Introduction
Syftet med denna studie var att utveckla en positronemissionstomografi / datortomografi (PET / CT) baserad metodologi för att kvantifiera in vivo, realtidsglukosupptaget från blodströmmen in i specifika vävnader i möss. Detta uppnåddes med användning av 18 F-märkt fluordeoxiglukos (FDG) för att mäta glukosupptag och kinetisk modellering för att uppskatta hastigheterna av 18 F-FDG upptag från plasmat till det intracellulära utrymmet, transporthastigheten från intracellulära utrymmet till plasma och hastigheten för 18 F-FDG fosforylering.
Hos gnagare har 18 F-FDG använts i pre-klinisk bedömning av många cancerbehandlingar 1, studier av tumörprogression 2 och tumörmetabolism 3 samt avbildning av bruna fettdepåer 4, neuroinflammation 5 och hjärnmetabolism 6
Traditionella metoder som används för att undersöka den vävnadsspecifika upptaget av glukos i möss (och råttor) innefattar i allmänhet behandling med 2-deoxiglukos radioaktivt med antingen 3 H eller 14 C följt av dödshjälp, uppsamling av vävnad och mätning av radioaktiviteten i varje vävnad 7. Användningen av PET / CT möjliggör för icke-invasiv bestämning av glukosupptag och metabolism i flera organ och regioner samtidigt med levande djur. Dessutom, som dödshjälp är inte ett krav, är denna teknik lämplig för användning i longitudinella studier.
Typ 2-diabetes mellitus (T2DM) kännetecknas av störd glukosmetabolism och hyperglykemi sekundär till minskad vävnads mottaglighet för insulin (insulinresistens) och oförmågan av pankreatiska -celler att producera tillräckliga mängder insulin 8. Kinetisk analys av glukosupptag och metabolism kan ge viktiga insikterverkningsmekanism och effekt av terapeutiska ingrepp samt möjliggör avancerad övervakning av sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs i denna studie har godkänts av Sydney lokala hälso District och University of Sydney djuretik kommittéer och följde NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur, åttonde upplagan (2011).
1. Djurpreparering
OBS: I detta protokoll manliga db / db-möss (BKS.Cg- Dock7 m + / + Lepr db / J) hölls i grupphuset med ad libitum tillgång till chow och vatten fram till 6 veckors ålder. Vid tiden för avbildning, möss vägde ~ 30 g. Alla möss används i detta protokoll hade fasteblodglukosnivåer mellan 10 och 14 mmol / L.
- Vid behov snabbt möss. I föreliggande exempel, snabb mössen under 5 h före det experimentella förfarandet.
- Behandla möss med det önskade medlet (t ex läkemedel, protein, peptid) före påbörjandet av avbildning. I detta exempel, administrera en subkutan injektion av insulin (3U / kg humant insulin) eller motsvarande volym PBS 30 min före starten av avbildning.
2. Ställ in Workflow
OBS: Detta protokoll genomfördes på en PET / CT-scanner. Förvärva PET-data först, följt av förvärvet av CT-data.
- PET inställningar:
- Välj isotop som 18 F, ställ avsökningsvaraktigheten till 3600 s, och övre och nedre nivå energi diskriminering till 350 keV - 650 keV (standard) med en tillfällighet tidsfönster av 3.432 ns (standard). Histogram lista-mode data till 16 ramar (6 x 10 s, 4 x 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) för perioden 0 - 60 min efter spårämnesinjektion. Rekonstruera utsläpps sinogram användning av 2D-FBP med en zoom 1,5.
OBS: De rekonstruerade bilder bestod av 16 dynamiska ramar, var och en med 128 x 128 x 159 voxlar och en voxel storlek av 0,52 x 0,52 x 0,796 mm 3.
- Välj isotop som 18 F, ställ avsökningsvaraktigheten till 3600 s, och övre och nedre nivå energi diskriminering till 350 keV - 650 keV (standard) med en tillfällighet tidsfönster av 3.432 ns (standard). Histogram lista-mode data till 16 ramar (6 x 10 s, 4 x 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) för perioden 0 - 60 min efter spårämnesinjektion. Rekonstruera utsläpps sinogram användning av 2D-FBP med en zoom 1,5.
