Introduction
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en positronemissionstomografi / computertomografi (PET / CT) metode til at kvantificere in vivo, realtid optagelse af glucose fra blodet ind i specifikke væv i mus. Dette blev opnået ved anvendelse af 18F-mærket fluordeoxyglucose (FDG) til at måle glucoseoptagelse og kinetisk modellering for at estimere satserne for 18F-FDG-optagelse fra plasmaet til det intracellulære rum, transporthastigheden fra intracellulære rum til plasma og hastigheden af 18F-FDG phosphorylering.
Hos gnavere er 18F-FDG blevet anvendt i præ-kliniske vurdering af talrige kræftbehandling 1, undersøgelser på tumorudvikling 2 og tumor metabolisme 3 samt billeddannelse af brune fedtdepoter 4, neuroinflamation 5 og hjerne stofskifte 6
Traditionelle metoder til at undersøge den vævsspecifikke optagelse af glucose i mus (og rotter) involverer generelt behandling med 2-deoxyglucose radioaktivt mærket med enten 3H eller 14C efterfulgt af eutanasi, væv indsamling og måling af radioaktivitet i hvert væv 7. Anvendelsen af PET / CT muliggør ikke-invasiv bestemmelse af glucoseoptagelse og metabolisme i flere organer og regioner samtidigt i levende dyr. Derudover, som eutanasi er ikke et krav, denne teknik er egnet til anvendelse i longitudinelle undersøgelser.
Type 2-diabetes mellitus (T2DM) er kendetegnet ved forstyrret glucosemetabolisme og hyperglykæmi sekundær til reduceret væv respons på insulin (insulinresistens) og den manglende evne af pancreas-celler til at producere tilstrækkelige mængder insulin 8. Kinetisk analyse af glukoseoptagelse og stofskifte kan give vigtig indsigt ivirkningsmekanismen og effekten af terapeutiske interventioner samt give mulighed for avanceret overvågning af sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet i denne undersøgelse blev godkendt af Sydney Local Health District og University of Sydney Animal etiske komitéer og fulgte NIH Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr, ottende udgave (2011).
1. Dyrepræparation
BEMÆRK: I denne protokol mandlige db / db-mus (BKS.Cg- Dock7 m + / + Lepr db / J) blev holdt i flokopstaldning med ad libitum adgang til foder og vand indtil 6 ugers alderen. På tidspunktet for billeddannelse, mus vejet ~ 30 g. Alle mus anvendes i denne protokol havde fastende blodglucoseniveauer mellem 10 og 14 mmol / l.
- Hvis det er nødvendigt, hurtigt musene. I det foreliggende eksempel, hurtigt musene i 5 timer forud for den eksperimentelle fremgangsmåde.
- Behandle mus med det ønskede middel (fx lægemiddel, protein, peptid) før påbegyndelsen af billeddannelse. I dette eksempel indgive en subkutan injektion af insulin (3U / kg humant insulin) eller ækvivalent volumen PBS 30 min før starten af billeddannelse.
2. Opsæt Workflow
BEMÆRK: Denne protokol blev gennemført på en PET / CT-scanner. Erhverve PET-data først, efterfulgt af købet af CT-data.
- PET-indstillinger:
- Vælg isotop som 18F, sæt scan varighed til 3.600 s, og øvre og nedre niveau diskrimination energi til 350 keV - 650 keV (standard) med et sammentræf timing vindue af 3.432 ns (standard). liste-mode data histogram til 16 rammer (6 × 10 s, 4 × 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 er) for periode 0 - 60 minutter efter sporstofinjektion. Rekonstruere emission sinograms ved hjælp af 2D-FBP med en zoom 1.5.
BEMÆRK: De rekonstruerede billeder bestod af 16 dynamiske rammer, hver med 128 × 128 × 159 voxel og en voxel størrelse på 0,52 × 0,52 × 0,796 mm3.
- Vælg isotop som 18F, sæt scan varighed til 3.600 s, og øvre og nedre niveau diskrimination energi til 350 keV - 650 keV (standard) med et sammentræf timing vindue af 3.432 ns (standard). liste-mode data histogram til 16 rammer (6 × 10 s, 4 × 60 s, 1 × 300 s, 5 × 600 er) for periode 0 - 60 minutter efter sporstofinjektion. Rekonstruere emission sinograms ved hjælp af 2D-FBP med en zoom 1.5.
