Summary
Kardiyovasküler prosedürleri takiben yapılan restenoz (baypas cerrahisi, anjiyoplasti veya stentleme) bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir sorundur. İdeal bir terapi düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonunu inhibe ederken endotelin rejenerasyonunu teşvik eder. VSMC çoğalması ve endotel fonksiyonunun in vivo olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için bir model tanımlıyoruz.
Abstract
Arteryel rekonstrüksiyon, ister anjiyoplasti ister baypas cerrahisi olsun, iyatrojenik travmayı endotel hasarına ve vasküler düz kas hücresi (VSMC) proliferasyonuna neden olur. Ortak fare modelleri karotis ve femoral arterler gibi küçük damarları inceler. Burada hem VSMC çoğalması hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda büyük bir kapta değerlendirilebildiği bir in vivo sistem tanımlanmaktadır. C57BL / 6 farelerde yaralanmaya karşı infrarenal aortik tepki üzerinde çalıştık. Aort, sol böbrek veninden aortik bifurkasyona 5 saniyelik sürtünme ile pamuk uçlu aplikatör ile yaralandı. Morfolojik değişiklikler konvansiyonel histoloji ile değerlendirildi. Aort duvar kalınlığı lüminal yüzeyden adventi- teye kadar ölçüldü. VSUc çoğalmasını göstermek için DUI ve alfa-aktin ile EdU entegrasyonu ve sayaç boyama kullanıldı. İntimal hiperplazi oluşumunun bilinen bir düzenleyicisi olan ERK1 / 2'nin aktivasyonu caydırıcıydıWestern Blot analizi ile çıkarıldı. Enflamasyonun etkisi, B hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar için immünhistokimyasal yöntemle belirlendi . Endotelin yüz bölümleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görselleştirildi. Evans Blue boyama ile endotel bariyer fonksiyonu belirlendi. Transmural yaralanma aort duvarı kalınlaşmasına neden oldu. Bu hasar, VSMC çoğalmasını, en belirgin şekilde yaralanmadan 3 gün sonra indükledi ve ERK1 / 2'nin erken aktivasyonu ve p27 kip1 ekspresyonunu azalttı. Yaralanma, damar duvarında artmış B-hücreleri, T-hücreleri veya makrofaj infiltrasyonuyla sonuçlanmadı. Yaralanma, kısmi endotel hücresi soyulmasına ve hücre-hücre temasının kaybına neden oldu. Yaralanma, endotel bariyer fonksiyonunda belirgin bir kayıp ile sonuçlandı ve bu, yedi gün sonra başlangıç noktasına döndü. Kemirgen transmüral künt aort yaralanması modeli, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu büyük bir kapta eşzamanlı olarak incelemek için etkili bir sistem sağlar.
Introduction
Restenoz (Bypass ameliyatı, anjiyoplasti veya stentleme) kardiyovasküler prosedürlerin ardından bu prosedürlerin dayanıklılığını azaltmakta önemli bir problemdir. Tüm revaskülarizasyon prosedürleri restenoz tarafından engellenmektedir. Restenozu (ilaç salınımlı stentler ve ilaç kaplı balonlar) önlemek için mevcut stratejiler hem vasküler düz kas hücresi (VSMC) hem de endotel hücre proliferasyonunu (EC) inhibe etmektedir. Sonuç olarak, bu müdahaleler VSMC aracılı restenozu engeller, aynı zamanda endotelin yenilenmesini önler. Sağlam bir endotel olmadan, hastaların, kanama komplikasyonları riski altında in situ tromboz riskini azaltmak için güçlü anti-platelet ajanlar üzerinde olması gerekmektedir. İdeal bir terapi, endotelin rejenerasyonunu teşvik ederken VSMC çoğalmasını inhibe eder. Bu nedenle, VSMC çoğalmasını ve endotel bariyer fonksiyonunu aynı anda çalışmak için bir vesikaya ihtiyaç vardır.
Halen, sever varRestenosis 1 al fare modelleri. Bu modeller karotis ligasyonu ve femoral arter tel hasarı 2'yi içerir . Aortik modeller arasında stent yerleştirme 3 , balon hasarı 4 ve aortik allograft 5 bulunur . Mevcut modellerin tümü sınırlıdır. Karotis ligasyonu, akış aracılı bir neointimal lezyon oluşturur ve endotel hasarına sahip değildir. Buna ek olarak, hem karotis hem de femoral arterler, insan damarlarına göre çok daha az kat kat daha az hücre katına sahiptir ve translasyonel değerlerini sınırlar. Çapı yaklaşık 1.3 mm olan fare aortu, klinik açıdan alakalı (koroner) bir insan artere yaklaşık tek damartır (3).