- CT inställningar:
- Fören hel kropp datortomografi, ställa in aktuell vid 500 A, spänning vid 50 kV, exponeringstid 500 ms och 200 projektioner över en 360 rotation. Sätt detektorns synfält (FOV) till 30.722.048, antal bädd positioner till 3 (för att täcka hela PET FoV intervall), överlappning mellan sängpositioner = 30,234713% och detektor binning till 4.
OBS: CT rekonstruktion genomfördes med hjälp av kon trålen tomography bildrekonstruktion programvara med HU kalibrering, bilinjär interpolation och Shepp-Logan filter.
- Fören hel kropp datortomografi, ställa in aktuell vid 500 A, spänning vid 50 kV, exponeringstid 500 ms och 200 projektioner över en 360 rotation. Sätt detektorns synfält (FOV) till 30.722.048, antal bädd positioner till 3 (för att täcka hela PET FoV intervall), överlappning mellan sängpositioner = 30,234713% och detektor binning till 4.
- 18 F-FDG:
- Beställa tillräcklig 18 F-FDG (t.ex. 450 MBq i 0,5 ml) från en lokal leverantör att anlända ~ 30 min före den första injektionen. Alikvot och späd 18 F-FDG, så att djuren erhåller ~ 10 MBq 18 F-FDG i en slutlig volym av 0,1 ml.
3. Imaging Protocol
- Torka induktionskammare och avbildnings säng med 80% (volym / volym) etanol för att bibehålla aseptiska förhållanden. Place musen i en induktionskammare och söva med 5% isofluran i syre.
- Placera musen på ett avbildnings säng utrustad med en elektrisk värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen och en precision förångare noskon att leverera isofluran (underhåll, 1,5 - 2%) vid en flödeshastighet av 1 l / min. Applicera oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet medan under narkos.
- Placera musen i liggande ställning på en sensordynan för att övervaka andning och säkerställa en tillräcklig plan av anestesi upprätthålls.
- Värma svansen med användning av en värmepåse för 1 - 2 min för att dilatera den laterala svansvenen. ANVÄNDA KATETER den laterala svansvenen genom insättning av en 30-gauge nål i den laterala svansvenen. Fäst nålen på plats med kirurgisk lim och säkra katetern.
- Belastning avbildning bädden i skannern och flytta sängen genom maskinen så att katetern kan nås från den bakre delen av maskinen.
- Fästa katetern till 18 F-FDG sprutan i en syringe drivrutin. Beräkna den exakta 18 F-FDG dos (10 MBq) baserat på aktivitet i sprutan före injektionen och den volym som ska administreras (<100 | il, injicerades över 10 s).
- För att minimera påverkan av anestesi om variabilitet av glukosupptag, säkerställa en konstant tid mellan induktion av anestesi och injektion av 18 F-FDG (t.ex. 30 min).
- Påbörja PET scan omedelbart före injektion av 18 F-FDG. Efter avslutad PET scan (3.600 s), utföra en datortomografi (~ 10 min) för att möjliggöra samtidig registrering av radiospårupptag med vävnader.
- Flytta avbildnings sängen till utgångsläget, ta bort djuret från sängen.
- Vid denna punkt avliva djuret eller tillåta den att återhämta sig:
- För dödshjälp, utföra halsdislokation medan de fortfarande under narkos och samla organ av intresse för efterföljande analys.
- Om att låta musen för att återhämta sig, placera musen i samma hölje på en värmedyna ellerframför en värmelampa. Övervaka musen tills den har återfått tillräckligt medvetandet för att upprätthålla sternala VILA. Tillåta musen för att återhämta sig under 1 h innan den återgår till grupp bostäder.
4. PET Image Processing
OBS: Bilden rekonstruktion genomfördes med hjälp av förvärvsarbetsplats programvara v1.5.0.28 och analys forskning programvara arbetsplats v4.2.
- Co-registrera CT och PET bilder och se till att inriktningen är korrekt i alla 3 dimensioner.
- I menyn 'File', välj 'Folder Search / Import' och välj den mapp som innehåller data. Välj önskade PET och CT-data och klicka på fliken 'Allmänt Analysis'.
