Introduction
本研究的目的是开发一种正电子发射断层成像/计算机断层扫描（PET / CT）为基础的方法从血液流入小鼠特定组织量化葡萄糖的体内 ，实时摄取。这是使用18 F-标记的氟代脱氧葡萄糖（FDG），以测量葡萄糖摄取和动力学模型来估计18 F-FDG摄取的速率从等离子体到细胞内空间，交通的速率从细胞内空间到等离子体和的速率来实现18 F-FDG的磷酸化。
在啮齿动物中，18 F-FDG已经在许多癌症治疗1，肿瘤进展2和肿瘤代谢3的研究以及褐色脂肪库4，neuroinflamation 5和脑代谢6的成像的临床前评估中使用
用于检查葡萄糖小鼠（和大鼠）的组织特异性摄取通常涉及与任一3 H或14 C，随后安乐死，组织收集和测量放射性每个组织7的2-脱氧葡萄糖的放射性标记的治疗传统的方法。使用PET / CT的允许在多个器官和地区非侵入性的决心葡萄糖的吸收和代谢的同时在活的动物。另外，如安乐死不是必需的，该技术是适合于在纵向研究中使用。
2型糖尿病（T2DM）的特征在于破坏葡萄糖代谢和高血糖症继发于降低组织响应性胰岛素（胰岛素抵抗）和胰腺β-细胞的不能产生足够量的胰岛素8。葡萄糖摄取和代谢动力学分析可以提供重要的见解动作和治疗性干预的功效的机制以及允许疾病进展的先进的监控。
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Protocol
在这项研究中所描述的所有程序是由悉尼当地卫生区和悉尼动物伦理委员会的批准大学和遵循NIH 指南护理和使用实验动物 ，第八版（2011年）。
1.动物的制备
注意：在这个协议中雄性db / db小鼠（BKS.Cg- DOCK7 M + / + 瘦素受体分贝 / J）维持在与随意访问组壳体食物和水直到6周龄。在成像时，将小鼠称重约30克在这个协议中使用的所有小鼠都禁食10和14毫摩尔/ L之间的血糖水平。
- 如果需要的话，快的老鼠。在本实例中，快速的小鼠之前的实验方法5小时。
- 治疗与成像开始前所需的药剂（ 例如药物，蛋白质，肽）小鼠。在该示例中，管理胰岛素的皮下注射（3U / kg的人胰岛素）或等体积的PBS 30分钟之前成像的开始。
2.设置工作流程
注意：此协议是在PET / CT扫描仪来实现。获取第一PET数据，随后采集CT数据。
- PET的设置：
- 选择同位素如（18）F，设定扫描持续时间3600秒，上部和下部水平能量鉴别到350千电子伏- 650千电子伏（默认）为3.432纳秒（默认）重合定时窗口。直方图列表模式数据转换成16个帧（6×10秒，4×60秒，1×300秒，5×600个），在周期0 - 示踪剂注射后60分钟。重建发射正弦图使用二维-FBP的变焦1.5。
注：重建图像包括16动态帧，每个帧的128×128×159分体素和0.52×0.52×0.796毫米3的体素尺寸。
- 选择同位素如（18）F，设定扫描持续时间3600秒，上部和下部水平能量鉴别到350千电子伏- 650千电子伏（默认）为3.432纳秒（默认）重合定时窗口。直方图列表模式数据转换成16个帧（6×10秒，4×60秒，1×300秒，5×600个），在周期0 - 示踪剂注射后60分钟。重建发射正弦图使用二维-FBP的变焦1.5。
- CT设置：
- 对于全身CT扫描，在50kV，照射时间500毫秒和200个突出超过360旋转设定的电流在500 A，电压。的视场（FOV）的检测器字段设置为30722048，床位置的数目为3（以覆盖全PET视野范围），床位置= 30.234713％和检测器合并到4之间的重叠。
使用锥束断层摄影图像重建的软件与HU校准，双线性插值和Shepp-洛根滤波器进行CT重建：注意。
- 对于全身CT扫描，在50kV，照射时间500毫秒和200个突出超过360旋转设定的电流在500 A，电压。的视场（FOV）的检测器字段设置为30722048，床位置的数目为3（以覆盖全PET视野范围），床位置= 30.234713％和检测器合并到4之间的重叠。
- 18 F-FDG：
- 交货足以18 F-FDG（例如于0.5mL 450个活度）从本地供应商。在第一次注射之前到达〜30分钟。等分试样并稀释18 F-FDG，使得动物接受〜18 F-FDG的10 MBq的0.1毫升的最终体积。
3.成像协议
- 擦拭感应室和成像床用80％（V / V）乙醇，以保持无菌条件。解放军CE鼠标在感应室，并与在氧气5％异氟烷麻醉。
- 鼠标放置到配有电热加热垫保持体温和一个精确的蒸发器鼻锥递送异氟烷成像床 - 以1L / min的流速（维修，1.5 2％）。应用眼药膏到眼睛，防止干燥，而麻醉下。
- 鼠标在上的传感器垫俯卧位置以监测呼吸和麻醉确保有足够平面被保持定位。
