Summary
Dette værk beskriver metoder til etablering af akutte og kroniske hyperglykæmi modeller i zebrafisk. Målet er at undersøge virkningen af hyperglykæmi på fysiologiske processer, såsom konstitutiv og skadefremkaldt neurogenese. Arbejdet fremhæver også brugen af zebrafisk for at følge radiomærkede molekyler (her, [ 18 F] -FDG) ved anvendelse af PET / CT.
Abstract
Hyperglykæmi er et stort sundhedsproblem, der fører til hjerte-kar-og cerebral dysfunktion. For eksempel er det forbundet med øgede neurologiske problemer efter slagtilfælde og er vist at svække neurogene processer. Interessant nok har den voksne zebrafisk for nylig fremkommet som en relevant og nyttig model til at efterligne hyperglykæmi / diabetes og at undersøge konstitutiv og regenerativ neurogenese. Dette arbejde giver metoder til udvikling af zebrafiskmodeller af hyperglykæmi for at undersøge virkningen af hyperglykæmi på hjernecelleproliferation under homeostatiske og hjernedannelsesbetingelser. Akut hyperglykæmi er etableret ved intraperitoneal injektion af D-glucose (2,5 g / kg legemsvægt) til voksen zebrafisk. Kronisk hyperglykæmi induceres ved nedsænkning af voksne zebrafisk i D-glucose (111 mM) indeholdende vand i 14 dage. Målinger af blodglukose er beskrevet for disse forskellige tilgange. Metoder til at undersøge virkningen af hyperglykæmi på konstitutiv aNd regenerativ neurogenese ved at beskrive telencephalonens mekaniske skade, dissekere hjernen, paraffinindlejring og snitning med et mikrotom og udføre immunhistokemeprocedurer, påvises. Endelig beskrives også fremgangsmåden til anvendelse af zebrafisk som en relevant model til undersøgelse af biodistribution af radioaktivt mærkede molekyler (her [18F] -FDG) ved anvendelse af PET / CT.
Introduction
Hyperglykæmi er defineret som overdrevne blodglukoseniveauer. Selvom det kunne afspejle en akut stress situation, er hyperglykæmi også en tilstand, der ofte fører til diagnose af diabetes, en kronisk lidelse af insulinsekretion og / eller resistens. I 2016 er antallet af voksne, der lever med diabetes, nået 422 millioner over hele verden, og hvert år dør 1,5 millioner mennesker af denne sygdom, hvilket gør det til et stort sundhedsproblem 1 . Faktisk fører ukontrolleret diabetes til flere fysiologiske lidelser, som påvirker hjerte-kar-systemet, nyrerne og perifere og centrale nervesystemer.
Interessant nok kan akut og kronisk hyperglykæmi ændre kognition og bidrage til både demens og depression 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Derudover er adgangen til patienter wIth hyperglykæmi har været forbundet med dårligere funktionelle, neurologiske og overlevelsesresultater efter iskæmisk slagtilfælde 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Det blev også vist, at hyperglykæmi / diabetes påvirker voksen neurogenese, en proces, der fører til dannelsen af nye neuroner, ved at påvirke neural stamcelleaktivitet og neuronal differentiering, migration og overlevelse 2 , 12 .
I modsætning til pattedyr viser teleostfisk som zebrafisk intensiv neurogen aktivitet i hele hjernen og udviser en fremragende kapacitet til hjernearbejde i voksenalderen 13 , 14 , 15 , 16 . Navnlig er sådanne kapaciteter mulige på grund af neu's vedholdenhedRal stam / progenitor celler, herunder radial glia og neuroblaster 17 , 18 , 19 . Desuden har zebrafisken for nylig fremkommet som en model til undersøgelse af stofskifteforstyrrelser, herunder fedme og hyperglykæmi / diabetes 20 , 21 , 22 .
Selv om zebrafisken er en velkendt model for hyperglykæmi og neurogenese, har få undersøgelser undersøgt virkningen af hyperglykæmi på hjernens homeostase og kognitive funktion 12 , 23 . For at bestemme virkningen af hyperglykæmi på konstitutiv og skadefremkaldt hjernecelleproliferation blev der skabt en model af akut hyperglykæmi ved intraperitoneal injektion af D-glucose. Derudover blev en model af kronisk hyperglykæmi reproduceret ved nedsænkning af fisk i vand suppleret wMed D-glucose 12 . Zebrafish udviser mange fordele ved forskningen. De er billige, nemme at hæve og gennemsigtige i de første udviklingsstadier, og deres genom er blevet sekventeret. I forbindelse med dette arbejde viser de også flere yderligere fordele: (1) de deler lignende fysiologiske processer med mennesker, hvilket gør dem til et kritisk redskab til biomedicinsk forskning; (2) de giver mulighed for hurtig undersøgelse af virkningen af hyperglykæmi på hjernens homeostase og neurogenese under hensyntagen til deres udbredt og stærke neurogene aktivitet; Og (3) de er en alternativ model, der muliggør reduktion af antallet af pattedyr, der anvendes i forskning. Endelig kan zebrafisk bruges som en model til testning af biodistribution af radioaktivt mærke molekyler og potentielle terapeutiske midler ved anvendelse af PET / CT.