- Sortera data så att CR betecknas 'Source' och PET betecknas 'Target'. I 'Workflow' menyn, välj 'Registration'. Om bilderna kräver justering för att vara korrekt samar registrerats använda verktygen i the 'Registration' menyn.
- I 'Workflow' menyn, välj 'ROI kvantifiering'.
- Använd 'Pan' och 'Zoom' funktioner i 'Bild' fliken för att lokalisera den önskade regionen. I menyn 'Verktyg', välj 'Skapa' -fliken och klicka på ikonen pensel. Rita ROI på bilden
- Utdrag tidsaktivitetskurvorna genom att välja 'Spara ROI Kvantifiering' från 'Save' meny. Spara data som en CSV-fil.
- Kvantifiera radioaktivitet upptag som Bq per cm 3 av vävnad. Omvandla värden i procent av injicerad dos per cm 3 (% ID / cm 3) genom att ladda CSV-filen till ett kalkylblad.
5. Ingång Funktion
- Att korrigera för systemet punktspridningsfunktionen, deconvolve det uppskattade systemet polyesterstapelfibrer för 5 iterationer som använder reblurred Van Cittert dekonvolution metod som tidigare beskrivits 9.
OBS: Detta krävs på grund av den lilla storleken på vena cava i en mus. - Använda placera sina dekonvolution bilder för att generera en ingångsblodfunktion tidsaktivitetskurvan såsom beskrivits ovan.
6. Kinetic Modeling
OBS: FDG två vävnads kompartmentmodell (figur 1) erfordrar plasmaingångsfunktionen.
- Omvandla den ingående blodfunktion i CSV-filen till plasmaingångsfunktion med användning av följande ekvation 10: Input_plasma = Input_blood × (0,386 e - 0.191t + 1,165).
- I den kinetiska modelleringsverktyget klicka på 'Kinetic' -knappen. Importera vävnaden och plasma total aktivitet räkna CSV-filer till den kinetiska modelleringsverktyget genom att välja 'Load Tid Aktivitet Curve' från 'Meny'.
- I menyn 'Model' välj 2 teoretiska vävnader. Se till att rutan bredvid k4 är omarkeradoch ange ett värde av 0. För första anpassningen avmarkera rutan för vB (blodvolymfraktion) och ange ett värde på 2%.
- Klicka på 'Fit aktuella regionen'. Korrigera den extraherade intressanta området för dispersion 11, 12. Uppnå detta genom att minimera Chi-kvadratvärdet för FDG modell för olika dispergeringstider.
- Utföra en andra passform användning av flytande vB värde (markera rutan bredvid rutan för vB) och den optimerade dispersionen värde för att beräkna de regionala hastighetskonstanter (k 1 -k 3). Beräkna den regionala tillströmningen konstant som Ki = (k 1 × k 3) / (k 2 + k 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare använt db / db musmodell för att undersöka effekterna av ökande plasma apoA-I-nivåer på kinetiken för glukosupptag och metabolism 13. I denna studie använde vi db / db möss behandlade med insulin för att visa användbarheten av PET / CT för att övervaka upptaget av 18 F-FDG från plasmat i gastrocnemiusmuskeln i realtid.
Sex veckor gamla db / db-möss sövdes och behandlades med 3 U humant insulin / kg, eller ekvivalent volym PBS via subkutan injektion 30 min före starten av PET-skanning. Möss fick 10 MBq 18 F-FDG via intravenös injektion och upptag mättes genom PET för 60 min. En datortomografi gjordes för anatomisk referens.
Regioner av intresse drogs på vena cava och gastrocnemius med hjälp av CT-bilder (Figure 2). Behandling av db / db-möss med insulin ökade 18 F-FDG-aktivitet i gastrocnemius ROI över förvärvstidsperioden (figur 3A). De värden som erhållits för vena cava ROI omvandlades från blod till plasmavärden och förändrades inte genom behandling insulin i insulin-behandlade möss i förhållande till kontroll (figur 3B).
Tid Aktivitet kurvor laddades i den kinetiska modelleringsverktyget för beräkning av kinetiska parametrar. Data som ursprungligen anpassades till en två-vävnadsavdelning metod med k 4 = 0 med ett Vb (blodvolym fraktion) värde på 2% för att beräkna spridningsvärden (80 s och 70 s för PBS och insulinbehandlade möss, respektive). Montering utfördes sedan med användning av de ovan nämnda spridningsvärden och en flytande V b-värde.