- 2分钟以扩张侧尾静脉 - 使用热包1升温的尾部。通过将30号针插入侧尾静脉插入导管侧尾静脉。固定针头与手术胶水的地方和固定导管。
- 负载成像床到扫描器和通过机器移动床，使得导管可从机器的后部被访问。
- 附加导管到18 F-FDG注射器在SYR英格驱动程序。注入和待施用的体积（<100μL，注射在10秒）之前，计算基于在注射器活动的确切18 F-FDG的剂量（10个活度）。
- 为了尽量减少麻醉对葡萄糖摄取的变异性的影响，确保麻醉诱导和18 F-FDG（例如，30分钟）的喷射之间的恒定时间。
- 开始的PET 18 F-FDG的注射前立即扫描。在完成PET扫描（3600个S）后，执行CT扫描（〜10分钟），以允许放射性示踪剂摄取的同组织共配准。
- 移动成像床到起始位置时，从床中除去所述动物。
- 此时安乐死的动物或使其恢复：
- 对于安乐死，进行颈椎脱位，同时仍然在麻醉下，收集的供后续分析感兴趣的器官。
- 如果允许使用鼠标来回收，放置在单个壳体中的小鼠在加热垫上或在加热灯前面。监视鼠标，直到它已重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧。让鼠标返回到组壳体前1个小时恢复。
4. PET图像处理
利用收购Workplace软件v1.5.0.28和分析研究工作软件V4.2进行图像重建：注意。
- 共登记CT和PET图像，并确保该对准是在所有3个维度正确。
- 在“文件”菜单，选择“文件夹搜索/导入”，选择包含数据的文件夹。选择所需的PET和CT数据，然后单击“常规分析”选项卡上。
- 排序，使得CR被指定为“源”和PET被指定“目标”的数据。在“工作流”菜单，选择“注册”。如果图像需要调整，以正确地共同注册，使用的工具中日E“注册”菜单。
- 在“工作流”菜单，选择“量化的投资回报率”。
- 使用在“图像”选项卡中的“潘”和“缩放”功能，找到所需的区域。在“工具”菜单，选择“创建”选项卡，然后单击画笔图标。绘制图像上的ROI
- 从“保存”菜单中选择“保存ROI量化”提取时间 - 活性曲线。保存数据为CSV文件。
- 量化放射性摄取如贝每组织cm 3以下。通过装载CSV文件到电子表格转换值转换成每cm 3（％ID / cm 3）的注射剂量的百分比。
5.输入功能
- 为了校正该系统的点扩散函数，去卷积使用reblurred范Cittert去卷积方法如前所述9 5次迭代所估计的系统的PSF。
注：这是必需由于鼠标腔静脉的小尺寸。 - 使用去卷积后的图像如上述那样，以产生血液输入功能的时间 - 活性曲线。
6.动力学模拟
注：FDG两组织隔室模型（ 图1）需要的等离子体输入功能。
- 转换在CSV血液输入功能文件以使用下面的等式10中的等离子体输入功能：Input_plasma = Input_blood×（0.386ë - 0.191吨 + 1.165）。
- 在动力学建模工具点击“动力学”按钮。导入组织和血浆总活性通过选择“菜单”“加载时效曲线”算CSV文件导入动力学建模工具。
- 在“模式”菜单中选择2节组织车厢。确保旁边K4未选择此方框和输入的值0。对于初始拟合，取消为VB的框（血液体积分数）和输入的2％的值。
- 点击“适合当前区域”。校正所提取的感兴趣区域为分散液11，12。通过最小化的FDG模型不同分散时间的卡方值实现这一目标。
- 使用浮动VB的值（检查旁边为VB框中的框）和优化的色散值来计算区域的速率常数（K 1 -k 3）执行第二配合。计算区域流入常数为K I =（K 1×K 3）/（K 2 + K 3）。
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Representative Results
我们以前使用过的db / db小鼠模型来研究对葡萄糖的吸收和代谢13动力学提高血浆的apoA-I水平的影响。在这项研究中，我们使用用胰岛素治疗db / db小鼠证明PET / CT成像的工具来监测18 F-FDG的从等离子体摄取到实时腓肠肌。
六周龄的db / db小鼠麻醉并30分钟的PET扫描开始之前，用3ù人胰岛素/ kg或等效体积的PBS经由皮下注射治疗。小鼠通过静脉内注射和摄取PET为60分钟测得的收到18 F-FDG的10个活度。用于解剖参考进行CT扫描。
感兴趣的区域上绘制使用CT图像腔静脉和腓肠肌（Figure 2）。与胰岛素的db / db小鼠的治疗在所述获取的时间段（ 图3A）在腓肠肌ROI增加了18 F-FDG的活性。对于韦纳·卡瓦ROI获得的值从血液转化为血浆值和胰岛素治疗胰岛素治疗的小鼠相对于对照（ 图3B）并没有改变。
时间活性曲线装入用于计算动力学参数动力学建模工具。数据最初被安装到一个两组织隔室方法，其中k 4 = 0的2％为V B（血液体积分数）值来计算的色散值（80秒和70秒为PBS和分别胰岛素治疗的小鼠）。拟合然后使用上述分散值和浮动V b值为执行。