Det overordnede mål med følgende procedure er at visuelt dokumentere, hvordan man opstiller modeller af akut og kronisk hyperglykæmi i zebrafisk, brug zebRafish til at vurdere hjernemodellering i hyperglykæmiske tilstande og overvåge radioaktivt mærket molekyler (her [18F] -FDG) ved anvendelse af PET / CT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne vildtype zebrafisk ( Danio rerio ) blev opretholdt under standardfotoperiode (14/10 h lys / mørk) og temperatur (28 ° C) betingelser. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de franske og europæiske retningslinjer for anvendelse af dyr i forskning (86/609 / EØF og 2010/63 / EU) og blev godkendt af det lokale etiske udvalg til dyreforsøg.
1. Etablering af en model for akut hyperglykæmi hos zebrafisk
- Forbered en stamopløsning af tricain (MS-222) ved at opløse 400 mg tricainpulver i 97,9 ml vand og 2,1 ml 1 M Tris / HCI buffer (pH 9). Juster pH til 7 og alikvot til opbevaring ved -20 ° C.
- Forbered et bedøvelsesmiddel til den voksne zebrafisk ved at sætte 5 ml tricain (stamopløsning) i 100 ml fiskvand (endelig tricainkoncentration: 0,02%).
- Overfør en zebrafisk (3 til 6 måneder) fra sin tank til anæstesen, indtil den stopper med at flytte.
- ReFlyt fisken med en skåret pipette og tør det hurtigt på absorberende tissuepapir.
- Vejer fisken
- Forbered en sprøjte af D-glucose opløst i 1X PBS og injicer 50 μL D-glucose (2,5 g / kg legemsvægt).
BEMÆRK: En 0,6 g fisk vil fx modtage 50 μL 3% D-glucose / PBS-opløsning. - Sæt fisken på ryggen og indsæt sprøjtens nål i det intraperitoneale hulrum.
- Indsæt langsomt D-glucose / PBS-opløsningen og sæt fisken tilbage i vandet.
- Tjek fisken, indtil den genvinder helt. Returner det til sin tank, indtil den nødvendige tid til at nå blodglukosemåling er nået.
BEMÆRK: Blodglukosen måles 1,5 timer efter injektionen.
2. Etablering af en model for kronisk hyperglykæmi hos zebrafisk
- Forbered en 2 L tank rent vand.
- Opløs 40 g D-glucose i 2 L fiskvand til en endelig D-glucosekoncentration på111 mM.
- Dyp 5 til 7 voksne zebrafisk i det D-glucoseholdige vand.
- Udskift D-glucose fisk vand hver anden dag for at undgå væksten af bakterier eller andre mikroorganismer.
- Efter 14 dages behandling placeres fisken kort i ferskvand for at fjerne D-glukosen uden for kroppen før blodglukoseniveauet måles.
3. Måling af blodglukoseniveauer i zebrafisk
- Dæk fisken med is for hurtig eutanasi.
BEMÆRK: Brug ikke en overdosis af trica, da dette medfører store variationer i blodglukoseniveauer. Forlad ikke fisken i isen, da dette vil få blodet til at størkne. - Tør fisken af med absorberende vævspapir for at fjerne alt vand og undgå blodfortynding under blodglukosemåling.
- Fjern et øje ved hjælp af dissecting tang og vent indtil øjet hulrum er fyldt med blod.
- Sæt en teststrimmel på et glucometer og iNsert strimlen ind i øjets hulrum.
- Mål blodglukoseniveauerne.
4. Analyse af hjernecelleproliferation efter hyperglykæmi
- Løsninger og buffere: krav og forberedelse
- Der fremstilles 1 1 1x PBS ved tilsætning af 100 ml 10x PBS til 900 ml destilleret H20 (dH20) og blandes.
- Forbered 1x PBS med 0,2% detergent (PBS-T, se materialetabellen).
BEMÆRK: For at forberede 1 liter PBS-T tilsættes 2 ml vaskemiddel (se materialetabellen ) til 1 liter PBS. - Forbered en ethanol serie (100% x 2; 95%; 85%; 70%; 50% og 30%) og 0,85% NaCl.
- Forbered blokeringsbuffer: PBS-T indeholdende 0,5% til 1% mælkepulver.
BEMÆRK: For at forberede 200 ml blokeringsbuffer tilsættes 2 g mælkepulver til 200 ml PBST. - Forbered antigenopsamlingsbuffer, natriumcitrat.
BEMÆRK: Til fremstilling af 1 liter natriumcitratpuffer tilsættes 2,94 g natriumcitrat-triNatriumsalt dehydrat til 1 liter dH 2 0. Indstil pH til 6 før påfyldning til 1 L. - Forbered en 4% paraformaldehyd-PBS-buffer, idet der tilsættes 4 g paraformaldehyd til 100 ml 1x PBS. Varm det under omrøring ved 58-60 ° C, indtil det opløses helt.
