Summary
Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.
Abstract
protocolos de islotes de aislamiento a base de perfusión de grandes páncreas de mamíferos están bien establecidos. Tales protocolos se llevan a cabo fácilmente en muchos laboratorios, debido al gran tamaño del conducto pancreático que permite la inyección de colagenasa listo y la perfusión tisular subsiguiente. En contraste, el aislamiento de los islotes de páncreas pequeña, como la de los ratones recién nacidos, es un reto porque la perfusión no se puede lograr fácilmente en la pequeña páncreas. Aquí se describe un procedimiento sencillo detallada que recupera un número sustancial de los islotes de ratones recién nacidos con asistencia visual. Recién diseccionado páncreas entero se digirió con 0,5 mg / ml de colagenasa IV disuelto en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) a 37 ° C, en tubos de microcentrífuga. Los tubos se intervenidos con regularidad para ayudar a la dispersión del tejido. Cuando la mayor parte del tejido se dispersó a pequeños grupos alrededor de 1 mm, los lisados se lavaron de tres a cuatro veces con medios de cultivo con 10% de suero bovino fetal (FBS). racimos de islotes,desprovisto de tejidos acinares reconocibles, a continuación, se pueden recuperar bajo disección estereoscopio. Este método recupera 20 - 80 pequeño a islotes de gran tamaño por el páncreas de ratón recién nacido. Estos islotes son adecuados para los ensayos de aguas abajo más concebibles, incluyendo la secreción de insulina, la expresión génica, y la cultura. Un ejemplo de ensayo de secreción de insulina se presenta para validar el proceso de aislamiento. Los antecedentes genéticos y el grado de digestión son los factores más importantes que determinan el rendimiento. Se prefiere solución de colagenasa recién hecha con alta actividad, ya que ayuda en el aislamiento endocrino-exocrino. La presencia de cationes [calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg 2+)] en todas las soluciones y suero fetal bovino en el lavado / medios de picking son necesarios para un buen rendimiento de islotes con integridad adecuada. Un microscopio de disección con un buen contraste y la ampliación también ayudará.
Protocol
el uso de animales sigue los procedimientos especificados en el protocolo M / 11/181 aprobada por la Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo de Gu. ratones CD1 o CBA / Bl6 fueron adquiridos de proveedores comerciales y se cruzaron en las instalaciones de animales de Vanderbilt para obtener ratones recién nacidos.
1. Preparación de los ratones, las soluciones concentradas y equipo
- Por la cruz del ratón: configurar una cruz ratón y registrar las fechas de taponamiento para ayudar a la planificación experimental. ratones CD1 por lo general dan a luz alrededor del día 19 después del apareamiento. Uso CD1 o CBA / Bl6 cruces para obtener CD1 o CBA / Bl6 neonatos, respectivamente. Intercrosses entre las dos líneas utilizan hembras y machos CD1 CBA / Bl6.
- Para el caldo de colagenasa: se pesan 200 mg de colagenasa tipo IV con un equilibrio de alta precisión. Transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml. Disolver en 40 ml de HBSS con Ca 2 + / Mg2 + (1,26 y 0,5 mM, respectivamente) para hacer una solución de 5 mg / mL.
- Permitir a la colagenasadisuelva durante ~ 30 min con agitación suave. Alícuota y mantener la solución congelada en -20 ° C como acciones, que permanece activo durante al menos un año.
- Autoclave para esterilizar varios pares de pinzas, tijeras y consejos P20 para la disección y la recolección de los islotes.
- Para la glucosa stock 1 M: se pesan 9 g de glucosa en un tubo de centrífuga de 50 ml, añadir 50 ml de medio RPMI 1640 para disolver la glucosa. Tenga en 4 ° C hasta su uso, pero no más de 6 meses.
2. Soluciones de Trabajo
NOTA: El día de aislamiento de islotes, preparar los siguientes reactivos.
- Para la solución de trabajo de colagenasa tipo IV: descongelación y se diluye colagenasa de valores en hielo. Prescindir de 0,15 ml de stock en cada tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Añadir 1,35 ml de HBSS con Ca2 + / Mg2 +. Invierta el tubo 5 veces. Deja en hielo durante 15 min.
