Summary
Restenosis na cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Een ideale therapie zou de proliferatie van gladde spiercellen (VSMC) verhinderen, terwijl het bevorderen van regeneratie van het endothelium. We beschrijven een model voor gelijktijdige beoordeling van VSMC proliferatie en endotheliale functie in vivo.
Abstract
Arteriële reconstructie, ofwel angioplastiek of bypass-operatie, omvat iatrogene trauma waardoor endotheliale verstoring en vasculaire gladde spiercellen (VSMC) proliferatie veroorzaakt worden. Gemeenschappelijke muizenmodellen bestuderen kleine vaten, zoals de carotis- en femorale slagaders. Hierin beschrijven we een in vivo systeem waarin zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie gelijktijdig in een groot vat kunnen worden beoordeeld. We bestudeerden het infrarenale aorta respons op letsel in C57BL / 6 muizen. De aorta werd gewond van de linker nierader naar de aorta bifurcatie door 30 transmurale verpletteringen van 5 seconden duur met een katoenstippel applicator. Morfologische veranderingen werden beoordeeld met conventionele histologie. Aorta wanddikte werd gemeten van het luminale oppervlak naar de adventitia. EdU-integratie en tellerverf met DAPI en alfa-actine werd gebruikt om VSMC proliferatie te demonstreren. Activatie van ERK1 / 2, een bekende moderator van intimale hyperplasievorming, was afschrikkelijkOntgonnen door Western Blot analyse. Het effect van ontsteking werd bepaald door immunohistochemie voor B-cellen, T-cellen en macrofagen . En gezichtsafdelingen van endothelium werden gesynchroniseerd met scan-elektronenmicroscopie (SEM). Endotheliale barriere functie werd bepaald met Evans Blue staining. Transmurale letsel leidde tot verdikking van de aorta wand. Deze verwonding veroorzaakte VSMC proliferatie, meest prominente bij 3 dagen na verwonding, en vroege activatie van ERK1 / 2 en verminderde p27 kip1 expressie. Schade leidde niet tot verhoogde B-cellen, T-cellen, of macrofagen infiltratie in de vat van het vat. Schade veroorzaakte deelement van de endotheliale cel en verlies van cel-celcontact. Schade resulteerde in een significant verlies van de endotheliale barrière functie, die na zeven dagen terug naar de basislijn kwam. Het murine transmurale stomp aorta schade model biedt een efficiënt systeem om zowel VSMC proliferatie als endotheliale barrière functie in een groot vat te bestuderen.
Introduction
restenose Volgende cardiovasculaire procedures (bypass operatie, angioplastie of stenting) is een significant probleem waardoor de duurzaamheid van deze procedures wordt verminderd. Alle revascularisatieprocedures worden geplaagd door restenose. Huidige strategieën ter voorkoming van restenose (drug-eluerende stents en geneesmiddelcoated ballonnen) remmen zowel vasculaire gladde spiercellen (VSMC) en endotheliale cel proliferatie (EC). Bijgevolg voorkomen deze interventies VSMC gemedieerde restenose, maar voorkomen ook de regeneratie van het endothelium. Zonder een intact endothelium, zijn patiënten verplicht te zijn op krachtige antiplatelet middelen om het risico op in situ trombose te verminderen met het risico op bloedingen complicaties. Een ideale therapie zou VSMC proliferatie remmen, terwijl het bevorderen van de regeneratie van het endothelium. Zo is er een noodzaak om tegelijkertijd de VSMC proliferatie- en endotheliale barrièrefunctie in n vivo te bestuderen.
Momenteel zijn er ernstigeAl muismodellen van restenose 1 . Deze modellen omvatten carotid ligatie en femorale arterie draad verwonding 2 . Aortische modellen omvatten stentplaatsing 3 , ballonbesering 4 en aorta-allograft 5 . Alle huidige modellen zijn beperkt. Carotidligatie genereert een doorstroming gemedieerde neointimale laesie en heeft geen endotheel letsel. Bovendien hebben zowel carotide- als femorale slagaders veel vallen minder cellagen dan menselijke vaten, waardoor hun translatiewaarde wordt beperkt. De aorta van de muis die ongeveer 1,3 mm in diameter is, is het enige vat dat een klinisch relevante (coronaire) menselijke slagader benadert (3).