Ingen signifikant skillnad i andelen 18 F-FDG transport från den arteriella plasma till det intracellulära utrymmet (k 1) eller från det intracellulära utrymmet till plasma (k 2) observerades i insulinbehandlade möss jämfört med kontroll (tabell 1). Hastigheten av 18 F-FDG-fosforylering (k 3) var signifikant förhöjt i insulinbehandlade möss (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 x 10 -2 min -1 för PBS och insulinbehandlade grupper, respektive; p <0,05 ). Insulinbehandling också signifikant ökad tillströmningen konstanten (Ki) jämfört med de PBS-behandlade djur (5,51 ± 4,25 x 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 x 10 -3 ml min -1 g -1, respektive; p <0,05).
Figur 1: Regionala tidsaktivitetskurvor anpassades till en två-tissu e, tre kompartmentmodell, med C1 är koncentrationen av FDG i plasma och C2 och C3 koncentrationen av FDG och fosforylerad FDG i vävnad, respektive. k 1 representerar FDG upptagningshastigheten i vävnad, k 2 clearancehastigheten från vävnaden tillbaka till plasmautrymmet och k 3 fosforyleringen hastigheten för FDG. Den defosforylering av FDG antogs vara försumbara (k 4 = 0).
Figur 2: Exempel på ritning av regioner av intresse i gastrocnemiusmuskeln (A) och vena cava (B) på en co-registrerad PET-CT-bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
OAD / 55.184 / 55184fig3.jpg"/>
Figur 3: Tid-aktivitetskurvor för regioner av intresse i gastrocnemiusmuskeln (A) och vena cava (B). Manliga db / db-möss fick fasta under 4,5 timmar före mottagande 3 U / kg insulin (röd) eller motsvarande volym PBS (svart). 18 F-FDG (10 MBq) tillfördes via intravenös injektion och 18 F-FDG-nivåer i gastrocnemiusmuskeln och vena cava bestäms av PET / CT för 60 min. Värden är medelvärde ± SD och uttrycktes som procent av injicerad dos, som beräknas från en full synfält (n = 4 / grupp). Modifierad från Cochran et al. 13 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Behandling | k 2 | k 3 | Ki | |
| (ml min -1 g -1) | (min -1) | (min -1) | (ml min -1 g -1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 x 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 x 10 -3 | 5,51 ± 4,25 x 10 -4 |
| Insulin | 1,45 ± 0,59 x 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 x 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 x 10 -3 * |
Tabell 1: Kinetisk analys av ökad 18 F-FDG från plasma till gastrocnemiusmuskeln i insulinbehandlade db /db-möss. Värdena är medelvärde ± SD. * P <0,05 vs PBS enligt en Mann-Whitney-test (n = 4 / grupp).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här representerar en robust, icke-invasiv metod för att bestämma kinetiken för glukosupptag från blodströmmen in i vävnad och efterföljande metabolism i möss.
Db / db-musen är en är en väletablerad djurmodell för typ 2-diabetes 14 som har använts i stor utsträckning för att undersöka insulinresistens och relevanta interventioner. Emellertid har tidigare studier endast kvantifieras endpoint upptag i hjärtat 15 och hjärt- och skelettmuskel 16.
Användningen av kinetisk analys för att bestämma fysiologiska hastighetskonstanter och modellera upptaget av 18 F-FDG från plasma till vävnaden medger insikter i effekterna av antidiabetiska behandlingar på glukosupptag och metabolism. Dessutom kan dessa experiment utföras i längsled för att bedöma till exempel effekterna av ålder eller diet på glukosmetabolismen. Detta är Advantageous jämfört med traditionella metoder som kräver dödshjälp och insamling av organ av intresse och på så sätt ge information endast vid en enda tidpunkt.
Medan ingångsfunktioner har tidigare bestämts med användning av hela hjärtat 17 samt hjärta, lever och ett blodprov 18 i möss, det protokoll som beskrivs här medger beräkning av inmatningsfunktion med användning av ett område av intresse över vena cava 19. Det är också möjligt att beräkna ingångsfunktioner med hjälp av arteriella blodprov under en PET-studie. Detta är dock opraktiskt på grund av den lilla blodvolymen hos möss.