Kemirgen aortik modellerin translasyonel potansiyeline rağmen, mevcut modellerin kısıtlamaları vardır. Bu modeller gelişmiş mikrocerrahi becerileri ve anjiyoplasti balonları ve stentler gibi özel ekipman gerektirir. Burada,Eşzamanlı olarak VSMC proliferasyonunu uyarmak ve endotel bariyer fonksiyonunu bozmak için yeni, tekrarlanabilir bir teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Hayvan taşıma protokolleri Maryland Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış (protokol numarası 0416009) ve AAALAC-Uluslararası standartlarına göre yürütülmüştür.
1. Cerrahi İşlem
- Anestezi Tekniği
- Hayatta kalma cerrahisinde kullanılan tüm cihazları 121 ° C'de 30 dakika boyunca buhar sterilizasyonu ile sterilize edin.
- Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O 2 ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın. İndüksiyon sonrası, izofloranın kesilmesi ve odacığın O 2 ile yıkanması. Yüz maskesi yoluyla % 1.5-2 izofluran ve solunum yoluyla 1 L / dak O ile anestezi uygulayın.
- Personeli korumak için hem indüksiyon odasını hem de yüz maskesini atık gaz adsorpsiyonu için bir kömür toplayıcıya takın. Gösteriyle uygun bir anestezi düzlemi hazırlayınZehirli uyaranlara (toe pinch) tepki olmadığını söyler.
- Ameliyat sırasında termal destek sağlamak için izotermal pedli bir cerrahi tepsi içeren bir operasyon alanı oluşturun. Ek bir izotermik ped, kurtarma kafesindeki hayvanlara termal destek sağlayacaktır.
- Hayvan Hazırlama
- Aşağıdaki araştırmayı 10-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareler üzerinde gerçekleştirin.
- Hayvan ventral karın yüzeyindeki kılları sternumdan inguinal bölgeye bir kaşıntı ajanı veya 40 numaralı bıçaklı bir elektrikli kesiciyle çıkarın.
- Depilasyon ajanı durumunda bu bileşimi cerrahi alana 2-3 dakika uygulayın ve sonra pamukla çıkartın. Ticari olarak bulunan bir kalsiyum hidroksit ve sodyum hidroksit bileşiği kullanıyoruz.
- % 70 alkol ile omzun üzerinden alan hazırlayın ve 25 gauge veya daha küçük çaplı iğne ile karprofen (5 mg / kg) enjekte edin. BuTedavi hayvan için postoperatif analjezi sağlayacaktır.
- Hayvanı cerrahi alana aktarın ve sırt üstü yatma pozisyonuna getirin.
- Temiz bir pamuk aplikatörü veya pamuklu gazlı bez ile% 8-12 propidon iyodür fırçalayarak cerrahi alanı hazırlayın. Daha sonra cildi iki kez% 70 alkolle durulayın.
- Kornea kurutması insidansını azaltmak için her iki göze de oküler yağlayıcı yerleştirin. Cerrahi alanı steril bir örtüyle örtün.
- Ameliyat tekniği
- Yaklaşık 2-2.5 cm uzunluğunda medial bir abdominal laparotomi insizyonu yapın, ksilofoid işlemi hemen kaudal başlayıp pelvise doğru uzanan bir neşterle yapın.
- İnce bağırsak ve duodenumu harekete geçirin ve sağa doğru yanlara doğru yansıtın. Sarılı steril pamuklu bir şerit sarın ve pozlamayı iyileştirmek için iç organın paketlenmesine izin vermek için enjeksiyon için steril salinle ıslatılır.
- Sağa doğru harekete geçirilen ince bağırsakRetroperitoneumu ortaya çıkarır ve abdominal aortayı sol böbrek veninden aort bifurkasyona maruz bırakır ( Şekil 1 ).
- Steril pamuk uçlu bir aplikatör ile, her biri beş saniye süresince 30 ardışık öğütme yapın.