Ondanks het translatiepotentiaal van muizen aorta modellen van ziekte, hebben huidige modellen beperkingen. Deze modellen vereisen geavanceerde microchirurgische vaardigheden en gespecialiseerde apparatuur zoals angioplastiekballonnen en stents. Hierin presenteren weEen nieuwe, reproduceerbare techniek om tegelijkertijd VSMC proliferatie te induceren en endotheliale barrièrefunctie te verstoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiekverklaring: De protocollen voor dierhantering werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Maryland (protocol nummer 0416009) en uitgevoerd volgens de AAALAC-internationale normen.
1. Chirurgische procedure
- Anesthetische techniek
- Steriliseer alle instrumenten die worden gebruikt in overlevingskirurgie met stoomsterilisatie bij 121 ° C gedurende 30 minuten.
- Anesthesie via een inductietank met 100% O2 en 2,5% isofluraan afgeven via precisieverdamper. Na inductie, stop de isofluraan en spoel de kamer met O2. Anesthesie onderhouden met 1,5-2% isofluraan via gezichtsmasker en 1 L / min O 2 bij inademing.
- Bevestig zowel de inductiekamer als het gezichtsmasker aan een houtskoolafscheider voor afzuigafzetting om personeel te beschermen. Zorg voor een adequaat verdovingsplan door demonstratieDaarbij is er geen reactie op schadelijke stimuli (toe knijp).
- Creëer een operatief veld bestaande uit een chirurgische dienblad met isothermisch pad om thermische ondersteuning tijdens de operatie te verschaffen. Een extra isothermisch pad zorgt voor thermische ondersteuning voor dieren in hun herstelkooi.
- Dierlijke bereiding
- Voer het volgende onderzoek uit op 10-12 weken oude mannelijke C57BL / 6 muizen.
- Verwijder het haar op het ventrale buikoppervlak van het dier van het baarmoeder naar het inguinale gebied met een depilator of een elektrische klipper met een nummer 40 blad.
- In geval van depilatory agent, voeg deze verbinding toe op het chirurgische gebied gedurende 2-3 minuten en verwijder het dan met katoen. We gebruiken een in de handel verkrijgbare verbinding van calciumhydroxide en natriumhydroxide.
- Prep het gebied over de schouder met 70% alcohol en injecteer carprofen (5 mg / kg) subcutaan met een 25 gauge of kleinere boornaald. DezeDe behandeling zal postoperatieve analgesie voor het dier verschaffen.
- Verplaats het dier naar het chirurgische veld en plaats in dorsale recumbency.
- Bereid de chirurgische plaats door 8-12% providone-jodium te schrobben met een schone katoen applicator of katoen gaas. Spoel vervolgens de huid twee keer met 70% alcohol.
- Plaats oculair smeermiddel in beide ogen om de incidentie van corneale uitdroging te verminderen. Bedek de chirurgische plaats met een steriele draperie.
- Operatieve techniek
- Maak een median buiklaparotomie incisie ongeveer 2-2,5 cm lang met een scalpel begin onmiddellijk caudal het xiphoide proces en uitstrekken naar het bekken.
- Mobiliseer de darm en duodenum en zijwaarts naar rechts. Rol een strook steriele katoen door en bedekt met steriele zoutoplossing voor injectie om de viscera te verpakken om de blootstelling te verbeteren.
- Met de dunne darm gemobiliseerd naar de rechterkant van deBuik, de retroperitoneum blootstellen en de abdominale aorta van de linker nierader naar de aorta bifurcatie blootstellen ( Figuur 1 ).
- Met een steriele katoenen tip applicator, leveren 30 opeenvolgende knuffels, elke vijf seconden in de duur.