- Girar a alta velocidad durante 3 minutos en una microcentrífuga. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Deja en hielo hasta su uso. Desechar el tubo con los restos insolubles.
- Para una completa medios RPMI 1640: añadir 2,5 ml de glucosa 1 M, 50 ml de FBS inactivado por calor, y 5 ml de stock 100x pen-strep en 500 ml de RPMI 1640. Deja en hielo hasta su uso.
3. Aislamiento de páncreas y la digestión
- La eutanasia a los recién nacidos con isoflurano, seguido por decapitación de acuerdo a los protocolos aprobados.
- Coloque el ratón con el vientre hacia arriba. Rociar con 70% de etanol para la esterilización.
- Levantar la piel del vientre con pinzas y cortar las capas de piel y músculo longitudinalmente a lo largo de la línea media con un par de tijeras, de la zona genital a la caja torácica. Esto abre la cavidad abdominal para exponer todos los órganos internos.
- Transferencia de todos los órganos internos a una placa de 100 cm con un par de pinzas. Busque el páncreas, que es un órgano dispersa con una porción dorsal que se pega al estómago y el bazo y una porción ventral que se aferra al duodeno 11. Añadir HBSS en el plato para sumergir los órganos. En la solución, los tejidos pancreáticos ya no se aferran al duodeno, estómago, o el bazo. Es fácilmente reconocible bajo un microscopio de disección debido a su típico color blanco. Use un par de pinzas para pelar los tejidos pancreáticos lejos de tejido y transferencia que rodea a una nueva placa de 60 mm con HBSS.
- Cortar cada páncreas con una tijera en trozos de menos de 5 mm a través de cualquier dimensión. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Hasta cinco páncreas (menores de P7) pueden ser digeridos en un solo tubo. Para los ratones P8-P16, utilizar un tubo por el páncreas.
- Añadir 0,5 - solución de trabajo de 1 ml de colagenasa a cada tubo (0,2 ml para cada páncreas P1-P7 Use 0,5 ml para cada páncreas P8-P16.). Deje el tubo en una incubadora a 37 ° para un máximo de 15 min. Invierta el tubo dos veces cada minuto.
- Después de ~ 5 min, toque el tubo para supervisar el estado de la digestión del tejido pancreático. Continuar el proceso de digestión hasta que la mayor parte del páncreasel tejido aparece como racimos de células fragmentadas, con un diámetro <2 mm. El lisado aparecerá nublado, lo cual es debido a la autolisis de las células acinares normales.
4. Lavado lisado
- Girar el lisado a 500 xg durante 10 s en una microcentrífuga. Eliminar la capa sobrenadante con un Pipetman P1,000. El sobrenadante debería aparecer turbia pero desprovisto de grupos de células. No utilice aspiración, que puede aspirar rápidamente lejos los fragmentos de tejido en la parte inferior debido a la presencia de algo de ADN pegajoso.
- Añadir 1 ml de RPMI 1640 completo. Toque en el tubo suavemente para resuspender el lisado fragmentada. Invertir arriba y hacia abajo 10 veces. Repita el paso 4.1.
- Repita el paso 4.2 dos veces más o hasta que el sobrenadante aparece clara. Vuelva a suspender fragmentos de páncreas lavados en 1 ml de RPMI 1640 completo de los medios.
5. aislamiento Islet
NOTA: Para un pequeño número de páncreas, directa la recolección manual de la siguiente manera (5.1) se puede utilizar para el aislador del isloteación. Para un gran número de páncreas (> 6), se prefiere el método descrito en 5.2.
- la recolección manual directa:
- Transferir el lisado de la etapa 4.3 a un plato de 60 mm. Añadir 5 mL RPMI completo 1640. Poner bajo un microscopio de disección.