- CT-indstillinger:
- Tilen hel krop CT-scanning, indstille den aktuelle ved 500 A, spænding på 50 kV, eksponeringstid 500 ms og 200 fremspring over en 360 rotation. Indstil detektoren synsfelt (FoV) til 30.722.048, antal bed positioner til 3 (for at dække hele PET FoV interval), overlapning mellem seng positioner = 30,234713% og detektor binning til 4.
BEMÆRK: genopbygning CT blev udført ved hjælp af kegle stråle tomografi rekonstruktion billede software med HU kalibrering, bilineær interpolation og Shepp-Logan-filter.
- Tilen hel krop CT-scanning, indstille den aktuelle ved 500 A, spænding på 50 kV, eksponeringstid 500 ms og 200 fremspring over en 360 rotation. Indstil detektoren synsfelt (FoV) til 30.722.048, antal bed positioner til 3 (for at dække hele PET FoV interval), overlapning mellem seng positioner = 30,234713% og detektor binning til 4.
- 18F-FDG:
- Bestille tilstrækkelig 18F-FDG (f.eks 450 MBq i 0,5 ml) fra en lokal leverandør at ankomme ~ 30 minutter før den første injektion. Alikvot og fortynde 18F-FDG så dyrene modtager ~ 10 MBq 18F-FDG i et endeligt volumen på 0,1 ml.
3. Imaging protokollen
- Tørre ned induktion kammer og billeddannelse seng med 80% (v / v) ethanol for at opretholde aseptiske forhold. Place musen i en induktion kammeret og bedøver med 5% isofluran i oxygen.
- Placer musen på et billeddannende bed forsynet med en elektrisk varmepude for at opretholde legemstemperatur og en præcision vaporizer næsekeglen at levere isofluran (vedligeholdelse, 1,5 - med 2%) ved en strømningshastighed på 1 l / min. Anvende oftalmisk salve på øjne til at forhindre tørhed mens under anæstesi.
- Anbring musen i liggende stilling på en sensor pad at overvåge vejrtrækning og sikre en passende plan af anæstesi opretholdes.
- Opvarme halen under anvendelse af en varmepude for 1 - 2 min for at dilatere den laterale halevene. Selvkaterisation den laterale halevene ved at indsætte en 30-gauge kanyle i den laterale halevene. Fastgør nålen på plads med kirurgisk lim og fastgør kateteret.
- Belastning imaging seng i scanneren og flytte sengen gennem maskinen, således at kateteret kan tilgås fra bagsiden af maskinen.
- Fastgør katetret til 18F-FDG sprøjte i en syringe-driver. Beregne den nøjagtige 18F-FDG dosis (10 MBq) baseret på aktivitet i sprøjten før injektion og mængden, der skal indgives (<100 pi, injiceret over 10 s).
- At minimere virkningerne af anæstesi om variabilitet af glukoseoptagelse, sikre en konstant tid mellem induktion af anæstesi og injektion af 18F-FDG (fx 30 minutter).
- Påbegynde PET-scanning umiddelbart før injektion af 18F-FDG. Efter afslutning af PET-scanning (3.600 s), udføre en CT-scanning (~ 10 min) for at give mulighed for co-registrering af radiotracer-optagelse med væv.
- Flyt billeddannende seng til udgangspositionen, fjernes dyret fra sengen.
- På dette tidspunkt aflive dyret eller lade det komme sig:
- For eutanasi udføre cervikal dislokation, mens de stadig under anæstesi og indsamle organer af interesse til efterfølgende analyse.
- Hvis tillade musen at komme sig, placeres musen i enkelt hus på en varmepude ellerforan en varmelampe. Overvåg musen, indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Tillad musen til at restituere i 1 time før vender tilbage til flokopstaldning.
4. PET Billedbehandling
BEMÆRK: Billede rekonstruktion blev udført ved hjælp af erhvervelse arbejdspladsen software v1.5.0.28 og analyse i forskning arbejdspladsen software V4.2.
- Co-registrere CT- og PET billeder og sikre, at tilpasningen er korrekt i alle 3 dimensioner.
- I menuen 'Filer', vælg 'Mappe Søg / Import', og vælg den mappe, der indeholder dataene. Vælg de ønskede PET og CT-data og klik på fanen 'Generelt Analysis'.