Användningen av en plasmaingång funktion snarare än den 18 F-FDGsignal i helblod beror på upptag av 18 F-FDG i mus röda blodkroppar 20. Dessutom den röda blodcellassocierad aktivitet representerar 18 F-FDG inuti röda blodkroppar, och är följaktligeninte lätt tillgänglig för transport till andra vävnadsutrymmen.
I detta protokoll, är det kritiskt för att säkerställa korrekt placering av katetern placeras i svansvenen för leverans av 18 F-FDG bolus till vena cava och genom hela kroppen för musen. Uppvärmningen av svansen för att dilatera svansvenen signifikant förbättrar lättheten att sätta in denna kateter. Det är också viktigt att se till att PET och CT-bilder är ordentligt coregistered så att ROI dras på CT-bilden motsvarar korrekt PET-signalen.
Det finns en viss debatt om valet av bedövningsmedel i studier som undersökt glukosupptaget. Medan isofluran är en vanligen använd veterinär bedövningsmedel, kan användningen av sevofluran vara fördelaktig i 18 F-FDG PET experiment 21. I detta protokoll är det viktigt att se till att eventuella fördomar i samband med isoflurananestesi minimeras genom att hålla tid mellaneen induktion av anestesi och påbörjandet av avbildnings konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
- Jensen, M. M., Kjaer, A. Monitoring of anti-cancer treatment with (18)F-FDG and (18)F-FLT PET: a comprehensive review of pre-clinical studies. Am J Nucl Med Mol Imaging. 5, 431-456 (2015).
- Duncan, K., et al. (18)F-FDG-PET/CT imaging in an IL-6- and MYC-driven mouse model of human multiple myeloma affords objective evaluation of plasma cell tumor progression and therapeutic response to the proteasome inhibitor ixazomib. Blood Cancer J. 3, e165 (2013).
- Wang, Y., Kung, A. L. 18F-FDG-PET/CT imaging of drug-induced metabolic changes in genetically engineered mouse lung cancer models. Cold Spring Harb Protoc. 2015, 176-179 (2015).
- Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radu, C. G., Shu, C. J., Shelly, S. M., Phelps, M. E., Witte, O. N. Positron emission tomography with computed tomography imaging of neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1937-1942 (2007).
- Toba, S., et al. Post-natal treatment by a blood-brain-barrier permeable calpain inhibitor, SNJ1945 rescued defective function in lissencephaly. Sci Rep. 3, 1224 (2013).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Overexpression of hexokinase II increases insulinand exercise-stimulated muscle glucose uptake in vivo. Am J Physiol. 276, E70-E77 (1999).
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58, 773-795 (2009).
- Tohka, J., Reilhac, A. Deconvolution-based partial volume correction in Raclopride-PET and Monte Carlo comparison to MR-based method. NeuroImage. 39, 1570-1584 (2008).
- Wu, H. M., et al. et al. In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med. 48, 837-845 (2007).
- Oikonen, V. Model equations for the dispersion of the input function in bolus infusion PET studies. , Available from: http://www.turkupetcentre.net/reports/tpcmod0003.pdf (2002).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 536-545 (1986).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [18F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59, 1977-1984 (2016).
- Kobayashi, K., et al. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism. 49, 22-31 (2000).
- Yue, P., et al. Magnetic resonance imaging of progressive cardiomyopathic changes in the db/db mouse. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292, H2106-H2118 (2007).
- Hagberg, C. E., et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 490, 426-430 (2012).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. J Nucl Med. 54, 132-138 (2013).
- Tantawy, M. N., Peterson, T. E. Simplified [18F]FDG image-derived input function using the left ventricle, liver, and one venous blood sample. Molecular imaging. 9, 76-86 (2010).
- Thorn, S. L., et al. Repeatable noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG: evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med. 54, 1637-1644 (2013).
- Wagner, R., Zimmer, G., Lacko, L. An interspecies approach to the investigation of the red cell membrane glucose transporter. Biochim Biophys Acta. 771, 99-102 (1984).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Mol Imaging Biol. 10, 192-200 (2008).