- Configurar la iluminación de campo brillante en el microscopio. Ajustar la intensidad de la luz a ~ 50% de la potencia máxima. Bajo esta condición, islotes aparecen como conglomerados ligeramente de color rosa, mientras que las células acinares racimos de forma irregular como oscuros (Figura 1A). Se recomienda una magnificación de 50X ~ (que combina la potencia del objetivo y el ocular) para ofrecer la mejor manera de islotes visualización y la abertura de la punta de la pipeta para recoger de forma simultánea.
- Recoger islotes con una punta de pipeta P20 evitando al mismo tiempo las agrupaciones acinares. Fracciones dispensar islotes-enriquecidos a una nueva placa de 60 mm con RPMI completo los medios de comunicación (Figura 1B).
- Repita el proceso de la recolección manual dos veces más. Deja islotes puros en una nueva 60mm placa con 4 medios RPMI completo mL (Figura 1C).
- centrifugación en gradiente:
- Preparar un tubo de centrífuga de 15 ml que se carga con 2 ml polisucrosa y diatrizoato de sodio a una densidad de 1,077 g / ml. Deje el tubo en hielo hasta su uso.
- Transferir la suspensión de la etapa 4.3 en la parte superior de la solución de diatrizoato polisucrosa y sodio con una pipeta Pasteur. No moleste a la capa inferior. Los tejidos de hasta 10 recién nacido o 2 P17 páncreas se pueden cargar en cada tubo de 15 mL.
- Girar el tubo a ~ 600 xg en un rotor basculante durante 15 min a 4 ° C. Usar una configuración de freno desactivado.
- Después de la centrifugación, la transferencia de los medios de comunicación y las capas de interfase (tenga en cuenta que, en condiciones ideales de funcionamiento, los islotes se encuentran en la interfase entre los medios de comunicación y la cultura polisucrosa después de la centrifugación) en un nuevo tubo de 15 ml. Añadir 10 ml de medio, mezclar suavemente pero a fondo.
- Centrifugar la fracción enriquecida en los islotesa 300 xg durante 5 min. Retire el medio de lavado. Repetir el lavado una vez más con medio RPMI completo. Volver a suspender las pellas en 4 ml de los medios de comunicación, que contiene en su mayoría islotes y conductos (Figura 1D).
- Recoger a mano los islotes como se indica en la sección 5.1.
6. Los ensayos GSIS en islotes aislados
- Incubar los islotes de la etapa 5.1.4 en medio RPMI completo durante 2 h en un incubador de cultivo de tejidos 37 °.
- Utilizar una pipeta para eliminar RPMI con un microscopio de disección. Añadir 3 ml de solución KRB con 2,8 mM de glucosa a la placa 3. Agitar 10 veces para lavar los islotes. Retire soluciones KRB.
- Repetir el proceso de lavado una vez. Incubar los islotes con 3 ml de solución KRB a 37 ° C durante 1 h en una incubadora.
- Alícuota 1 ml de KRB a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Pre-calentar la población de KRB y la placa a 37 ° C en una incubadora.
- Lavar los islotes dos veces con KRB pre-calentado como en 6.2. Transfer 10 islotes a cada pocillo de las placas pre-calentado. Incubar en una incubadora a 37ºC.
- Después de 45 min, retirar 50 l de sobrenadante. Este contiene la solución de insulina secretada bajo de glucosa basal.
- Añadir 32 l de glucosa 500 mM. Agitar la placa 20 veces para mezclar la solución. Incubar en una incubadora a 37ºC. Agitar la placa 5 veces, una vez cada 5 minutos.
- Después de 45 min, retirar 50 l sobrenadante. Esta es la insulina secretada bajo alta glucosa.
- Transferir todos los islotes a un tubo de 1,5 ml. Congelar en -20 ° C durante 30 min. Descongelar a temperatura ambiente durante 5 min. Repetir el proceso de congelación y descongelación.
- Añadir 0,5 ml de 70% de etanol con HCl 20 mM. Dejar toda la noche. Esta es la insulina que queda en los islotes.
- Usar ELISA convencional para someter a ensayo los niveles de insulina, se ha descrito previamente 3.
