Summary
Vi beskriver ett protokoll häri för att isolera intakta cellöar från neonatala möss. Pankreata rades partiellt med kollagenas, följt av tvättning och handplockning. 20 - 80 ö kluster kan erhållas per bukspottkörtel från nyfödda möss, som lämpar sig för flera ö studier.
Abstract
Perfusion baserad ö-isolering protokoll från stora däggdjur pancreata är väl etablerade. Sådana protokoll kan lätt utföras i många laboratorier på grund av den stora storleken på den pankreatiska gången som möjliggör klar kollagenas injektion och efterföljande vävnadsperfusion. Däremot holme isolering från små pankreata, i likhet med neonatala möss, är en utmaning eftersom perfusion är inte lätt att uppnå i den lilla pancreata. Här beskriver vi en detaljerad enkel procedur som återvinner betydande antal öar från nyfödda möss med visuell hjälp. Färskt dissekerade hela pankreata digererades med 0,5 mg / ml kollagenas IV löst i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) vid 37 ° C, i mikrocentrifugrör. Rören knackade regelbundet för att underlätta vävnads spridning. När det mesta av vävnaden dispergerades till små kluster runt en mm, var lysat tvättades tre till fyra gånger med odlingsmedium med 10% fetalt bovint serum (FBS). Ö kluster,saknar igenkännbara körtelvävnad, kan därefter utvinnas enligt dissekera stereoskop. Denna metod återvinner 20-80 små till stora öar per bukspottkörteln hos nyfödda mus. Dessa öar är lämpliga för de flesta tänkbara nedströms analyser, inklusive insulinutsöndring, genuttryck, och kultur. Ett exempel på insulinsekretion assay presenteras för att validera isoleringsprocessen. Den genetiska bakgrunden och utrötningsgraden är de största faktorer som avgör avkastningen. Nyligen gjorde kollagenas lösning med hög aktivitet är att föredra, eftersom det underlättar hormon exokrin isolering. Närvaron av katjoner [kalcium (Ca2 +) och magnesium (Mg2 +)] i alla lösningar och fetalt bovint serum i tvätt / plocka medier är nödvändiga för gott utbyte av öar med rätt integritet. En dissekera omfattning med bra kontrast och förstoring kommer också att hjälpa.
Protocol
Användningen av djur följer de förfaranden som anges i protokollet M / 11/181 godkändes av Vanderbilt Institutional Animal Care och användning kommittén för Gu. CD1 eller CBA / BL6-möss köptes från kommersiella leverantörer och korsade i Vanderbilt djurfaciliteten för att erhålla neonatala möss.
1. Beredning av möss, lagerlösningar, och utrustning
- För musen inlägg: inrätta en mus kors och registrera plugg datum för att underlätta försöksplanering. CD1 möss brukar ge födelse runt dag 19 efter parning. Använd CD1 eller CBA / BL6 korsar att erhålla CD 1 eller CBA / BL6 nyfödda, respektive. Intercrosses mellan de två linjerna använder CD1 honor och CBA / BL6 hanar.
- För kollagenas lager: väger 200 mg kollagenas typ IV med en hög precision balans. Överför till en 50 ml centrifugrör. Lös upp i 40 ml HBSS med Ca2 + / Mg2 + (1,26 och 0,5 mM, respektive) för att göra en 5 mg / ml stamlösning.
- Tillåt kollagenas tilllösa för ~ 30 min med försiktig skakning. Alikvotera och hålla lösningen frystes i -20 ° C som lager, som förblir aktiv under åtminstone ett år.
- Autoklav för att sterilisera flera par pincett, sax och P20 tips för dissekering och holme plockning.
- För ett M glukos lager: väga 9 g glukos i en 50 ml centrifugrör, tillsätt 50 ml RPMI 1640-medium för att lösa upp glukos. Håll 4 ° C fram till användning, men inte mer än 6 månader.
2. Arbetslösningar
OBS: Dagen för holme isolering, förbereda följande reagenser.
- För kollagenas typ IV fungerande lösning: tina och späd kollagenas lager på is. Fördela 0,15 ml lager i varje 1,7 ml mikrofugrör. Lägg 1,35 ml HBSS med Ca2 + / Mg2 +. Invertera röret 5 gånger. Låt på is under 15 minuter.
- Snurra vid hög hastighet under 3 min i en mikrocentrifug. Överför supernatanten till ett nytt rör. Lämna på is fram till användning. Kassera röret med olösligt skräp.
- För fullständigt RPMI 1640 media: tillsätt 2,5 ml 1 M glukos, 50 ml värmeinaktiverat FBS, och 5 ml 100x Pen-strep-lager i 500 ml RPMI 1640-medium. Lämna på is fram till användning.
3. Pankreas Isolering och matsmältning
- Avliva nyfödda med isofluran, följt av halshuggning enligt godkända protokoll.