在18的速度没有显著差异F-在胰岛素治疗小鼠中观察到从动脉血浆细胞内空间（K 1）或从细胞内空间与血浆（K 2）FDG运输与对照相比（ 表1）。 18 F-FDG的磷酸化（K 3）的速率在胰岛素治疗的小鼠（7.06±6.60×10 -3是显著增加VS 2.26±0.72×10 -2分钟-1分别PBS和胰岛素治疗组，P <0.05 ）。胰岛素治疗也显著增加相比，PBS处理的动物中的流入常数（K I）（5.51±4.25×10 -4分别VS 2.01±0.28×10 -3毫升分钟-1克-1; P <0.05）。
图1：区域时间-活性曲线拟两tissu即，三室模型，与C1是FDG的血浆和C2和C3 FDG和磷酸化的FDG的在组织，分别浓度的浓度。 K 1表示在组织中的FDG摄取率，K 2从组织返回到等离子体室和K 3 FDG的磷酸化速率的清除率。 FDG的去磷酸化被假定为可忽略不计（K 4 = 0）。
图2：的共同配准的PET-CT图像上在腓肠肌（A）和韦纳·卡瓦（B）的感兴趣区域的绘图的示例。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3：在腓肠肌（A）和韦纳·卡瓦（B）的感兴趣区域的时间-活性曲线。雄性db / db小鼠分别接受3 U / kg的胰岛素（红色）或等体积的PBS（黑色）之前禁食4.5小时。 18 F-FDG（10个活度）中的溶液通过静脉内注射，并通过PET / CT 60分钟所确定的腓肠肌和韦纳·卡瓦18 F-FDG的水平输送。值是平均值±SD并且表示为注射剂量的百分比，从一个完整的场（N = 4 /组）来计算。从Cochran 等人修改。 13 请点击此处查看该图的放大版本。
| 治疗 | K 2 | K 3 | K I | |
| （毫升分钟-1 g -1）以上 | （分钟-1） | （分钟-1） | （毫升分钟-1 g -1）以上 | |
| PBS | 1.31±0.42×10 -2 | 0.12±0.11 | 7.06±6.60×10 -3 | 5.51±4.25×10 -4 |
| 胰岛素 | 1.45±0.59×10 -2 | 0.09±0.05 | 2.26±0.72×10 -2 * | 2.01±0.28×10 -3 * |
表1：增加了18 F-FDG的动力学分析从等离子体到腓肠肌中胰岛素处理的db /db小鼠。 值是平均值±SD。 * P <0.05，相对于PBS根据Mann-Whitney检验（N = 4 /组）。
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Discussion
这里描述的协议代表一个健壮的，非侵入性的方法来从血流进入组织以及随后的代谢在小鼠中测定的葡萄糖摄取的动力学。
所述的db / db小鼠是是已经广泛用于检查胰岛素抗性和相关的干预2型糖尿病14的公认动物模型。然而，以往的研究只量化端点摄取的心脏15和心脏和骨骼肌16。
利用动力学分析以确定生理速率常数和18 F-FDG的摄取从血浆模型到组织中允许见解的抗糖尿病治疗对葡萄糖摄取和代谢的影响。此外，这些实验可以纵向进行评估，例如，对葡萄糖代谢年龄或饮食的影响。这是ADVAntageous了需要关注器官的安乐死和收集，因此只在单个时间点提供信息的传统方法。
尽管先前已经使用整个心脏17以及心脏，肝和血液样品18在小鼠中确定的输入的功能，这里所描述的协议允许使用的在韦纳·卡瓦19的感兴趣区域的输入函数的计算。另外，也可以在PET研究中，以计算使用动脉血样输入功能。然而，这是不切实际的，由于老鼠的小血量。
使用等离子体的输入函数，而不是18 F-FDGsignal在全血中的是由于18 F-FDG摄取到小鼠红细胞20。此外，红细胞相关联的活动表示18 F-FDG红细胞内，并且因此是不容易获得用于运输到其他组织区室。
在这个协议中，重要的是确保放置到尾静脉中用于递送18 F-FDG的推注到韦纳·卡瓦和整个鼠标的主体中的导管的正确放置。尾部的变暖扩张尾静脉显著提高了容易插入这导管中。同样重要的是，保证了PET和CT图像正确配准，以便在CT图像上绘制的正确的ROI对应于PET信号。
有过麻醉剂的研究探讨对葡萄糖的摄取选择一些争论。虽然异氟醚是一种常用的麻醉剂兽医，使用七氟醚可以是18 F-FDG PET实验21是有利的。在这个协议中，重要的是要确保保持时间betw与异氟烷麻醉相关的任何潜在偏差最小化麻醉诱导EEN和成像恒定的开始。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
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