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Representative Results
En condiciones óptimas, el método presentado puede rendimiento del 20 - 80 islotes de cada pequeño páncreas de ratón. Este número depende de los antecedentes genéticos, la edad de los ratones, y el tamaño de los islotes que debe recuperarse. Entre los de uso común, CD1 fuera criado y / 6J de pura raza C57BL producen menos islotes con un tamaño más pequeño que los híbridos entre CD1 y C57BL / 6 o comercial B6CBAF1 / J ratones hacen. Mano directa recogiendo generalmente dio un menor número de islotes, probablemente debido a la exclusión de los pequeños islotes que podría ser difícil de reconocer cuando se mezcla con tejidos exocrinas (Figura 1A-C). Centrifugación en gradiente puede rendir más islotes, incluyendo islotes más pequeños de la mezcla (Figura 1D). Los ratones más viejos también producen más y más grandes islotes, como se espera de la proliferación de los islotes continuado después del nacimiento. Curiosamente, el número de islotes recuperado no está directamente relacionado con el tamaño del páncreas: ratones CD1 por lo general tienen más grande que el páncreas prog F1Enies de CD1 y C57BL / 6J cruzar. Sin embargo, ratones CD1 generalmente producen menos islotes que las progenies F1.
De cualquier insuficiente- o sobre-digestión con colagenasa resultados en aislamiento de islotes subóptima. En el primer caso, las grandes islotes se pueden visualizar fácilmente, sin embargo, algunos islotes no pueden separarse completamente de tejidos acinares (Figura 2A). Esto reducirá el rendimiento de los islotes, pero islotes más grandes suelen ser producidos. En este último caso, los tejidos acinares pueden ser completamente disociados de islotes. Sin embargo, esto pone en peligro la estructura de los islotes, dando como resultado en muchos islotes con superficies rugosas (Figura 2B).
islotes neonatales aislados por este método han esperado perfiles de secreción de insulina. Por ejemplo, ambos islotes P1 y P7 muestran la secreción de insulina basal alta (Figura 3, comparar los niveles de secreción de insulina a glucosa 2,8 mM between P1-P7 y P24 islotes maduros), perfiles típicos GSIS de las células beta de los islotes inmadura 7, 9. Esto sugiere que nuestro proceso de aislamiento de islotes conserva en gran medida las propiedades funcionales de islotes neonatales. Por tanto, esperamos que estos islotes son aptos probable para otros estudios basados en in vitro, incluyendo la expresión génica, análisis metabólico, ensayos de supervivencia, y las respuestas al estrés.
Figura 1. Aspecto de islotes durante el proceso de aislamiento. (A) páncreas P1 después de la digestión con colagenasa. La flecha señala una proporción relativamente grande de los islotes. Las puntas de flecha apuntan a dos relativamente pequeños islotes. (B) P1 islotes después de la primera ronda de la recolección manual. (C) islotes después de la cosecha manual 3ª ronda. Fracciones (D) de los islotes después de centrifugación en gradiente. Arrow, un gran islote. Punta de flecha, unapequeño islote. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Los islotes después insuficiente- o digestión con colagenasa sobre-. Islotes (A) seleccionados manualmente después bajo-digestión, tenga en cuenta la asociación entre algunos islotes (racimos de color rosa, flechas) y células acinares (clusters oscuros, puntas de flecha). (B) después de más de Islotes-digestión, tenga en cuenta los islotes con superficies irregulares (flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. GSIS Results de islotes aislados. Los datos presentados son la media ± SEM. Ellos representan el porcentaje de liberación de insulina (cantidad de insulina liberada por la cantidad total de insulina contenida en los islotes de partida) dentro de una ventana de ensayo de 45 minutos con la concentración de glucosa indicada. Islotes de ratones ICR, a través de la recolección manual directa, fueron utilizados para estos ensayos. Tenga en cuenta que P1 y P7 islotes fueron considerados inmaduros, mientras que P24 islotes son maduros 7, 9. Los valores de p se calculan entre los grupos utilizando la prueba t. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A continuación, ofrecemos un protocolo paso a paso en el aislamiento de los islotes del páncreas que son demasiado pequeños para la perfusión convencional. Se espera para producir islotes listos para todos los estudios basados en los islotes como la purificación de las células beta, análisis de expresión génica, la maduración de las células beta de los islotes, la proliferación, las respuestas de estrés celular, la supervivencia celular, el metabolismo y mantenimiento funcional GSIS, etc. Esta será, a lo mejor de nuestro conocimiento, el primer protocolo visual detallada que guía a los nuevos investigadores para llevar a cabo el aislamiento de los islotes de ratones neonatales. Sin estas ayudas visuales, se espera un extenso ensayo y error para la mayoría de los investigadores para lograr con éxito el aislamiento de los islotes del páncreas pequeña.