- Placera musen med buken uppåt. Spray med 70% etanol för sterilisering.
- Lyft magen huden upp med pincett och skära in i huden och muskellager i längdriktningen längs mittlinjen med en sax, från underlivet till bröstkorgen. Detta öppnar bukhålan för att exponera alla inre organ.
- Överför alla de inre organen till en 100 cm skålen med en pincett. Lokalisera bukspottkörteln, som är en utspridda-orgel med en dorsal del som klamrar sig fast vid magen och mjälten och en ventral del som klamrar sig fast vid tolvfingertarmen 11. Lägg HBSS i skålen att dränka organ. I lösning de pankreatiska vävnader inte längre håller fast vid tolvfingertarmen, magen, eller mjälte. Det är lätt att känna igen under en dissekera omfattning på grund av sin typiska vita färgen. Använd en pincett att skala pankreas vävnader bort från omgivande vävnad och förflyttas till en ny 60 mm skålen med HBSS.
- Skär varje bukspottkörteln med en sax i bitar mindre än 5 mm över alla dimensioner. Överför till en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Upp till fem pancreata (yngre än P7) kan brytas ned i ett rör. För P8-P16 möss, använda ett rör per bukspottkörteln.
- Lägg 0,5-1 ml kollagenas arbetslösning till varje rör (0,2 ml för varje P1-P7 bukspottkörteln Använd 0,5 ml för varje P8-P16 bukspottkörteln.). Lämna röret i en 37 ° C inkubator under upp till 15 min. Vänd röret två gånger varje minut.
- Efter ~ 5 minuter trycker röret för att övervaka uppslutningen status pankreasvävnad. Fortsätta rötningsprocessen tills det mesta av den pankreatiskavävnad verkar som splittrade cellkluster, med diameter <2 mm. Lysatet visas grumlig, vilket beror på normal acinar cell autolys.
4. Lysat Tvättning
- Snurra lysatet vid 500 xg under 10 s i en mikrocentrifug. Ta bort det översta skiktet med en P1,000 pipetman. Supernatanten ska visas grumlig men saknar cellkluster. Använd inte aspiration, som snabbt kan aspirera bort vävnadsfragment i botten på grund av närvaron av vissa klibbiga DNA.
- Tillsätt 1 ml RPMI 1640 komplett medium. Knacka röret försiktigt för att suspendera fragmenterad lysatet. Invertera upp och ner 10 gånger. Upprepa steg 4,1.
- Upprepa steg 4,2 två gånger eller tills supernatanten visas tydligt. Återsuspendera tvättade pankreasfragment i 1 ml komplett RPMI 1640 medier.
5. Islet Isolering
OBS: För ett litet antal pankreata, direkt hand plocka enligt nedan (5,1) kan användas för holme isolation. För ett stort antal pancreata (> 6), den metod som beskrivs i 5,2 är föredraget.
- Direkt handplockning:
- Överför lysat från steg 4,3 till en 60 mm skål. Tillsätt 5 ml komplett RPMI 1640-medium. Ta under ett dissektionsmikroskop.
- Inrätta den ljusa fältbelysningen på mikroskopet. Justera ljusintensiteten till ~ 50% av den maximala effekten. Under detta tillstånd, holmar visas som något rosa kluster, medan acinarceller som mörka oregelbundet formade kluster (Figur 1A). En förstoring av ~ 50X (kombinerar kraften i målet och okularet) rekommenderas att erbjuda det bästa sättet att visualisera öar och pipettspetsen öppningen samtidigt för att plocka.
- Plocka upp öar med en P20 pipett och samtidigt undvika körtel kluster. Fördela holmar berikade fraktioner till en ny 60 mm skål med RPMI komplett medium (Figur 1B).
- Upprepa handplockprocessen två gånger. Lämna rena skär i en ny 60mm skål med 4 ml fullständigt RPMI-medium (Figur 1C).
- Gradientcentrifugering:
- Bered en 15 ml centrifugrör som är förladdad med 2 ml polysackaros och natrium diatrizoat vid en densitet av 1,077 g / ml. Lämna röret på is fram till användning.
- Överför suspensionen från steg 4,3 på toppen av polysackaros och natrium diatrizoat lösning med en Pasteur-pipett. Stör inte bottenskiktet. Vävnader från upp till 10 nyfödda eller två P17 pancreata kan laddas i varje 15 ml rör.
- Snurra röret vid ~ 600 xg i en swing-rotor under 15 minuter vid 4 ° C. Använd broms-off inställningar.
- Efter centrifugering, överföring media och interfas lager (observera att under ideala driftsförhållanden, kommer öarna placeras i interfas mellan polysackaros och odlingsmedia efter centrifugering) i en ny 15 ml tub. Tillsätt 10 ml media, blanda försiktigt men grundligt.