- Ambalajı çıkarın ve iç organın yerlerine dönmesine izin verin.
- Çalışan 4-0 emilebilir bir monofilament 봉iyle (poldioksanon) kapatın. Deri 6-0 emilemeyen monofilament sütürle (naylon) kapatılır.
- İyileşme ve Prosedür Sonrası Bakım
- Prosedürden sonra, hayvan normal şekilde ambulate gelene kadar, termal desteğini sürdürmek için, izotermal bir ped üzerinde temiz tabakalı bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanı sternal dinlenme kabiliyetini gösterene kadar gözetimsiz bırakmayın.
- Ameliyattan sonraki ilk 4 saat boyunca her saat hayvan izleyin. Hayvan normalde ambulasyon yaparak i T atanmış yetiştirme odasına. Hayvan, tamamen kurtarılana kadar bir başka hayvanın şirketinde bulunmaz.
- Hayvanı ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez ve bundan sonra da haftada en az 3 kez izleyin. İzleme, haftanın üç günü hayvanın tartımını içerir.
- Ameliyattan sonraki ilk 72 saat boyunca günde iki kez subkütan carpofen (5 mg / kg) uygulayın.
2. Doku İhalesi
- Ötenazi Yöntemi
- Hayvanları önceden belirlenmiş zaman noktalarından iniltin.
- Anestezi indüksiyon tankı ile% 100 O 2 ve% 2.5 izofluran hassas damla yoluyla sağlayın.
- Endotelin bütünlüğünü incelemek için Evans Blue boyayı hayvana uygulayın.
NOT: Evans Blue, albumin için yüksek bir bağlanma afinitesi olan negatif yüklü bir azo boya olup sadece bozulmamış bir endotelin yokluğunda kan damarlarını lekelemektedirS = "xref"> 6. - Endotel bütünlüğü çalışmaları için, ötenazi anında 5 mL% 0.3 Evans Blue boyayla hayvanlara perfüze edilmeli ve bunu takiben 5 dakika için fizyolojik basınçta 5 mL PBS uygulayınız. Hayvan perfüzyon prosedürü sırasında cerrahi bir anestezi düzleminde muhafaza edilir.
- Endotelin bütünlüğünü incelemek için Evans Blue boyayı hayvana uygulayın.
- Derin anestezi düzlemine ulaştıktan sonra göğsünü bir sternotomi ile açın. Hayvandan kan drenajına izin vermek için sağ atriumda bir kesikleştirme yapın ve sol ventriküle erişmek için 21 G'lik bir iğne ile erişin ve sağ atriyumdan çıkan atık berrak olana kadar fosfat tamponlu salin (PBS) enjektörü uygulayın.
- PBS ile perfüzyondan sonra, karın orta hat kesi yoluyla girilir.
- Bir kez daha, ince barsağı infrarenal aortayı ortaya çıkaran karın sağ tarafına hareketlendirin, aortayı bitişik dokulardan keskin bir şekilde parçalayın ve sol böbrek veninden aort bifurkasyona geçirin.
- Kesilen aortayı% 4 paraformaldEhyde solüsyonu doku işleme oluşuncaya kadar çözülür.
- Endotel bütünlüğü çalışmaları için, aortu uzunlamasına açın ve lümen yüzeyinin 6 tamamını içine alan bir mum sayfasına tutturun. Evans Blue boyasıyla boyama derecesine göre endotel bütünlüğünü niteliksel bir değerlendirme yapın 6 .
- Diğer histolojik tahliller için aortanın enine kesitini alın ve kullanılacak histolojik yöntemle belirlendiği üzere en uygun kesme ısısı (OCT) bileşiklerine yerleştirin 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OCT'de gömülü transvers kesitler aort kesitlendirildi ve hematoksilen ve eozin ile boyandıktan sonra iç ve dış elastik tabakaları tanımlamak için Verhoeff-Van Gieson (VVG) lekesi ile sayaçla boyandı 7 . Bir dolandırıcılık işlemi ile tedavi edilen hayvanların aortalarına (laparotomi ve tek başına ince bağırsak mobilizasyonu) kıyasla yaralanmaya neden olan aort duvar kalınlaşmasını ezin. Adventitia lümene olan uzaklıkla değerlendirilen duvar kalınlığı yaralanmadan sonraki en yüksek üç gündür (tek başına laparotomi için 42.2 ± 1.7 μm vs tek başına laparotomi için) ( Şekil 2A-B ). Yaralanma, hücrelerin daha yuvarlak bir görünüme ve luminal yüzeyin düzensiz konturuna ( Şekil 2C ) sahip olmasına neden oldu.
