Introduction
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare una tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) metodologia basata quantificare in vivo, captazione tempo reale del glucosio dal flusso sanguigno nei tessuti specifici nei topi. Ciò è stato ottenuto utilizzando fluorodeossiglucosio 18 F-marcato (FDG) per misurare l'assorbimento di glucosio e modellazione cinetica per stimare i tassi di 18 F-FDG dal plasma allo spazio intracellulare, la velocità di trasporto dallo spazio intracellulare al plasma e il tasso di 18 F-FDG fosforilazione.
Nei roditori, 18 F-FDG è stato utilizzato nella valutazione pre-clinica di numerosi trattamenti contro il cancro 1, studi di progressione del tumore 2 e il metabolismo del tumore 3 così come l'imaging di depositi di grasso bruno, 4 neuroinflamation 5 e il cervello metabolismo 6
I metodi tradizionali utilizzati per esaminare l'assorbimento specifico tissutale di glucosio nel topo e nel ratto () comportano generalmente il trattamento con 2-deossiglucosio radiomarcato sia con 3 H o 14 C seguita da eutanasia, raccolta dei tessuti e misura della radioattività in ogni tessuto 7. L'uso della PET / CT consente per la determinazione non invasiva di assorbimento del glucosio e del metabolismo in molteplici organi e regioni contemporaneamente di animali vivi. Inoltre, come eutanasia non è un requisito, questa tecnica è adatto per l'uso in studi longitudinali.
Diabete mellito tipo 2 (DM2) è caratterizzata da metabolismo del glucosio e perturbato iperglicemia secondaria a ridotta risposta dei tessuti all'insulina (insulino-resistenza) e l'incapacità di -cellule pancreas a produrre adeguate quantità di insulina 8. analisi cinetica di assorbimento del glucosio e il metabolismo può fornire importanti intuizioniil meccanismo d'azione e l'efficacia di interventi terapeutici e consentire il monitoraggio avanzato di progressione della malattia.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo studio sono stati approvati dal Sydney locale Distretto Sanitario e Università di Sydney animali Comitati Etici e seguito la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio, Ottava edizione (2011).
1. Preparazione animale
NOTA: In questo protocollo maschio db / topi db (BKS.Cg- Dock7 m + / + Lepr db / J) sono state mantenute in caso di coabitazione con accesso ad libitum a chow e acqua fino a 6 settimane di età. Al momento della formazione immagine, i topi hanno pesato ~ 30 g. Tutti i topi utilizzati in questo protocollo erano a digiuno i livelli di glucosio nel sangue tra 10 e 14 mmol / L.
- Se necessario, digiunare i topi. Nel presente esempio, digiunare i topi per 5 ore prima della procedura sperimentale.
- Trattare i topi con l'agente desiderato (ad esempio farmaci, proteine, peptidi) prima dell'inizio delle immagini. In questo esempio, somministrare un'iniezione sottocutanea di insulina (3volume equivalente U / kg di insulina umana) o PBS 30 min prima dell'inizio di imaging.
2. flusso di lavoro configurato
NOTA: Questo protocollo è stato implementato su uno scanner PET / TC. Acquisire dati PET prima, seguita dalla acquisizione di dati CT.
- Impostazioni in PET:
- Selezionare isotopo come 18 F, impostare la durata della scansione di 3.600 s, e il livello di discriminazione di energia superiore e inferiore a 350 keV - 650 keV (default) con una finestra di temporizzazione coincidenza di 3.432 ns (default). Istogramma dati list-mode in 16 fotogrammi (6 × 10 s, 4 × 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) per il periodo 0 - 60 min dopo l'iniezione del tracciante. Ricostruire emissione sinogrammi utilizzando 2D-FBP con uno zoom 1.5.
NOTA: Le immagini ricostruite consisteva di 16 fotogrammi dinamici, ciascuno con 128 × 128 × 159 voxel e una dimensione voxel di 0,52 × 0,52 × 0,796 millimetri 3.
