skrelle bukspyttkjertelen vev fra omkringliggende vev og overføre til en ny 60 mm parabolen med HBSS.
- Skjær hver bukspyttkjertelen med en saks i biter mindre enn 5 mm over noen dimensjoner. Overføring til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Opptil fem pankreata (yngre enn P7) kan fordøyes i en tube. For P8-P16 mus, kan du bruke en tube per bukspyttkjertelen.
- Legg 0,5 til 1 ml kollagenase arbeidsløsning til hvert rør (0,2 ml for hver P1-P7 bukspyttkjertel Bruk 0,5 ml for hver P8-P16 bukspyttkjertelen.). La røret i en 37 ° C inkubator i opp til 15 min. Snu røret to ganger hver min.
- Etter ~ 5 min, trykker du på røret for å overvåke fordøyelsen status for bukspyttkjertelen vev. Fortsett fordøyelsen inntil mesteparten av pankreasvev fremstår som fragmentert cellegrupper, med diameter <2 mm. Lysatet vises skyet, noe som skyldes normal acinar celle autolyse.
4. Lysate Vaske
- Spinne løsningen ved 500 xg i 10 sekunder i en mikrosentrifuge. Fjern supernatanten lag med en P1,000 pipetman. Supernatanten skal vises grumset, men blottet for cellegruppene. Ikke bruk aspirasjon, som kan hurtig å suge bort vevfragmenter på bunnen på grunn av tilstedeværelsen av noe klebrig DNA.
- Tilsett 1 ml RPMI 1640 komplett media. Trykk røret forsiktig å resuspendere fragmentert lysat. Snu opp og ned 10 ganger. Gjenta trinn 4.1.
- Gjenta trinn 4.2 to ganger eller inntil den overliggende væske synes klart. Re-suspendere vasket bukspyttkjertelen fragmenter i 1 ml komplett RPMI 1640 media.
5. Islet Isolation
MERK: For lite antall pankreata, direkte hånd-picking som nedenfor (5.1) kan brukes til holme isolasjon. For et stort antall pankreata (> 6), foretrekkes den metode som er beskrevet i 5.2.
- Direkte hånd-plukking:
- Overfør lysat fra trinn 4,3 til 60 mm parabolen. Tilsett 5 ml komplett RPMI 1640 medium. Ta med under et dissekere mikroskop.
- Sett opp den lyse felt belysning på mikroskopet. Juster lysintensiteten til ~ 50% av den maksimale strøm. Under denne tilstanden, holmer fremstå som litt rosa klynger, mens akinærceller som mørke uregelmessig formet klynger (figur 1A). En forstørrelse av ~ 50X (kombinere kraften til målet og øyet stykke) anbefales for å tilby den beste måten å visualisere holmer og pipettespiss åpningen samtidig for å plukke.
- Plukk opp holmer med et P20 pipette tips og samtidig unngå acinar klynger. Dispensere holmer-beriket fraksjoner til en ny 60 mm parabolen med RPMI komplett media (figur 1B).
- Gjenta håndplukkprosessen to ganger mer. La rene holmer i en ny 60mm tallerken med 4 ml komplett RPMI-medium (figur 1C).
- Gradientsentrifugering:
- Forbered en 15 ml sentrifugerør som er forhåndslastet med 2 ml polysucrose og natrium diatrizoat med en tetthet på 1,077 g / ml. La røret på is inntil bruk.
- Overfør suspensjonen fra trinn 4.3 på toppen av polysucrose og natrium- diatrizoat oppløsningen med en Pasteur pipette. Ikke forstyrr bunnlaget. Vev fra opptil 10 nyfødte eller to P17 pankreata kan lastes inn i hver 15 ml tube.
- Spinne røret på ~ 600 xg i en sving rotor i 15 minutter ved 4 ° C. Bruk bremse-off innstillinger.
- Etter sentrifugering overføre media og interfaselagene (merke seg at under ideelle driftsforhold, vil øyene være plassert i grenseflaten mellom polysucrose og dyrkningsmedier etter sentrifugering) inn i en ny 15 ml tube. Tilsett 10 ml media, bland forsiktig, men grundig.
- Spinn ned holmen-anrikede fraksjonved 300 xg i 5 minutter. Fjern vask media. Gjenta vaske en gang med komplett RPMI media. Resuspender pellets i 4 ml media, som inneholder det meste holmer og kanaler (figur 1D).
- Håndplukke holmer som beskrevet i kapittel 5.1.
6. GSIS Analyser i Isolerte holmer
- Inkuber holmer fra trinn 5.1.4 i komplett RPMI-medium i 2 timer i et 37 ° C vevskultur-inkubator.