Yaralı aortun artmış duvar kalınlaşması, medial vasküler pürüzsüz musun artmış proliferasyonu ile en azından kısmen arabuluculuk yapmaktadırCle hücreleri. Duvar kalınlaşmasının, hücre hipertrofisine karşı artan çoğalmaya bağlı olduğunu ispatlamak için, bir EdU çoğalma tahlili kullandık. Bu deneyde, timidin analoğu 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ötanazi öncesi 24 saat damar yoluyla fare üzerine uygulandı. Edu, sentez sırasında DNA'ya dahil edilir. Edu, bir tıklama reaksiyonu (yeşil-flüoresan boya kullanılarak bakır ile katalize edilmiş azid-alkin siklo-yüklemesi) tarafından tespit edilir 8 . Sadece laparotomiye maruz kalmış sahte fareler, aortun herhangi bir katında flüoresansı gözlememişlerdi. Conversley, aort yaralanmasına maruz bırakılan fareler hem aortanın medyumunda hem de intimaasında floresans gösterdi ( Şekil 3 ).
Ezici yaralanmadan sonra aort duvarı kalınlaşması, insanlarda restenozla ilişkili hücre sinyal yollarını aktive eder. Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAP Kinaz) ERK1 / 2, intimal hiperplazi oluşumunda ana aracı maddelerden biridirBir mitojenden uyarılmaya yanıt olarak, ERK1 / 2 fosforile edilir ve 9 , 10 aktive edilir. Laboratuvarımızda elde edilen veriler, siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27 kip1'in damar duvarında 12 mitojen uyaranlara yanıt olarak azaldığını da göstermiştir. Aortik ezilme yaralanmasından 1, 3, 7 gün ve 1 ay sonra fareler ötenazi yapıldı. İnfrarenal aort izole edildi ve ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2'nin (aktive edilmiş ERK1 / 2 formu) ve sikline bağlı kinaz inhibitörü p27 kip1'in protein ekspresyonu Western leke analizi ( Şekil 4A ) ile belirlendi. Toplam ERK1 / 2 protein ekspresyonunda zamanla herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, yaralanmadan üç gün sonra, fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) ifadesi, başlangıçtaki Pi-ERK1 / 2 ekspresyonundan% 200'ün üzerinde olmuştur. P27 kip1 ekspresyonu, erken zaman noktalarında azaldı ve afla¤ıdaki yedi günün aflamas> n> n yaklafl> k % 20'sinde en düflük seviyeye ulaflt>:Ter yaralanması. Pi-ERK1 / 2 ve p27 kip1 ekspresyonu, yaralanmadan bir ay sonra temel seviyelere yaklaştı ( Şekil 4B ). Dolayısıyla aort duvarının kalınlaşması en azından kısmen medial proliferasyonun artmasından kaynaklanmaktadır.
Aort yaralanması modeli hem medial düz kas proliferasyonunun hem de endotel bariyer fonksiyonunun aynı anda değerlendirilmesine izin verir. Ezici hasarın endotelin morfolojisi üzerindeki etkisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanıldı. Aortun luminal yüzeyi, kanla doğan hücrelerin ve moleküllerin yapışmasını önleyen, birleşik bir endotel ile kaplanmıştır ( Şekil 5A , Ölçek çubuğu = 100 μm). Aksine, ezilme yaralanması, endotel hücrelerinin bozulmasına ve endotelin kısmi olarak delinmesine neden olur ( Şekil 5B , Ölçek çubuğu = 100 μm). Yüksek büyütmede görüldüğü gibi, endotelin bozulması yapışkanla sonuçlanırTrombositlerle boyut ve şekil bakımından tutarlı partiküller. Bu parçacıkların yapışması yaralanmanın tüm bölgesi boyunca gerçekleşir ve daha düşük büyütmede gözlemlenen kaba soyma alanlarıyla sınırlı değildir ( Şekil 5C , Ölçek çubuğu = 50 μm). Yapışkan parçacığın morfolojisi en iyi büyütmede daha iyi gözlemlenir. Bu parçacıklar trombosit ve fibrin ile tutarlıdır ( Şekil 5D , Ölçek çubuğu = 10 μm).