- Verwijder de verpakking en laat de viscera terugkeren naar hun oorspronkelijke positie.
- Sluit fascia met een lopende 4-0 absorberende monofilament hechting (polydioxanon). De huid is gesloten met een lopende 6-0 niet-absorbeerbare monofilament hechting (nylon).
- Herstel en post-procedure zorg
- Plaats de dieren in een herstelkooi met schoon beddengoed op een isotermisch pad om de thermische ondersteuning te doorlopen totdat het dier normaal kan ambuleren. Verlaat het dier niet toezicht totdat het het vermogen toont om sternale recumbency te onderhouden.
- Monitor het dier elke uur voor de eerste 4 uur na de operatie. Zodra het dier ambulerend is, ga ik normaal terug T naar de toegewezen boerenkamer. Het dier wordt niet gehuisvest in het gezelschap van een ander dier totdat het volledig is hersteld.
- Monitor het dier tweemaal daags gedurende de eerste 72 uur na de operatie en tenminste 3 keer per week daarna. Monitoring omvat het wegen van het dier drie keer per week.
- Administreer carpofen (5 mg / kg) tweemaal daags subcutaan gedurende de eerste 72 uur na de operatie.
2. Aankoop van Weefsel
- Methode van Euthanasie
- Euthanize de dieren op vooraf bepaalde tijdspunten.
- Anesthesie via een inductietank met 100% O2 en 2,5% isofluraan afgeven via precisieverdamper.
- Om de integriteit van het endothelium te bestuderen, geef Evans Blue kleurstof aan het dier.
OPMERKING: Evans Blue is een negatief geladen azofleurstof met een hoge bindingsaffiniteit voor albumine en kan alleen bloedvaten vinnen in afwezigheid van een intact endotheelS = "xref"> 6. - Voor endothelial integrity studies, op het tijdstip van euthanasie, perfuse de dieren met 5 ml van 0,3% Evans Blue kleurstof gevolgd door 5 mL PBS bij fysiologische druk gedurende 5 min. Het dier wordt gehandhaafd in een chirurgisch vlak van verdoving tijdens de perfusieprocedure.
- Om de integriteit van het endothelium te bestuderen, geef Evans Blue kleurstof aan het dier.
- Na het bereiken van een diep anesthetisch vliegtuig, open de borst met een sternotomie. Maak een laceratie in het rechter atrium om de afvoer van bloed uit het dier mogelijk te maken en toegang tot de linker ventrikel is toegankelijk met een 21 G-naald en injecteer fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot het effluent van het rechter atrium duidelijk is.
- Na perfusie met PBS, ga de buik binnen door middel van een incisie.
- Nogmaals mobiliseer de dunne darm aan de rechterkant van de buik die de infrarenale aorta blootstelt, ontleed de aorta van aangrenzende weefsels en accijns het van de linker nierader naar de aorta bifurcatie.
- Bewaar de uitgesneden aorta in een 4% paraformaalEhydraatoplossing tot weefselverwerking optreedt.
- Voor endotheliale integriteitstudies, open de aorta in de lengterichting en knijp het op een wasblad dat de helft van het luminale oppervlak 6 blootstelt. Voer een kwalitatieve beoordeling van de endotheliale integriteit uit door de mate van kleuring met Evans Blue Dye 6 .
- Voor andere histologische analyses, snijd de aorta dwars door en integreer deze in optimale snijtemperatuur (OCT) verbindingen zoals bepaald door de histologische methode die moet worden gebruikt 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transversale afdelingen aorta ingebed in OCT werden gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine, vervolgens teller gekleurd met Verhoeff-Van Gieson (VVG) vlek om de interne en externe elastische lamina 7 te identificeren. Crush injury veroorzaakte aorta wandverdikking in vergelijking met de aorta's van dieren die werden behandeld met een sham procedure (alleen laparotomie en kleine darm mobilisatie). De wanddikte, zoals beoordeeld door de afstand van adventitia tot het lumen, was het beste drie dagen na het letsel (42,2 ± 1,7 μm versus 22,1 ± 1,1 μm alleen voor laparotomie) ( Figuur 2A-B ). Schade heeft ervoor geleid dat de cellen een meer afgeronde uitstraling hebben en een onregelmatige contour van het luminale oppervlak ( Figuur 2C ).