- Selezionare isotopo come 18 F, impostare la durata della scansione di 3.600 s, e il livello di discriminazione di energia superiore e inferiore a 350 keV - 650 keV (default) con una finestra di temporizzazione coincidenza di 3.432 ns (default). Istogramma dati list-mode in 16 fotogrammi (6 × 10 s, 4 × 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 s) per il periodo 0 - 60 min dopo l'iniezione del tracciante. Ricostruire emissione sinogrammi utilizzando 2D-FBP con uno zoom 1.5.
- Impostazioni CT:
- Perun'intera scansione del corpo CT, impostare la corrente a 500 A, tensione a 50 kV, tempo di esposizione di 500 ms e 200 proiezioni su una rotazione di 360. Impostare il campo di visione del rivelatore (FOV) a 30.722.048, numero di posizioni letto a 3 (per coprire tutta la gamma FoV PET), sovrapposizione tra le posizioni letto = 30,234,713 mila% e rivelatore categorizzazione 4.
NOTA: ricostruzione TC è stata eseguita utilizzando cone beam tomografia software di ricostruzione dell'immagine con calibrazione HU, interpolazione bilineare e filtro Shepp-Logan.
- Perun'intera scansione del corpo CT, impostare la corrente a 500 A, tensione a 50 kV, tempo di esposizione di 500 ms e 200 proiezioni su una rotazione di 360. Impostare il campo di visione del rivelatore (FOV) a 30.722.048, numero di posizioni letto a 3 (per coprire tutta la gamma FoV PET), sovrapposizione tra le posizioni letto = 30,234,713 mila% e rivelatore categorizzazione 4.
- 18 F-FDG:
- Ordinare sufficiente 18 F-FDG (ad esempio 450 MBq in 0,5 mL) da un fornitore locale per arrivare ~ 30 minuti prima della prima iniezione. Aliquotare e diluire il 18 F-FDG in modo che gli animali ricevono ~ 10 MBq di 18 F-FDG in un volume finale di 0,1 mL.
3. Protocollo Imaging
- Pulire camera di induzione e letto di imaging con 80% (v / v) di etanolo per mantenere condizioni asettiche. PlaCE Il topo in una camera di induzione e anestetizzare con 5% isoflurano in ossigeno.
- Posizionare il mouse su un letto di immagini dotato di un rilievo di riscaldamento elettrico per mantenere la temperatura corporea ed una precisione vaporizzatore naso cono per fornire isoflurano (manutenzione, 1,5 - 2%) ad una portata di 1 l / min. Applicare una pomata oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Posizionare il mouse in posizione prona su un tappetino sensore per monitorare la respirazione e garantire un adeguato piano di anestesia viene mantenuta.
- Riscaldare la coda usando un pacchetto di calore per 1 - 2 min per dilatare la vena della coda laterale. Cateterizzarla vena caudale laterale inserendo un ago da 30 gauge nella vena caudale laterale. Fissare l'ago in posizione con colla chirurgica e fissare il catetere.
- Imaging carico bed nello scanner e spostare il letto attraverso la macchina in modo che il catetere può essere accessibile dal retro della macchina.
- Fissare il catetere alla siringa 18 F-FDG in uno syrautista Inge. Calcolare l'esatta dose di 18 F-FDG (10 MBq) in base all'attività in siringa prima dell'iniezione e il volume da somministrare (<100 uL, iniettati in 10 s).
- Per minimizzare l'impatto dell'anestesia variabilità di captazione del glucosio, assicurano una costante di tempo tra l'induzione di anestesia e iniezione di 18 F-FDG (ad esempio, 30 minuti).
- Iniziare la PET immediatamente prima dell'iniezione di 18 F-FDG. Dopo aver terminato il PET (3.600 s), eseguire una TAC (~ 10 min) per consentire un co-registrazione del radiofarmaco captazione con i tessuti.