Endotel morfolojisine ek olarak, vasküler hasarın bu modeli ile endotelin bariyer fonksiyonu değerlendirilebilir. Azo boya Evans Blue, murin aortunun normal, bozulmamış endoteline nüfuz edemez. Endotelin bariyer işlevine zarar verildiğinde, Evans Blue ile temel zarının lekelenmesine izin verilir. Tek başına bir laparotomi (sahte) ile tedavi edilen fareler, endotelin bariyer işlevini sürdürdü ve bu aortlar beyazdı. Ezilme yaralanması,Diffüz endotel bariyer fonksiyon kaybı ve bu aortlar koyu mavi renkliydi. Efüzyon yaralanmasından üç gün sonra Evans Blue ile lekelenme yoğunluğu azaltıldı ve tam bariyer fonksiyonu yaralanmadan sonraki hafta restore edildi ( Şekil 6A ). Endotel bariyer fonksiyonu numuneleri tartarak ve 10 kat hacimli% 50 trikloroasetik asit solüsyonunda homojenleştirerek daha da nicelleştirilebilir. Süpernatantın 4 kat etanol içinde seyreltilmesi, Aoki ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi flüoresan yoğunluğunun (uyarma 620 nm ve emisyon 680 nm) belirlenmesine izin verir. 11 . Infrarenal aortadan çıkan Evans Blue miktarı, yaralanmadan hemen sonra aortlarda sadece laparotomiye (Yaralı - Gün 0) maruz kalan aorta göre üç kat fazladı. Aorta, yaralanmadan bir ve üçüncü günlerde Evans Blue ile lekelenmeye devam etti, ancak yaralanma zamanından daha az yoğunlaştı ve endotel bariyer fonksiyonunun kademeli olarak düzeldiğini düşündürdü. Bir hafta sonra kıçYaralanma nedeni yaralanan aortun, laparotomi ile tedavi edilen aort olarak eşdeğer boyanması vardı ( Şekil 6B ).
Şekil 1: Yaralanma, Aortanın Sol Renal Ven'den Aort Bifurkasyona Keskin Şekilde Parçalanmasıyla Oluşmuştur. Şekil Yu ve diğerlerinin izniyle uyarlanmıştır, PLoS One 2015 12 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Ezilme Yaralanması Aortik Duvar Kalınlaşmasına Neden olur. ( A ) Aortda hasar gören morfolojik değişiklikleri ezmek. Temsilci 5 um kesitleri 0 ° C'de VVG ile boyandı,Yaralanmadan 1, 3 ve 7 gün sonra. Ölçek çubukları = 100 μm. ( B ) Duvar kalınlığı, yaralanmadan 3 gün sonra en fazla 42.2 ± 1.7 μm idi ve yalnızca laparotomi uygulanan sahte hayvanların aortundan 22.1 ± 1.1 μm. Daha büyüktü. İstatistiksel önem Student's two-tail t-testi ile belirlendi. Crush yaralanması medial VSMC'lerin (a-düz kas aktımı için yeşil lekelenmiş) ve hücre yönlendirmesini değiştirerek yuvarlak bir görünüm yarattığını gösterdi. Çekirdeklere DAPI (Mavi) ile karşıt boyandılar. Ölçek çubukları = 10 μm. Veriler, ortalamalar ve standart sapmalar olarak sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Crush Yaralanması Hücre Prolife'sını İndüklerAort duvarındaki rasyon. Fareler ya tek başına laparotomi (sahte) ya da aortik ezilme yaralanması ile laparotomiye maruz bırakıldı. Ötinazinden 24 saat önce timidin analoğu 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) uygulandı. Edu, sentez sırasında DNA'ya dahil edilir. Edu, bir tıklama reaksiyonu (yeşil-flüoresan boya kullanılarak bakır ile katalize edilmiş azid-alkin siklo-ilavesi) ile tespit edilir. Sahte hayvanların aort duvarında saptanabilir Edu (yeşil) yoktu. Ezici yaralanmaya maruz kalan hayvanlarda, EdU, aort ortamında belirgin olarak lekelenmiş ve intima'da daha az miktarda lekelenmiştir. Vasküler düz kas hücreleri, α-düz kas aktin antikoru (kırmızı) ile boyanarak tespit edildi. Bu bulgu, Şekil 2'de gözlemlenen duvar kalınlaşmasının, hücre proliferasyonundaki bir artıştan kaynaklandığını düşündürmektedir. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu figürden daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.e.