El factor más crítico para el éxito de aislamiento de islotes es el grado apropiado de digestión pancreática como se indica en pasos de 3,6 - 3,8. En general, tanto la sub y sobre la digestión reducir el rendimiento de los islotes. El exceso de la digestión compromisos adicionales arquitectura islote, que makellos it inadecuado para ensayos funcionales. Para lograr los mejores resultados de la digestión, la reacción tiene que ser controlada constantemente para visualizar el proceso de fragmentación de tejido. Contando con la duración de la digestión de juzgar la separación acinar-islote es el método menos fiable, ya que cada lote de colagenasa es diferente y la edad / tamaño del páncreas a partir afecta profundamente el proceso de digestión. En caso de menores de la digestión, los racimos grandes endocrinos exocrina se pueden lavar en HBSS y se digirieron de nuevo con colagenasa. La digestión puede ser controlado directamente bajo un microscopio de disección para determinar el tiempo de la continuación de la digestión. pipeteo suave también se puede utilizar para disociación de tejidos ayudante. En este caso, una punta P1,000 con las necesidades de apertura amplia ser utilizada, lo que disminuye la fuerza de cizallamiento que podría destruir la arquitectura de los islotes. Más digerido islotes no se recomiendan para la mayoría de los estudios posteriores, pero se pueden usar para algunos ensayos, tales como el análisis de la expresión génica con careful controles.
Al lado de la precaución anterior, prestando atención a varios factores de procedimiento puede mejorar aún más el rendimiento de islotes final y calidad. En primer lugar, Ca2 + y Mg2 + deben incluirse en todas las soluciones, si se utilizaron fuentes no comerciales. Estos cationes son necesarios para mantener la integridad de los islotes. En segundo lugar, la solución de colagenasa reciente con alta actividad es esencial. solución de colagenasa con resultados bajos de actividad en un tiempo más largo para la disociación de tejido. Esto hace que la autolisis de células exocrinas sustancial y la destrucción de los islotes. Con este fin, no se recomienda la utilización de las existencias de colagenasa con más de tres rondas de congelación-descongelación. Se recomienda tercer lugar, centrifugación a baja velocidad durante el lavado de tejidos. La regla de oro es para usar la fuerza AG (<500 x g) que es suficiente para sedimentar las agrupaciones de células, mientras que mantener los restos celulares en el sobrenadante en el paso 4.1 del protocolo. Esta velocidad no sólo evita la destrucción de los islotes, pero también ayuda a remove restos de células para permitir una mejor visualización de los islotes durante la recolección a mano. Por último, la colagenasa no puede ser inactivado por el suero 12. Por lo tanto, su eliminación por lavado es esencial para asegurar la integridad de los islotes en los estudios posteriores.
Por último, hay que señalar que el protocolo presentado debe limitarse a los páncreas de ratón de P1 a P17. No funciona bien para los páncreas mayores de P18. Se recomienda la perfusión convencional para estos ratones más viejos para obtener mejores rendimientos e islotes sanos. Por otra parte, los antecedentes genéticos y edad de los ratones afectan profundamente el rendimiento de los islotes 13,14. Por lo tanto, incluso en condiciones óptimas rendirán diferente número de islotes por páncreas, lo cual es normal y esperado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1x HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with subsequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-mL centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60 x 15 mm dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
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