- Spostare il letto di imaging alla posizione di partenza, rimuovere l'animale dal letto.
- A questo punto l'eutanasia l'animale o lasciarlo recuperare:
- Per eutanasia, eseguire dislocazione cervicale mentre ancora sotto anestesia e raccogliere organi di interesse per la successiva analisi.
- Se permette il mouse per recuperare, posizionare il mouse in unico alloggiamento su una piastra elettrica odavanti ad una lampada riscaldante. Monitorare il mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Lasciare che il mouse per recuperare per 1 ora prima di tornare alla casa di gruppo.
4. PET Image Processing
NOTA: la ricostruzione delle immagini è stata effettuata utilizzando il software di acquisizione sul posto di lavoro v1.5.0.28 e analisi in v4.2 software di ricerca sul posto di lavoro.
- Co-registro CT e PET immagini e per assicurare che l'allineamento è corretto nelle 3 dimensioni.
- Nel menu 'File', selezionare 'Ricerca cartella / Importa' e selezionare la cartella contenente i dati. Selezionare i dati PET e CT desiderati e fare clic sulla scheda 'analisi generale'.
- Ordina i dati in modo che il CR è designato 'Source' e PET è designato 'target'. Nel menu 'workflow', selezionare 'registrazione'. Se le immagini richiedono una regolazione di essere correttamente co-registrati, utilizzare gli strumenti in thmenù e 'Registrazione'.
- Nel menu 'workflow', selezionare 'ROI Quantificazione'.
- Usare le funzioni del 'Pan' e 'Zoom' nella scheda 'Immagine' per individuare la regione desiderata. Nel menu 'Strumenti', selezionare la scheda 'Crea' e fare clic sull'icona pennello. Disegnare il ROI sull'immagine
- Estrarre le curve tempo-attività selezionando 'Salva ROI Quantificazione' dal menu 'Salva'. Salvare i dati in un file CSV.
- Quantificare la radioattività assorbimento come Bq per cm 3 di tessuto. Convertire i valori in percentuale della dose iniettata per cm 3 (% ID / cm 3) caricando il file CSV in un foglio di calcolo.
Funzione 5. Ingresso
- Per correggere la funzione di diffusione del punto di sistema, deconvolve PSF sistema stimato per 5 iterazioni con il metodo deconvoluzione Van Cittert reblurred come descritto in precedenza 9.
NOTA: Questo è necessario a causa delle piccole dimensioni della vena cava in un mouse. - Utilizzare immagini postali deconvoluzione per generare una curva di funzione tempo di attività di ingresso del sangue come descritto sopra.
6. Modellazione cinetica
NOTA: I due-tessuto modello vano FDG (Figura 1) richiede la funzione di ingresso plasma.
- Convertire la funzione di ingresso del sangue nel file CSV per la funzione di ingresso al plasma usando la seguente equazione 10: Input_plasma = × Input_blood (0,386 e - 0.191t + 1.165).
- Nello strumento di modellazione cinetica fare clic sul pulsante 'cinetica'. Importa il tessuto e l'attività plasmatica totale contano file CSV nel strumento di modellazione cinetica selezionando 'tempo di caricamento Activity Curve' dal 'Menu'.
- Nel menu 'Modello' selezionare 2 compartimenti. Assicurarsi che la casella accanto a k4 non è selezionatae inserire un valore di 0. Per il montaggio iniziale, deseleziona la casella vB (frazione di volume del sangue) e inserire un valore di 2%.
- Fare clic sul 'area corrente Fit'. Correggere la regione estratto di interesse per dispersione 11, 12. Raggiungere questo minimizzando il valore del chi-quadro per il modello FDG per diversi tempi di dispersione.
- Eseguire una seconda forma utilizzando valore vB galleggiante (seleziona la casella accanto alla casella per VB) e il valore di dispersione ottimizzata per calcolare le costanti di velocità regionali (k 1 -k 3). Calcolare l'afflusso regionale costante K i = (k 1 × k 3) / (k + 2 k 3).