- Sorter data, så CR er udpeget 'Source' og PET er udpeget 'Mål'. I 'Arbejdsgang' skal du vælge 'Registrering'. Hvis billederne kræver justering for at være korrekt co-registreret, bruge værktøjerne i the 'Registrering' menuen.
- I 'Arbejdsgang' skal du vælge 'ROI Kvantificering'.
- Brug 'Pan' og 'Zoom' funktioner i fanen 'Billede' for at finde den ønskede region. I menuen 'Funktioner', vælg 'Opret' fanen og klik på ikonet pensel. Tegn ROI på billedet
- Uddrag tid-aktivitet-kurver ved at vælge 'Gem ROI Kvantificering' fra 'Gem' i menuen. Gem dataene som en CSV-fil.
- Kvantificere radioaktivitet optagelse som Bq pr cm3 væv. Konvertere værdier i procent af injiceret dosis pr cm3 (% ID / cm3) ved at indlæse CSV-filen i et regneark.
5. Indgang Funktion
- For at korrigere for systemet punktspredningsfunktion, deconvolve den anslåede systemet PSF til 5 iterationer under anvendelse af reblurred Van Cittert udfoldningsmetode som tidligere beskrevet 9.
BEMÆRK: Dette er nødvendigt på grund af den lille størrelse af vena cava i en mus. - Anvende post-dekonvolution billeder til at generere en blod inputfunktion tid-aktivitet-kurven som beskrevet ovenfor.
6. Kinetic Modeling
BEMÆRK: FDG to-vævsområde model (figur 1) kræver plasma input-funktionen.
- Konvertere blodet inputfunktion i CSV-filen til plasmaet input funktion ved hjælp af følgende ligning 10: Input_plasma = Input_blood × (0,386 e - 0.191t + 1,165).
- I den kinetiske modelleringsværktøj klikke på knappen 'Kinetic'. Importer vævet og plasma samlede aktivitet tæller CSV-filer i den kinetiske modelleringsværktøj ved at vælge 'Load Time Aktivitet Curve' fra 'Menu'.
- I menuen 'Model' vælge 2 væv rum. Sørg for, at feltet ved siden af K4 er fravalgtog indtaste en værdi på 0. For indledende tilpasning, markeringen i feltet for vB (fraktion blodvolumen) og angive en værdi på 2%.
- Klik på 'Fit aktuelle område'. Korrigere den ekstraherede regionen af interesse til dispersion 11, 12. Opnå dette ved at minimere Chi-square værdi for FDG model for forskellige dispersion tidspunkter.
- Udføre en anden pasform med flydende vB værdi (kontrollere feltet ud for feltet for vB) og den optimerede dispersionsværdi at beregne de regionale hastighedskonstanter (k 1 -k 3). Beregne den regionale indstrømningskonstanten som Ki = (k 1 × k 3) / (k 2 + k 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere anvendt db / db-mus model til at undersøge virkningen af stigende plasma apo A-I-niveauer på kinetikken af glucoseoptagelse og metabolisme 13. I denne undersøgelse anvendte vi db / db-mus blev behandlet med insulin til at demonstrere anvendeligheden af PET / CT billeddannelse til at overvåge optagelse af 18F-FDG fra plasmaet i musculus gastrocnemius i realtid.
Seks uger gamle db / db-mus blev bedøvet og behandlet med 3 U human insulin / kg, eller tilsvarende volumen PBS via subkutan injektion 30 minutter før starten af PET-scanning. Mus modtog 10 MBq 18F-FDG via intravenøs injektion og optagelse målt ved PET i 60 minutter. En CT-scanning blev udført i anatomisk reference.
Regioner af interesse blev trukket på vena cava og gastrocnemiusmuskel hjælp af CT-billeder (Figur 2). Behandling af db / db mus med insulin øgede 18F-FDG-aktivitet i gastrocnemius ROI løbet erhvervelse tidsperiode (figur 3A). De opnåede resultater for vena cava ROI værdier blev konverteret fra blod til plasmaværdier og blev ikke ændret ved insulinbehandling i insulin-behandlede mus i forhold til kontrol (figur 3B).
Tid Aktivitet kurver blev indlæst i kinetisk modellering værktøj til beregning af kinetiske parametre. Dataene blev indledningsvis tilpasses til en to-vævsområde metode med k 4 = 0 med en V b (volumenfraktion blod) -værdi på 2% for at beregne dispersionsværdierne (80 s og 70 s for PBS og insulin behandlede mus, henholdsvis). Montering blev derefter udført under anvendelse af ovennævnte dispersionsværdier og en flydende Vb værdi.