Verhoogde wandverdikking van de gewonde aorta wordt ten minste gedeeltelijk gemedieerd door verhoogde proliferatie van mediale vasculaire gladde muizenCle cellen. Om te bewijzen dat de verdikking van de muur is toe te schrijven aan een verhoogde proliferatie in tegenstelling tot celhypertrofie, hebben we een EdU proliferatie-test gebruikt. Bij deze analyse wordt het thymidine-analoog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) intraveneus toegediend aan de muis 24 uur voor euthanasie. EdU is opgenomen in DNA tijdens synthese. EdU wordt gedetecteerd door een klikreactie (koper gekatalyseerde azide-alkyn cycloaddition met behulp van groen-fluorescerende kleurstof) 8 . Sham muizen blootgesteld aan laparotomie had geen waargenomen fluorescentie in een laag van de aorta. Conversley, muizen die onderworpen zijn aan aorta-schade toonde fluorescentie in zowel de media als de intima van de aorta ( Figuur 3 ).
Aortische wandverdikking na crush-schade activeert cel signaleringswegen die betrokken zijn bij restenose bij mensen. Het mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAP Kinase) ERK1 / 2 is een van de belangrijkste mediators van intimale hyperplasievormingAls reactie op stimulatie uit een mitogeen wordt ERK1 / 2 gefosforyleerd en geactiveerd 9 , 10 . Gegevens uit ons laboratorium hebben ook aangetoond dat de cyclinafhankelijke kinaseremmer p27 kip1 afneemt in reactie op mitogene stimuli in de vatwand 12 . Muizen werden geëuthaniseerd op 1, 3, 7 dagen en 1 maand na aorta crush letsel. De infrarenale aorta werd geïsoleerd en eiwituitdrukking van ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 (de geactiveerde vorm van ERK1 / 2) en de cyclinafhankelijke kinaseremmer p27 kip1 werden bepaald door Western blot analyse ( Figuur 4A ). Er werd geen verandering waargenomen in de totale ERK1 / 2 eiwituitdrukking in de tijd. Echter, drie dagen na verwonding was fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) expressie ruim 200% groter dan de uitgangspunt Pi-ERK1 / 2 expressie. P27 kip1 expressie daalde op vroege tijdspunten en bereikte een nadir van ongeveer 20% van de basislijn zeven dagen afTer verwonding. Zowel Pi-ERK1 / 2 als p27 kip1-expressie benaderden basislijnniveaus één maand na verwonding ( Figuur 4B ). Zo is de waargenomen verdikking van de aorta wand tenminste gedeeltelijk toe te schrijven aan verhoogde mediale proliferatie.
Het aorta schade model maakt gelijktijdige beoordeling van zowel mediale gladde spier proliferatie en endotheliale barriere functie mogelijk. Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) werd gebruikt om het effect van het geliefde letsel op de morfologie van het endothelium te karakteriseren. Het luminale oppervlak van de aorta is gevoerd door een confluent endotheel dat adhesie van bloedgeboren cellen en moleculen voorkomt ( Figuur 5A , Schaalbalk = 100 μm). Daarentegen leidt crush injury tot ontwrichting van endotheliale cellen en gedeeltelijke ontduiking van het endothelium ( Figuur 5B , Scale bar = 100 μm). Zoals gezien bij hogere vergroting, resulteert verstoring van het endothelium in adhesieOp deeltjes consistent in grootte en vorm met bloedplaatjes. Adhesie van deze deeltjes komt voor in de gehele zone van letsel en is niet beperkt tot gebieden met brutale ontwrichting waargenomen bij lagere vergroting ( Figuur 5C , Schaalbalk = 50 μm). De morfologie van het hechtende deeltje wordt het best waargenomen bij hogere vergroting. Deze deeltjes zijn consistent met bloedplaatjes en fibrine ( Figuur 5D , Schaalbalk = 10 μm).