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Representative Results
Abbiamo già usato il / modello di topo db db per studiare l'impatto di aumentare i livelli plasmatici di apoA-I sulla cinetica di assorbimento del glucosio e del metabolismo 13. In questo studio abbiamo utilizzato topi db / db trattati con insulina per dimostrare l'utilità delle immagini PET / CT di monitorare l'assorbimento di 18 F-FDG dal plasma nel muscolo gastrocnemio in tempo reale.
Sei settimane di età topi db / db sono stati anestetizzati e trattati con 3 U umano insulina / kg, o un volume equivalente PBS mediante iniezione sottocutanea di 30 min prima dell'inizio della scansione PET. Topi ricevuto 10 MBq di 18 F-FDG tramite iniezione endovenosa e l'assorbimento misurato con PET per 60 min. Una TC è stata eseguita per riferimento anatomico.
Regioni di interesse sono stati elaborati sulla vena cava e muscolo gastrocnemio utilizzando le immagini TAC (FIGURA 2). Trattamento di topi db / db con insulina aumentato l'attività 18 F-FDG nella ROI gastrocnemio nel periodo di tempo di acquisizione (Figura 3A). I valori ottenuti per la vena cava ROI sono stati convertiti dal sangue a valori plasmatici e non sono alterati dalla terapia insulinica insulina topi trattati rispetto al controllo (Figura 3B).
curve attività di tempo sono stati caricati nella strumento di modellazione cinetica per il calcolo dei parametri cinetici. Dati sono stati inizialmente montato un metodo vano due tessuti con k = 4 0 con un valore V b (frazione di volume del sangue) del 2% per calcolare valori di dispersione (80 s e 70 s per PBS e topi trattati con insulina, rispettivamente). Lato stata quindi eseguita utilizzando i valori di dispersione di cui sopra e un valore V b galleggiante.
Nessuna differenza significativa nel tasso di 18 F-Trasporto FDG dal plasma arterioso allo spazio intracellulare (k 1) o dallo spazio intracellulare di plasma (k 2) è stata osservata nei topi trattati con insulina rispetto al controllo (Tabella 1). Il tasso di 18 F-FDG fosforilazione (k 3) era significativamente aumentata nei topi trattati con insulina (7,06 ± 6,60 × 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 × 10 -2 min -1 rispettivamente PBS e gruppi trattati con insulina,; p <0,05 ). Trattamento con insulina anche aumentato significativamente l'afflusso costante (K i) rispetto agli animali trattati con PBS (5,51 ± 4,25 × 10 -4 vs, 2,01 ± 0,28 × 10 -3 mL min -1 g -1 rispettivamente; p <0.05).
Figura 1: Curve tempo-attività regionali sono state montate a due tissu e, tre modello vano, con C1 essendo la concentrazione di FDG nel plasma e C2 e C3 la concentrazione di FDG e fosforilato FDG nel tessuto, rispettivamente. k 1 rappresenta la velocità di assorbimento FDG nel tessuto, k 2, la velocità di clearance dal tessuto posteriore al vano plasma e k 3 il tasso fosforilazione di FDG. La defosforilazione di FDG è considerato trascurabile (k 4 = 0).