- Bruk en pipette til å fjerne RPMI under et dissekere mikroskop. Tilsett 3 ml KRB oppløsning med 2,8 mM glukose til platen 3. Swirl 10 ganger for å vaske holmer. Fjern KRB løsninger.
- Gjenta vaskeprosessen gang. Inkuber holmer med 3 ml KRB-løsning ved 37 ° C i 1 time i en inkubator.
- Aliquot 1 ml KRB i hver brønn av en 12-brønns plate. Pre-varme KRB lager og plate til 37 ° C i en inkubator.
- Vask holmer to ganger med forvarmet KRB som i 6.2. transfer 10 holmer til hver brønn i forvarmet plater. Inkuber i en 37 ° C inkubator.
- Etter 45 min, ta ut 50 ul av supernatanten. Dette inneholder insulinoppløsningen utskilt i henhold til basal glukose.
- Legg 32 mL 500 mM glukose. Swirl platen 20 ganger for å blande løsningen. Inkuber i en 37 ° C inkubator. Swirl platen 5 ganger en gang hvert 5 min.
- Etter 45 minutter, ta ut 50 mL supernatant. Dette er insulin utskilt under høy-glukose.
- Overfør alle holmer til et 1,5 ml tube. Fryse på -20 ° C i 30 minutter. Tine ved romtemperatur i 5 min. Gjenta frysing og tining prosess.
- Tilsett 0,5 mL 70% etanol med 20 mM HCl. La over natten. Dette er insulin venstre i holmer.
- Bruk vanlig ELISA til analysen insulin nivåer, beskrevet tidligere tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under optimale forhold kan presenteres metoden gi 20 - 80 holmer fra hver liten mus bukspyttkjertelen. Dette antall avhenger av genetisk bakgrunn, alder på mus, og størrelsen av øyer som skal gjenvinnes. Blant de brukte, CD1 out-avlet og C57BL / 6J renrasede mus produsere mindre holmer med mindre størrelse enn hybrider mellom CD1 og C57BL / 6 eller kommersiell B6CBAF1 / J-mus gjør. Direkte håndplukke generelt ga et mindre antall holmer, sannsynligvis på grunn av utelukkelse av små holmer som kan være vanskelig å føres når blandet med eksokrine vev (Figur 1A-C). Gradientsentrifugering kan gi flere holmer, inkludert mindre holmer i mix (figur 1D). Eldre mus også produsere flere og større holmer, som forventet fra fort holme spredning etter fødselen. Interessant er holmen antall gjenfunnet ikke er direkte korrelert med bukspyttkjertelen størrelse: CD1 mus vanligvis har større bukspyttkjertelen enn F1 progenies av CD1 og C57BL / 6J mus krysset. Likevel CD1 mus vanligvis produserer mindre holmer enn F1 progenies.
Enten insufficient- eller over-fordøyelse med kollagenase fører suboptimal holme isolasjon. I det førstnevnte tilfelle, kan store øyer lett visualisert, men enkelte øyer kan ikke være helt atskilt fra acinar vev (figur 2A). Dette vil redusere utbyttet av holmer, men større øyer er vanligvis produsert. I det sistnevnte tilfellet kan acinar vev være fullstendig dissosiert fra holmer. Men dette kompromitterer holmen struktur, noe som resulterer i mange holmer med grove overflater (figur 2B).
Neonatal holmer isolert ved denne metoden er forventet insulinsekresjon profiler. For eksempel, både P1 og P7 holmer vises høy basal insulinutskillelse (figur 3, sammenligne nivåer av insulin sekresjon på 2,8 mM glukose between P1-P7 og modne P24 holmer), typiske GSIS profiler av umoden holmen beta-cellene 7, 9. Dette tyder på at vår holme isolasjon prosessen bevarer stor grad funksjonelle egenskaper neonatal holmer. Vi forventer derfor at disse holmene er sannsynlig passer for andre in vitro -baserte studier, inkludert genekspresjon, metabolsk analyser, overlevelsesanalyser, og stressresponser.