Şekil 4: Mitojenle aktive olan Protein Kinaz (MAP Kinaz) Yolağı Ezilme Yaralanmasına Karşı Aktive edilir. ( A ) MAP Kinaz ERK1 / 2 aktive olduğunda fosforilatlanmıştır ve intimal hiperplazi ve restenoz ile ilişkilidir. Aortik ezilme yaralanmasından 1, 3, 7 gün ve 1 ay sonra fareler ötenazi yapıldı. Toplam ERK1 / 2, fosfo-ERK1 / 2 ve siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27 kip1'in protein ekspresyonunu değerlendirmek için Western blot analizi kullanılmıştır . Protein ekspresyonu, tek başına laparotomi ile tedavi edilen sahte bir hayvana normalleştirildi. ( B ) Toplam ERK1 / 2 protein ekspresyonunda zaman içinde hiç bir değişiklik gözlenmemiştir. Bununla birlikte, yaralanmadan üç gün sonra, fosfo-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) ifadesi, başlangıçtaki Pi-ERK1 / 2 ekspresyonundan% 200'ün üzerinde olmuştur. P27 kip1 ekspresyonu, erken zaman noktalarında azaldı veD yaralanmadan sonraki 7 günün sonunda başlangıçtaki yaklaşık% 20'lik bir dereye ulaştı. Pi-ERK1 / 2 ve p27 kip1 ekspresyonu, yaralanmadan bir ay sonra temel seviyelere yaklaştı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5. Crush Sakatlığı Aort Endotel Hücrelerini Dağıtır. ( A ) Eritme hasarının endotelin morfolojisi üzerindeki etkisini karakterize etmek için taramalı elektron mikroskopisi (SEM) kullanılmıştır. Normal aortun luminal yüzeyi, kan yoluyla doğan hücrelerin ve moleküllerin yapışmasını önleyen bir konfluent endotel ile kaplıdır. ( B ) Ezilme yaralanması, endotel hücrelerinin parçalanmasına ve endotelin kısmi olarak delinmesine neden olur. ( C ) Yüksek magnifica'da görüldüğü gibiEndotelin bozulması, trombositlerle boyut ve şekil bakımından tutarlı parçacıkların yapışmasına neden olur. Bu parçacıkların yapışması tüm yaralanma bölgesi boyunca gerçekleşir ve daha düşük büyütmede gözlemlenen kaba soyma alanlarıyla sınırlı değildir. ( D ) Yüksek büyütmede, bu parçacıklar trombosit ve fibrin ile tutarlıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: Blunt Aort Yaralanması, Endotel Bariyeri Fonksiyonunun Kantitatifleştirilmesini sağlar. ( A ) Endotelin bariyer fonksiyonunun bozulması, Evans Blue boyası ile temel zarının boyanmasına izin verir. Tek başına bir laparotomi (sahte) ile tedavi edilen fareler, endotelin veEse aortas beyazdı. Ezilme yaralanması, endotel bariyer işlevinde yaygın bir kayıp ile sonuçlandı ve bu aortlar koyu mavi renkliydi. Evans Blue ile lekelenme yoğunluğu ezilme yaralanmasından üç gün sonra azaltıldı ve tam bariyer fonksiyonu yaralanmadan sonraki hafta restore edildi. ( B ) Evans Blue'nın İnfrarenal aortaya bağlanması örnekten Evans Blue çıkartılarak ve flüoresan yoğunluğu ile nicelendirilerek nicelleştirildi. Veriler, ortalamalar ve standart sapmalar olarak sunulmuştur. En Evans Blue, ezilme yaralanmasından hemen sonra aortadan çıkarıldı. Yaralanma anında aort, yalnız laparotomiye tabi tutulmuş olan aorttan üç kat daha fazla Evans Blue ile bağlandı. Aorta iyileşmesine izin verildiğinde, yaralanmadan bir ve üçüncü günlerde daha az bağlanma vardı. Yaralanmadan bir hafta sonra aort, aynı miktarda Evans Blue'yı tek başına laparotomi yapılan aortlarla ilişkilendirir. İstatistiksel önem Student's two-tail t-testi ile belirlendi. * DeNotlar p <0.05, n = 3, NS anlamlı olmadığı anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medial hiperplazi ve endotel