Figura 2: Esempio di disegno delle regioni di interesse nel muscolo gastrocnemio (A) e vena cava (B) immagine PET-CT co-registrato su. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: curve tempo-attività per regioni di interesse nel muscolo gastrocnemio (A) e vena cava (B). Maschio topi db / db stati tenuti a digiuno per 4,5 h prima di ricevere 3 U / kg di insulina (rosso) o volume equivalente PBS (nero). 18 F-FDG (10 MBq) è stato distribuito mediante iniezione endovenosa e 18 livelli F-FDG nella cava muscolo gastrocnemio e vena determinato da PET / CT per 60 min. I valori sono la media ± SD ed espressi come percentuale della dose iniettata, calcolata da un intero campo visivo (n = 4 / gruppo). Modificato da Cochran et al. 13 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Trattamento | k 2 | k 3 | K i | |
| (mL min -1 g -1) | (min -1) | (min -1) | (mL min -1 g -1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 × 10 -2 | 0.12 ± 0.11 | 7,06 ± 6,60 × 10 -3 | 5.51 ± 4.25 × 10 -4 |
| Insulina | 1,45 ± 0,59 × 10 -2 | 0.09 ± 0.05 | 2.26 ± 0.72 × 10 -2 * | 2.01 ± 0.28 × 10 -3 * |
Tabella 1: analisi cinetica di aumento 18 F-FDG dal plasma al muscolo gastrocnemio di insulina trattata db /topi db. I valori sono la media ± SD. * P <0,05 vs PBS secondo un test di Mann-Whitney (n = 4 / gruppo).
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Discussion
Il protocollo qui descritto rappresenta una robusta metodologia, non invasivo per determinare la cinetica di assorbimento del glucosio dal sangue nel tessuto e la successiva metabolizzazione nei topi.
Il topo db / db è un è un modello animale ben consolidata di diabete di tipo 2 14 che è stato ampiamente utilizzato per esaminare la resistenza all'insulina e interventi rilevanti. Tuttavia, studi precedenti hanno quantificato solo endpoint assorbimento nel cuore 15 e muscolo cardiaco e scheletrico 16.
L'utilizzo di analisi cinetica per determinare costanti di velocità fisiologici e modellare l'assorbimento di 18 F-FDG dal plasma nel tessuto permette intuizioni l'impatto dei trattamenti antidiabetici sulla captazione del glucosio e il metabolismo. Inoltre, questi esperimenti possono essere eseguiti in senso longitudinale per valutare, ad esempio, l'impatto dell'età o di dieta sul metabolismo del glucosio. Si tratta di ADVAntageous rispetto ai metodi tradizionali che richiedono l'eutanasia e la raccolta di organi di interesse e quindi forniscono informazioni su un solo punto temporale.
Mentre funzioni di ingresso sono stati precedentemente determinati utilizzando tutto il cuore 17 così come cuore, fegato e un campioni di sangue 18 nei topi, il protocollo qui descritto permette il calcolo della funzione di ingresso utilizzando una regione di interesse sulla vena cava 19. È anche possibile calcolare funzioni di ingresso utilizzando campioni di sangue arterioso durante uno studio PET. Tuttavia, questo è impraticabile a causa del piccolo volume di sangue di topi.
L'uso di una funzione di ingresso plasma anziché 18 F-FDGsignal nel sangue intero è dovuto alla captazione di 18F-FDG in cellule topo globuli rossi 20. Inoltre, l'attività associata globulo rosso rappresenta 18 F-FDG all'interno globuli rossi, e quindi ènon facilmente disponibili per il trasporto in altri compartimenti.
In questo protocollo, è fondamentale per garantire il corretto posizionamento del catetere posizionato nella vena della coda per la consegna del 18 F-FDG bolo alla vena cava e in tutto il corpo del mouse. Riscaldamento della coda per dilatare la vena della coda migliora notevolmente la facilità di inserimento di questo catetere. È inoltre importante garantire che le immagini PET e CT sono adeguatamente coregistrata modo che le ROI prelevate l'immagine CT il corrispondono correttamente al segnale PET.
C'è un certo dibattito sulla scelta di anestetico negli studi che esaminano l'assorbimento del glucosio. Mentre isoflurano è un anestetico veterinario comunemente usato, l'utilizzo di sevoflurano può essere vantaggiosa in 18 esperimenti F-FDG PET 21. In questo protocollo, è importante garantire che qualsiasi potenziale di polarizzazione associato con isoflurano viene minimizzata mantenendo il tempo betwinduzione een dell'anestesia e l'inizio della costante di imaging.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
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