Figur 1. Utseende av holmer under isolasjonsprosess. (A) P1 pankreata etter kollagenase fordøyelse. Pilen peker på en relativt stor holme. Pilspisser peker på to relativt små holmer. (B) P1 holmer etter første runde hånd-plukking. (C) holmer etter 3. runde handpicking. (D) Islet fraksjoner etter gradientsentrifugering. Arrow, en stor holme. Arrowhead, enliten holme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. holmer etter Insufficient- eller Over- fordøyelsen med Collage. (A) Håndplukket holmer etter under fordøyelsen, merk sammenhengen mellom noen holmer (rosa klynger, piler) og akinærceller (mørke klynger, pilspisser). (B) holmer etter over-fordøyelse, merk holmer med ujevne overflater (piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. GSIS Results fra isolerte holmer. Presenterte data er gjennomsnitt ± SEM. De representerer prosentandelen av insulin release (insulinmengden frigjort i løpet av den totale mengde insulin som inneholdes i utgangs øyer) i løpet av en 45 min analysevindu med angitte glukosekonsentrasjon. Holmer fra ICR mus, via direkte hånd plukking, ble benyttet for disse analysene. Legg merke til at P1 og P7 holmer ble betraktet som umoden, mens P24 holmer er modne 7, 9. P-verdiene beregnes mellom grupper som bruker t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi en steg-for-steg-protokollen på holmen isolasjon fra pankreata som er for små for konvensjonell perfusjon. Det er forventet å gi holmer klar for alle holmen baserte studier som beta-celle rensing, genekspresjonsanalyser, holme beta-cellemodning, spredning, cellestressreaksjoner, celleoverlevelse, metabolisme og funksjonell GSIS vedlikehold, osv. Dette vil være til det beste av vår kunnskap, den første detaljerte visuelle protokoll som guider nye forskere til å utføre holme isolasjon fra neonatale mus. Uten disse visuelle medhjelpere, er omfattende prøving og feiling forventet for de fleste forskere å oppnå vellykket holme isolasjon fra små pankreata.
Den mest kritiske faktoren for en vellykket islet isolasjon er den riktige graden av pankreatisk fordøyelse som beskrevet i trinn 3,6 - 3,8. Generelt, både under- og over fordøyelsen redusere holme yield. Over fordøyelsen ytterligere kompromisser holme arkitektur, som makes dem uegnet for funksjonelle analyser. For å oppnå de beste resultater fordøyelse, har til å bli konstant overvåket for å visualisere vevet fragmenteringsprosessen reaksjonen. Telle på varigheten av fordøyelsen å dømme acinar-holmen separasjon er den minst pålitelige metoden, fordi hvert parti av kollagenase er forskjellige og alder / størrelse på start bukspyttkjertelen dypt påvirker fordøyelsen. Ved under-fordøyelse, kan store hormon eksokrin klynger bli vasket i HBSS og spaltet på nytt med collagenase. Fordøyelsen kan da overvåkes direkte under et disseksjonsmikroskop for å bestemme tidspunktet for fortsatt spaltning. Forsiktig pipettering kan også benyttes for å aide vev dissosiasjon. I dette tilfellet, en P1,000 spiss med bred åpning behov benyttes, noe som reduserer skjærkraften som kunne ødelegge holmen arkitekturen. Over-spaltet bitene ikke anbefales for de fleste etterfølgende studier, men kan brukes for noen analyser, for eksempel genekspresjonsanalyser med careful kontroller.
Foruten de ovennevnte forsiktighet, betaler oppmerksomhet til flere prosessuelle forhold kan ytterligere forbedre den endelige holmen utbytte og kvalitet. Først Ca 2+ og Mg 2+ bør inkluderes i alle løsninger, hvis ikke-kommersielle kilder ble benyttet. Disse kationer er nødvendig for å opprettholde integriteten holme. For det andre, friske kollagenaseoppløsning med høy aktivitet er viktig. Collagenase løsning med lav aktivitet resulterer i en lengre tid for vev dissosiasjon. Dette fører til betydelig eksokrin celle autolyse og holme ødeleggelse. For dette formål, utnytte kollagenaseklassene aksjer med mer enn tre runder med frysing-tining anbefales ikke. For det tredje, lavhastighetssentrifugering i løpet av vev vasking anbefales. Tommelfingerregelen er å bruke ag kraft (<500 xg) som er tilstrekkelig til å sedimentere den cellegruppene samtidig opprettholde celleavfall i supernatanten i trinn 4.1 i protokollen. Denne hastigheten ikke bare unngår å ødelegge holmer, men også bidrar til å remove celleavfall for å muliggjøre enklere holme visualisering under håndplukking. Til slutt kan kollagenase ikke bli inaktivert av serum 12. Således er dens fjerning ved vasking avgjørende for å sikre integritet islet i senere studier.
Til slutt bør det legges merke til at den presenterte protokollen bør begrenses til mus pankreata fra P1 til P17. Det fungerer ikke godt for pankreata eldre enn P18. Konvensjonell perfusjon for disse eldre mus anbefales for bedre avlinger og sunnere holmer. Videre er genetisk bakgrunn og alder av mus dypt påvirke holmen avkastning 13,14. Derfor vil selv optimale forhold gi forskjellig antall øyer pr bukspyttkjertelen, som er normal og forventet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I.