Naast endotheliale morfologie kan de barrièrefunctie van het endothelium worden beoordeeld met dit model van vaatverwonding. De azo-kleurstof Evans Blue kan het normale, intacte endothelium van de aorta niet doordringen. Schade aan de barrièrefunctie van het endothelium maakt het mogelijk om het keldermembraan met Evans Blue te vleken. Muizen die alleen op een laparotomie werden behandeld (sham) behield de barrièrefunctie van het endothelium en deze aorta's waren wit. Crush letsel resulteerde in aDiffuse verlies van endotheliale barriere functie en deze aorta's bleek donkerblauw. De intensiteit van het vleken met Evans Blue was drie dagen na de crushbeschadiging verlaagd en de volledige barrièrefunctie werd hersteld op week na verwonding ( Figuur 6A ). Endotheliale barriere functie kan verder gekwantificeerd worden door de monsters af te wegen en homogeniseren in 10-voudig volume van 50% trichloorazijnzuuroplossing. Het verdunnen van de supernatant in 4-voudige ethanol maakt het mogelijk om de fluorescentie-intensiteit te bepalen (excitatie 620 nm en emissie 680 nm) zoals beschreven door Aoki et al . 11 . De hoeveelheid Evans Blue, die uit de infrarenale aorta werd geëlueerd, was onmiddellijk na het letsel meer dan drie keer hoger in aorta dan in vergelijking met aorta die slechts aan laparotomie onderworpen werden (gewond - dag 0). De aorta bleef één en drie dagen na het letsel, maar minder intens dan bij het letsel, vlekvlekken met Evans Blue, wat een geleidelijke herstel van de endotheliale barrièrefunctie voorstelde. Een week achterHet letsel van de gewonde aorta had gelijkwaardige kleuring als een aorta die alleen met laparotomie was behandeld ( Figuur 6B ).
Figuur 1: Schade wordt gecreëerd door de Aorta van de linker-renale ader aan de Aortic Bifurcation te knuffelen. Figuur aangepast met toestemming van Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Crush Injury veroorzaakt Aortic Wall Dickening. ( A ) Crush injury veroorzaakt morfologische veranderingen in de aorta. Representatieve 5 μm dwarsdoorsneden werden gekleurd met VVG bij 0,1, 3 en 7 dagen na het letsel. Schaalstaven = 100 μm. ( B ) De dikte van de muur was het grootste 3 dagen na het letsel, 42,2 ± 1,7 μm, en was significant groter dan de aorta van schamdieren blootgesteld aan laparotomie alleen, 22,1 ± 1,1 μm. Statistische significantie werd bepaald met de student's tweestaart t-test. * Duidt op p <0,05, n = 3. ( C ) Crush letsel veroorzaakte een afgeronde uitstraling van mediale VSMCs (in groen gekleurd voor a-gladde spieractin) en veranderende celoriëntatie. Nuclei werden tegensterkte met DAPI (Blue). Schaalstaven = 10 μm. Gegevens worden weergegeven als middel en standaardafwijkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Crush injury veroorzaakt Cell ProlifeRantsoen in de Aortische Muur. Muizen werden blootgesteld aan laparotomie alleen (sham) of laparotomie met aorta crush letsel. Thymidine-analoog 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) werd 24 uur voor euthanasie toegediend. EdU is opgenomen in DNA tijdens synthese. EdU wordt gedetecteerd door een klikreactie (koper gekatalyseerde azide-alkyn cycloaddition met behulp van groen-fluorescerende kleurstof). Er was geen detecteerbare EdU (groen) in de aortamuur van de schamdieren. Bij de dieren die onder druk kwamen, bleek EdU prominent in de media van de aorta en in ietwat minder mate in de intima. Vasculaire gladde spiercellen werden geïdentificeerd door kleuring met a-gladde spieractine-antilichaam (rood). Deze bevinding suggereert dat de waargenomen muurverdikking, waargenomen in figuur 2, het gevolg is van een toename in celproliferatie. Schaalstaven = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit beeld te ziene.