bariyer disfonksiyonu ile sonuçlanan bir murin aort yaralanma modelinin etkilerini karakterize ettik. Aort intima boyunca kısmi AT dekolmanı, hücre-hücre teması kaybına ve hücre çıkıntılarının arttırılmasına eşlik etti. Buna paralel olarak, endotel bariyer fonksiyonu önemli ölçüde bozulmuş ve mitojen duyarlı sinyal yollarını uyarmış ve VSMC'lerin çoğalmasına ve damar duvarının kalınlaşmasına yol açmıştır. Bu modelin güçlü yönleri, hastalığın diğer aortik modellerinden daha teknik olarak öğrenilmesinin ve yürütülmesinin daha kolay olması ve hem yaralanma hem de endotel fonksiyonuna karşı proliferatif yanıtı eşzamanlı olarak değerlendirmesine olanak sağlamasıdır. Bu protokoldeki kritik adım asıl eziyet yaralanmasıdır. Ezilme yaralanmasının boyutundaki değişkenlik, çeşitli derecelerde yaralanmaya ve dolayısıyla değişen miktarlarda düz kas hücre çoğalmasına neden olabilir. Laboratuarımızda bu değişkenliği azaltan bir adım,Cientist, tedavi veya deneysel kör olduğunuzda, ezilme yaralanmalarının tümünü gerçekleştirin.
Bu modelin bir kısıtlılığı, klinik olarak ilgili insan hastalık süreçlerine genelleştirilebilirliği. Bu modelde VSMC'lerin hızlı proliferatif yanıtına rağmen, restenozun geç olaylarını modellememektedir, yani neointima gelişmemiştir. Sitokinler gibi azalmış inflamatuar mediatörler bu süreci düzenleyebilir. Bu bulgu, kısmi hasardan endotelin hızla iyileşmesinden kaynaklanabilir. Tavşanlarda daha önce bildirilen vasküler ezik yaralanma modeline benzer şekilde, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu azdı. Mevcut araştırmada profilaktör dizisi ile sahte hayvanlar ve aortik hasar gören hayvanlardaki inflamatuar sitokinlerin profili değerlendirildi. Bununla birlikte, sahte ve yaralı hayvanlar arasındaki proliferatif cevaptaki farkı açıklayan sitokin profilinde anlamlı bir fark yoktu (verilergösterilmemiş). Mevcut raporda anlatılan yaralanma, geçici olarak sınırlıdır. Aortik anjiyoplasti modeli gibi diğer aort yaralanması ve intimal hiperplazi modelleri endotelü tamamen teyit ederken, bu model sadece aorta kısmen denüde olur. Endotelin tamamen delinmesi, iyileşmek için çok daha uzun süre gerektirir ve bu hayvanlar, yaralanmanın etkilerini daha uzun süre deneyimlidir.
Bu model, bir haftada morfolojik ve biyokimyasal değişikliklerin miktarının belirlenmesine izin veren yaralanmalara karşı VSMC'lerin ve EC'lerin hızlı tepkisini üretir. Müdahalenin etkisinin belirginleşmesi 14-28 gün süren diğer modellerden daha etkilidir. Bu model klinik olarak ilgili insan damarına yaklaşan tek fare gemi olan murin aortayı kullanır. Bu tekniğin diğer aortik modellere kıyasla önemli avantajı, bu modelin öğrenilmesi nispeten kolaydır ve pahalı ya da elde edilmesi zor olan eq gerektirmezSevkiyat 2 , 3 , 4 , 5 . Sonuç olarak, murin aortik ezici yaralanma modeli, VSMC'lerin ve EC'lerin vasküler hasara karşı cevabını eşzamanlı olarak değerlendirmek için, teknik açıdan açık, ucuz, etkili bir in vivo platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü (1IK2BX001553-01) (TSM) ve Vasküler Cures EJ Wylie Bursu (TSM) tarafından finanse edildi.
Acknowledgments
Maryland Üniversitesi Tıp Fakültesi Elektron Mikroskopi Çekirdek Tesisi'nden Hsia Ru-ching Doktora programına, tarama elektronik mikroskobu örneklerini işleme konusundaki teknik desteği için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