- Centrifugera ner holmen-anrikade fraktionenvid 300 xg under 5 min. Ta bort tvättmediet. Upprepa tvätta en gång med komplett RPMI-medium. Resuspendera pellets i 4 ml medium, som innehåller mestadels öar och kanaler (figur 1D).
- Handplocka de holmar som beskrivs i avsnitt 5.1.
6. GSIS Analyser i isolerade öar
- Inkubera cellöarna från steg 5.1.4 i kompletta RPMI-medium under 2 h i en 37 ° C vävnadsodlingsinkubator.
- Använd en pipett för att ta bort RPMI under ett dissektionsmikroskop. Tillsätt 3 ml KRB lösning med 2,8 mM glukos till plattan 3. Snurra 10 gånger för att tvätta öarna. Avlägsna KRB lösningar.
- Upprepa tvättningsprocessen en gång. Inkubera cellöarna med 3 ml KRB-lösning vid 37 ° C under 1 h i en inkubator.
- Alikvot 1 ml KRB i varje brunn i en 12-brunnars platta. Pre-värma KRB lager och platta till 37 ° C i en inkubator.
- Tvätta öarna två gånger med förvärmda KRB som i 6.2. Transfer 10 öar till varje brunn i förvärmda plattor. Inkubera i en 37 ° C inkubator.
- Efter 45 min, ta ut 50 mikroliter av supernatanten. Detta innehåller insulinlösningen utsöndras i basal glukos.
- Lägg 32 mikroliter 500 mM glukos. Snurra plattan 20 gånger för att blanda lösningen. Inkubera i en 37 ° C inkubator. Snurra plattan 5 gånger en gång per 5 min.
- Efter 45 minuter, ta ut 50 mikroliter supernatant. Detta är det insulin som utsöndras under högt glukos.
- Överför alla holmar till en 1,5 ml rör. Frysa i -20 ° C i 30 min. Tina vid rumstemperatur under 5 min. Upprepa frysning och upptiningen.
- Tillsätt 0,5 ml 70% etanol med 20 mM HCl. Lämna över natten. Detta är den insulin kvar i cellöar.
- Använd konventionell ELISA att analysera insulinnivåer, som beskrivits tidigare tre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under optimala förhållanden kan presenteras metoden ger 20 - 80 öar från varje liten mus bukspottkörteln. Detta antal beror på den genetiska bakgrunden, ålder möss, och storleken på öar som skall återvinnas. Bland de vanligaste, CD1 ut födda och C57BL / 6J renrasiga möss producerar mindre öar med mindre storlek än hybrider mellan CD1 och C57BL / 6 eller kommersiell B6CBAF1 / J-möss gör. Direkt handen plocka allmänhet gav ett mindre antal öar, sannolikt på grund av uteslutandet av små öar som kan vara svårt att redovisas när de blandas med exokrina vävnader (Figur 1A-C). Gradientcentrifugering kan ge fler öar, även mindre öar i blandningen (figur 1D). Äldre möss producerar även fler och större öar, som väntat från fortsatt holme proliferation efter födseln. Intressant är holmen antalet återvunna inte direkt korrelerad med bukspottkörteln storlek: CD1 möss har oftast större bukspottkörteln än F1 progenies av CD1 och C57BL / 6J möss passerar. Ändå CD1 möss producerar vanligtvis mindre öar än F1 avkommor.
Antingen insufficient- eller över uppslutning med kollagenas resulterar i suboptimal holme isolering. I det förra fallet, kan stora öar lätt visualiseras, men vissa cellöar kan inte vara helt åtskilda från acinära vävnader (Figur 2A). Detta kommer att minska utbytet av cellöar, men större öar är vanligtvis produceras. I det senare fallet kan acinar vävnad helt skiljas från öar. Men detta äventyrar holmen struktur, vilket resulterar i många öar med ojämna ytor (Figur 2B).
Neonatala öar isolerade med denna metod har väntat insulinsekre profiler. Till exempel, både P1 och P7 holmar visas hög basal insulinutsöndring (Figur 3, jämföra halterna av insulinutsöndring vid 2,8 mM glukos between P1-P7 och mogna P24 öar), typiska GSIS profiler av omogna betacellerna 7, 9. Detta tyder på att vår ö-isoleringsprocessen till stor del bevarar de funktionella egenskaperna hos neonatala öar. Vi förväntar oss därför att dessa öar är sannolikt passform för andra in vitro baserade studier, inklusive genuttryck, metabolisk analyser, överlevnadsanalyser och stressreaktioner.