Figuur 4: De Mitogen-Geactiveerde Proteïne Kinase (MAP Kinase) Pathway is geactiveerd in reactie op Crush Injury. ( A ) De MAP Kinase ERK1 / 2 wordt geactiveerd en geassocieerd met intimale hyperplasie en restenose. Muizen werden geëuthaniseerd op 1, 3, 7 dagen en 1 maand na aorta crush letsel. Western blot analyse werd gebruikt om eiwit expressie van totaal ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 en de cyclin-afhankelijke kinaseremmers p27 kip1 te beoordelen . Proteïne expressie werd genormaliseerd aan een scham dier dat alleen met laparotomie werd behandeld. ( B ) Er werd geen verandering waargenomen in de totale ERK1 / 2 eiwit expressie in de tijd. Echter, drie dagen na verwonding was fosfor-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) expressie ruim 200% groter dan de uitgangspunt Pi-ERK1 / 2 expressie. P27 kip1 expressie daalde bij vroege tijdspunten anD bereikde een nadir van ongeveer 20% van de basislijn zeven dagen na het letsel. Beide Pi-ERK1 / 2 en p27 kip1 expressie benaderden basislijn niveaus één maand na verwonding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Crush Injury verstoort aorta endothelcellen. ( A ) Scanningelektronmicroscopie (SEM) werd gebruikt om het effect van het geliefde letsel op de morfologie van het endothelium te karakteriseren. Het luminale oppervlak van de normale aorta is gevoerd door een samenvloeiend endotheel dat adhesie van bloedgeboren cellen en moleculen voorkomt. ( B ) Crush letsel resulteert in de verstoring van endotheliale cellen en gedeeltelijke ontduiking van het endothelium. ( C ) Zoals gezien bij hogere magnificaVerdeling van het endothel resulteert in de hechting van deeltjes die in grootte en vorm consistent zijn met bloedplaatjes. Adhesie van deze deeltjes treedt door gedurende de gehele zone van letsel, en is niet beperkt tot gebieden met brutale ontduiking waargenomen bij lagere vergroting. ( D ) Bij hogere vergroting zijn deze deeltjes consistent met bloedplaatjes en fibrine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De onregelmatige aorta-letsel zorgt voor kwantificering van de endotheliale barrièrefunctie. ( A ) Schade aan de barrièrefunctie van het endothelium maakt het mogelijk om het keldermembraan te kleuren met Evans Blue-kleurstof. Muizen behandeld op een laparotomie alleen (sham) behield de barrière functie van het endothelium en thEse aorta's waren wit. Crush letsel resulteerde in een diffus verlies van endotheliale barriere functie en deze aortas bleken donkerblauw. De intensiteit van het vleken met Evans Blue werd drie dagen na de crushbeschadiging verlaagd en de volledige barrièrefunctie werd hersteld op week na verwonding. ( B ) Binding van Evans Blue aan de infrarenale aorta werd gekwantificeerd door Evans Blue uit het monster te elueren en kwantificering door fluorescentie-intensiteit. Gegevens worden weergegeven als middel en standaardafwijkingen. De meeste Evans Blue werd onmiddellijk na de crush verwond door de aorta geëlueerd. Op het moment van de blessure, de aorta gebonden driemaal keer meer Evans Blue dan de aorta alleen aan laparotomie onderworpen. Naarmate de aorta mocht herstellen, was er een en drie dagen na het letsel minder bindend. Een week na de geboorte gebonden de aorta dezelfde hoeveelheid Evans Blue als de aorta die alleen aan laparotomie onderworpen werden. Statistische significantie werd bepaald met de student's tweestaart t-test. * DeNotities p <0,05, n = 3, NS betekent niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben de effecten van een muizen aorta verwondingsmodel gekenmerkt, dat resulteert in mediale hyperplasie en endotheliale barriere dysfunctie. Gedeeltelijke