Ingen signifikant forskel i antallet af 18 F-FDG transport fra den arterielle plasma til det intracellulære rum (k 1) eller fra det intracellulære rum til plasma (k 2) blev observeret i insulin-behandlede mus sammenlignet med kontrol (tabel 1). Hastigheden af 18F-FDG phosphorylering (k3) var signifikant forøget i insulin-behandlede mus (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 x 10 -2 min-1 for PBS og insulin-behandlede grupper, henholdsvis; p <0,05 ). Insulinbehandling også signifikant forøget tilstrømningen konstant (Ki) sammenlignet med de PBS-behandlede dyr (5,51 ± 4,25 x 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 x 10 -3 ml min-1 g -1 henholdsvis; p <0,05).
Figur 1: Regionale tid-aktivitet-kurver blev tilpasset til en to-tissu e, tre-compartment model, med C1 er koncentrationen af FDG i plasma og C2 og C3 koncentrationen af FDG og phosphoryleret FDG i væv, henholdsvis. k 1 repræsenterer FDG optagelseshastighed i væv, k 2 clearance-hastigheden fra vævet tilbage til plasmarummet og k3 den phosphoryleringshastighed af FDG. Dephosphorylering af FDG blev antaget at være ubetydelig (k 4 = 0).
Figur 2: Eksempel på tegning af områder af interesse i musculus gastrocnemius (A) og vena cava (B) på en co-registreret PET-CT billede. Klik her for at se en større version af dette tal.
OAD / 55.184 / 55184fig3.jpg"/>
Figur 3: Time-aktivitet-kurver for områder af interesse i musculus gastrocnemius (A) og vena cava (B). Mandlige db / db-mus blev fastet i 4,5 timer før modtagelsen 3 U / kg insulin (rød) eller ækvivalent volumen PBS (sort). 18F-FDG (10 MBq) blev leveret via intravenøs injektion og 18 F-FDG-niveauer i musculus gastrocnemius og vena cava bestemt ved PET / CT i 60 minutter. Værdier er gennemsnit ± SD og udtrykt som procent af injiceret dosis, beregnet ud fra en fuld synsfelt (n = 4 / gruppe). Modificeret fra Cochran et al. 13 Klik her for at se en større version af dette tal.
| Behandling | k 2 | k 3 | Ki | |
| (ml min-1 g -1) | (min-1) | (min-1) | (ml min-1 g -1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 x 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 x 10 -3 | 5,51 ± 4,25 x 10 -4 |
| Insulin | 1,45 ± 0,59 x 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 x 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 x 10 -3 * |
Tabel 1: Kinetisk analyse af øget 18F-FDG fra plasma til musculus gastrocnemius i insulin behandlede db /db mus. Værdier er middelværdi ± SD. * P <0,05 vs. PBS ifølge en Mann-Whitney-test (n = 4 / gruppe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her repræsenterer en robust, ikke-invasiv metode til at bestemme kinetikken af glucoseoptagelse fra blodstrømmen i væv og efterfølgende metabolisme i mus.
Db / db-mus er en er en veletableret dyremodel for type 2-diabetes 14, der er blevet anvendt i vid udstrækning til at undersøge insulinresistens og relevante indsatser. Imidlertid har tidligere undersøgelser kun kvantificeret endpoint optagelse i hjertet 15 og hjerte- og skeletmuskulatur 16.
Anvendelsen af kinetisk analyse for at bestemme fysiologiske hastighedskonstanter og modellere optagelsen af 18F-FDG fra plasma i væv muliggør indsigt i virkningen af antidiabetiske behandlinger på glucoseoptagelse og metabolisme. Desuden kan udføres disse forsøg på langs for at vurdere, for eksempel effekten af alder eller kost på glucosemetabolisme. Dette er advantageous i forhold til traditionelle metoder, der kræver aktiv dødshjælp og indsamling af organer af interesse og dermed giver oplysninger kun på et enkelt tidspunkt.