Figur 1. Utseende av cellöar under isoleringsprocessen. (A) P1 pancreata efter kollagenas matsmältningen. Pilen pekar på en relativt stor holme. Pilspetsar pekar på två relativt små öar. (B) P1 cellöar efter första omgången handplockning. (C) Islets efter 3: e omgången handplockar. (D) Islet fraktioner efter gradientcentrifugering. Pil, en stor holme. Arrowhead, enliten holme. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. cellöar efter Insufficient- eller Över- digerering med kollagenas. (A) Handplockade öar efter under matsmältning, notera sambandet mellan vissa holmar (rosa kluster, pilar) och körtelceller (mörka kluster, pilspetsar). (B) cellöar efter över matsmältning, notera öarna med ojämna ytor (pilar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. GSIS Results från isolerade öar. Presenterade uppgifterna är medelvärde ± SEM. De representerar andelen insulinfrisättning (mängden insulin frigörs över den totala mängden insulin som finns i start öar) inom en 45 min analysfönster med angivna glukoskoncentration. Öar från ICR-möss, via direkt handen plockning, användes för dessa analyser. Observera att P1 och P7 öar ansågs omogen, medan P24 öar är mogna 7, 9. P-värden beräknas mellan grupperna enligt t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi en steg-för-steg-protokollet på holme isolering från pancreata som är för små för konventionell perfusion. Det förväntas att ge öar redo för alla ö baserade studier såsom beta-cell rening, genuttryck analys, ö betacellmognad, proliferation, cellstressreaktioner, cellöverlevnad, metabolism, och funktionell GSIS underhåll etc. Detta kommer att vara till det bästa av vår kunskap, den första detaljerade visuella protokoll som guidar nya forskare att utföra holme isolering från neonatala möss. Utan dessa visuella medhjälpare är omfattande trial and error beräknas för de flesta forskare att uppnå framgångsrik holme isolering från små pancreata.
Den mest kritiska faktorn för en framgångsrik islet isolering är rätt grad av pankreatisk digestion som beskrivits i steg 3.6 - 3,8. I allmänhet, både under- och över matsmältning minska holme avkastning. Över-matsmältningen ytterligare kompromisser holme arkitektur, som makes dem olämpliga för funktionella analyser. För att uppnå bästa matsmältning resultat, har reaktionen ständigt övervakas för att visualisera vävnadssönderdelning. Räkna på hur länge matsmältningen att bedöma acinar-ö separation är den minst pålitliga metoden, eftersom varje sats av kollagenas är annorlunda och ålder / storlek av utgångs bukspottkörteln djupt påverkar matsmältningen. Vid under matsmältning, kan stora hormon exokrin kluster tvättas i HBSS och diger igen med kollagenas. Uppslutningen kan sedan övervakas direkt under ett dissektionsmikroskop för att bestämma tidpunkten för fortsatt digerering. Försiktig pipettering kan också utnyttjas för att aide vävnadsdissociering. I det här fallet, en P1,000 spets med bred öppning behov utnyttjas, vilket minskar skjuvkraften som kan förstöra holmen arkitektur. Över-digererad cellöar rekommenderas inte för de flesta efterföljande studier, men kan användas för en del analyser, såsom genuttryck analys med careful kontroller.
Förutom ovanstående försiktighet, att uppmärksamma flera procedur faktorer kan ytterligare förbättra den slutliga holmen avkastning och kvalitet. Först Ca2 + och Mg 2+ bör ingå i alla lösningar, om icke-kommersiella källor användes. Dessa katjoner är nödvändiga för att upprätthålla holme integritet. För det andra är viktigt färsk kollagenas lösning med hög aktivitet. Kollagenaslösning med låga aktivitet resulterar i en längre tid för vävnads dissociation. Detta medför betydande exokrin cell autolys och holme förstörelse. För detta ändamål utnyttjar kollagenas aktier med mer än tre omgångar frysning-upptining rekommenderas inte. Tredje, låghastighetscentrifugering under vävnads tvättning rekommenderas. Tumregeln är att använda ag kraft (<500 xg) som är tillräcklig för att sedimentera cellkluster medan upprätthålla cellrester i supernatanten i steg 4.1 i protokollet. Denna hastighet inte bara undviker att förstöra öar, men bidrar också till att Remove celldebris att göra det lättare holme visualisering under handen plockning. Slutligen kan kollagenas inte inaktiveras av serum 12. Således är viktigt att de tas bort genom tvättning för att säkerställa holme integritet i senare studier.
Slutligen bör det noteras att den presenterade protokollet bör begränsas till mus bukspottkörtlar från P1 till P17. Det fungerar inte bra för pancreata äldre än P18. Konventionell perfusion för dessa äldre möss rekommenderas för bättre avkastning och friskare holmar. Dessutom genetisk bakgrund och ålder av möss djupt påverka holmen avkastning 13,14. Därför kommer även optimala förutsättningar att ge olika antal öar per bukspottkörteln, vilket är normalt och förväntat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , C.R.C. Press. (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I.