EC-detachering langs de aorta-intima leidde tot het verlies van cel-celcontact en het verhogen van celuitstulpingen. Corresponderend was de endotheliale barrièrefunctie significant aangetast, die de mitogeengevoelige signaleringstrajecten stimuleerde, wat leidde tot proliferatie van VSMC's en verdikking van de vatwand. De sterkten van dit model zijn dat het technisch makkelijker is om te leren en uit te voeren dan andere aorta-modellen van de ziekte en het mogelijk maken van gelijktijdige beoordeling van zowel de proliferatieve respons op letsel en endotheliale functie. De kritische stap in dit protocol is de feitelijke crush injury. Variabiliteit in de mate van de crush injury kan resulteren in verschillende graden van letsel en dus variabele hoeveelheden gladde spiercel proliferatie. Een stap die deze variabiliteit in ons laboratorium vermindert, is om één s te hebbenCientist, verblind voor de behandeling of de experimentele conditie, voer alle crush verwondingen uit.
Een beperking van dit model is de algemeenheid van klinisch relevante menselijke ziekteprocessen. Ondanks de vroege robuuste proliferatieve respons van VSMC's in dit model, modelt het niet de late gebeurtenissen van restenose, dus geen neointima ontwikkeld. Verminderde ontstekingsmediatoren zoals cytokines zouden dit proces kunnen regelen. Deze bevinding kan het gevolg zijn van het snelle herstel van het endothelium van een gedeeltelijke verwonding. In vergelijking met een eerder gemeld vasculaire crush injury model in konijnen 13 , was infiltratie van immuuncellen klein. In het onderhavige onderzoek hebben we het profiel van inflammatoire cytokines geëvalueerd van de schamdieren en aortische schadelijke dieren met de profiler array. Er was echter geen significant verschil in het cytokineprofiel dat het verschil in de proliferatieve respons tussen sham en gewonde dieren zou verklaren (dataniet laten zien). Het letsel dat in dit rapport wordt beschreven is tijdelijk beperkt. Terwijl andere modellen van aortische verwonding en intimale hyperplasie, zoals het aorta-angioplastiemodel, het endotheel volledig ontkennen, wordt het aorta slechts gedeeltelijk ontleed aan het huidige model. Volledige afsluiting van het endothelium vereist aanzienlijk langer om te herstellen en deze dieren ervaren de gevolgen van letsel gedurende een langere periode.
Dit model produceert een snelle reactie van VSMC's en EC's op letsel waardoor kwantificering van morfologische en biochemische veranderingen in een week mogelijk maakt. Het is efficiënter dan andere modellen die 14 tot 28 dagen duren voordat het effect van de interventie duidelijk is. Dit model maakt gebruik van de murine aorta, het enige muizenvat dat een klinisch relevant menselijk vaartuig benadert. Het aanzienlijke voordeel van deze techniek in vergelijking met andere aorta modellen is dat dit model relatief makkelijk te leren is en dat het niet duur of moeilijk is om eq te verkrijgenUipment 2 , 3 , 4 , 5 . Ten slotte concludeert het muizen aorta crush injury model een technisch eenvoudig, goedkoop, efficiënt in vivo platform om de respons van VSMCs en EC's tegelijkertijd te evalueren op vaatbeschadiging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd gefinancierd door de afdeling Veterinaire Zaken Carrièreontwikkeling Award (1IK2BX001553-01) (TSM) en de Vasculaire Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Acknowledgments
Wij danken Hsia Ru-ching PhD, van de Electron Microscopy Core Facility van de Universiteit van Maryland School of Medicine, voor haar technische ondersteuning bij het verwerken van de scan elektronische microscopie monsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