Mens indgangsfunktioner tidligere er blevet bestemt ved anvendelse af hele hjertet 17 samt hjerte, lever og et blodprøver 18 i mus, der er beskrevet her protokol tillader beregning af input funktion med et område af interesse over vena cava 19. Det er også muligt at beregne input funktioner ved hjælp arterielle blodprøver i løbet af en PET-studie. Dette er imidlertid upraktisk på grund af den lille blodvolumen hos mus.
Anvendelsen af et plasma inputfunktion snarere end 18 F-FDGsignal i helblod skyldes optagelsen af 18F-FDG i muse røde blodlegemer 20. Endvidere de røde blodlegemer associeret aktivitet betegner 18F-FDG inde røde celler og dermed erikke let tilgængelige for transport i andre vævsrum.
I denne protokol, er det afgørende at sikre korrekt placering af kateteret anbragt i halevenen til afgivelse af 18F-FDG bolus til vena cava og i hele kroppen af musen. Opvarmning af halen for at dilatere halevenen signifikant forbedrer den lethed at indsætte dette kateter. Det er også vigtigt at sikre, at PET og CT-billeder er korrekt coregistered så ROI'er trukket på CT billedet korrekt svarer til PET-signalet.
Der er en vis debat om valget af bedøvelsesmidlet i studier undersøger glukoseoptagelse. Mens isofluran er en almindeligt anvendt veterinær bedøvelsesmiddel kan anvendelsen af sevofluran være fordelagtig i 18 F-FDG PET eksperimenterne 21. I denne protokol, er det vigtigt at sikre, at enhver potentiel skævhed forbundet med isofluran anæstesi minimeres ved at holde tid mellemeen induktion af anæstesi og påbegyndelse af billeddannende konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
- Jensen, M. M., Kjaer, A. Monitoring of anti-cancer treatment with (18)F-FDG and (18)F-FLT PET: a comprehensive review of pre-clinical studies. Am J Nucl Med Mol Imaging. 5, 431-456 (2015).
- Duncan, K., et al. (18)F-FDG-PET/CT imaging in an IL-6- and MYC-driven mouse model of human multiple myeloma affords objective evaluation of plasma cell tumor progression and therapeutic response to the proteasome inhibitor ixazomib. Blood Cancer J. 3, e165 (2013).
- Wang, Y., Kung, A. L. 18F-FDG-PET/CT imaging of drug-induced metabolic changes in genetically engineered mouse lung cancer models. Cold Spring Harb Protoc. 2015, 176-179 (2015).
- Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radu, C. G., Shu, C. J., Shelly, S. M., Phelps, M. E., Witte, O. N. Positron emission tomography with computed tomography imaging of neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1937-1942 (2007).
- Toba, S., et al. Post-natal treatment by a blood-brain-barrier permeable calpain inhibitor, SNJ1945 rescued defective function in lissencephaly. Sci Rep. 3, 1224 (2013).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Overexpression of hexokinase II increases insulinand exercise-stimulated muscle glucose uptake in vivo. Am J Physiol. 276, E70-E77 (1999).
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58, 773-795 (2009).
- Tohka, J., Reilhac, A. Deconvolution-based partial volume correction in Raclopride-PET and Monte Carlo comparison to MR-based method. NeuroImage. 39, 1570-1584 (2008).
- Wu, H. M., et al. et al. In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med. 48, 837-845 (2007).
- Oikonen, V. Model equations for the dispersion of the input function in bolus infusion PET studies. , Available from: http://www.turkupetcentre.net/reports/tpcmod0003.pdf (2002).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 536-545 (1986).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [18F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59, 1977-1984 (2016).
- Kobayashi, K., et al. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism. 49, 22-31 (2000).
- Yue, P., et al. Magnetic resonance imaging of progressive cardiomyopathic changes in the db/db mouse. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292, H2106-H2118 (2007).
- Hagberg, C. E., et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 490, 426-430 (2012).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. J Nucl Med. 54, 132-138 (2013).
- Tantawy, M. N., Peterson, T. E. Simplified [18F]FDG image-derived input function using the left ventricle, liver, and one venous blood sample. Molecular imaging. 9, 76-86 (2010).
- Thorn, S. L., et al. Repeatable noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG: evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med. 54, 1637-1644 (2013).
- Wagner, R., Zimmer, G., Lacko, L. An interspecies approach to the investigation of the red cell membrane glucose transporter. Biochim Biophys Acta. 771, 99-102 (1984).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Mol Imaging Biol. 10, 192-200 (2008).