- Prøveforberedelse til immunhistokemi: fiksering og dehydrering
- Efter måling af blodglukoseniveauet adskilles hovedet fra kroppen ved at skære hovedet bag kulderne.
Bemærk: Alternativt kan hjernen ekstraheres direkte og frosses til andre forsøg, såsom mRNA-ekstraktion. - Fastgør hovederne natten over ved 4 ° C i 4% paraformaldehyd opløst i PBS (PFA-PBS).
- Dagen efter vaskes hovedet i PBS.
- Dissect hjernerne omhyggeligt med et mikroskop. Skyl de faste hoveder med PBS og brug en nål til at sikre et hoved under et dissekeringsmikroskop. Fjern øjnene og toppen af kraniet med tang. CarefuLly ekstraher hjernen og læg den i 1x PBS.
- Vask de faste hjerner med 1 x PBS i 30 minutter, 0,85% NaCl i 30 minutter, 70% EtOH / 0,85% NaCl (v / v) i 15 minutter, 70% EtOH i 15 minutter (to gange), 85% EtOH for 20 minutter Min, 95% EtOH i 20 minutter og 100% EtOH i 20 minutter (to gange). Inkubér natten over i en endelig 100% EtOH opløsning.
BEMÆRK: Dehydrerede hjerner kan forblive i flere måneder i 100% EtOH ved 4 ° C inden paraffinindlejring.
- Efter måling af blodglukoseniveauet adskilles hovedet fra kroppen ved at skære hovedet bag kulderne.
- Prøveforberedelse til immunhistokemi: vævspræparation til indpakning af paraffin
- Placér hjernen i et lille glasbægre.
BEMÆRK: Brug ikke en plastikbeholder, da toluen kan skade plast. - Fjern ethanol og erstat det med toluen, da hjernerne skal genoprettes fuldstændigt af toluen. Udfør to 30 min toluenbade.
- Fjern toluenet og læg hjernerne i en indlejringskassette. Sæt den lukkede kassette i smeltet paraffinseriebægre ved 58-60 ° C (30 minutter i hvert parafinbæger). Tænd for opvarmningsklemmerne. I slutningen af paraffinbadene skal du tage kassetten ud og hælde noget flydende paraffin i en form.
- Hæld den smeltede paraffin i en form og læg hjernen inde. Orienter hjernen ved hjælp af opvarmningsfeltene, ved hjælp af anteroposterior orientering af hjernen som en vejledning. Lad paraffin hærde på køledelen af indlejringsmaskinen.
- Af tekniske årsager placerer hjernerne langs anteroposterioraksen. Efter unmolding af paraffinblokken beskæres den og fastgøres på en kassette med den smeltede paraffin i korrekt orientering for at muliggøre tværsnitsafsnit.
- Sæt paraffinblokken ind i mikrotomens arm. Skær 50 μm tykke sektioner, indtil hjerneprøven er nået. Trim paraffinblokken for at opnå en trapeze og juster snittet tykkelsen til 7 μm. Saml parafinbåndene ved hjælp af pensler og læg dem på sort papis. Skær dem forsigtigt hver 3 til 4 sektioner.
- Sæt et dias på en opvarmningsplade og dækk det med dH 2 O vand.
- Sæt forsigtigt de skårne bånd på vandet. Fjern vandet med absorberende vævspapir, når paraffinbåndene er tilstrækkeligt spredt ud / udfoldet. Fjern de sidste dråber mekanisk. Fjern vandet fra gliderne og lad dem tørre i mindst 3 timer på opvarmningspladen ved ca. 30-40 ° C.
- Placér hjernen i et lille glasbægre.
- Immunohistokemi procedure
- Fjern paraffinvoks ved at placere sektioner i tre beholdere xylen i 7 minutter hver.
- Rehydrer sektionerne ved at sætte diasene i to beholdere med 100% EtOH i 2 minutter hver, efterfulgt af bad med 95% EtOH, 85% EtOH, 70% EtOH og 30% EtOH i 30 s hver. Til sidst kortlægges gliderne i dH 2 O og to gange i PBS i 5 minutter hver.
- Udfør antigenudvinding ved at inkubere sektionerne i citratbuffer i en mikrobølgeovn (2 minutter ved 500 W) indtilBufferen begynder at koge. Lad gliderne komme sig ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask tre gange i PBST, 5 minutter hver, og bloker sektionerne i 45 minutter i PBST indeholdende 1% mælk. Inkuber natten over med primære antistoffer ( fx prolifererende celle nukleare antigen (PCNA) til proliferativ cellefarvning 1/100) fortyndet i blokeringsbuffer ( dvs. PBST, 1% mælk).
- Vask tre gange i PBST, 5 minutter hver og inkubér sektionerne i 90 minutter med passende sekundære antistoffer ( f.eks. Gede-anti-muse Alexa Fluor 488; 1/200) fortyndet i blokeringsbuffer og med DAPI (1/500).
- Vask tre gange i PBST, 5 min hver, og monter gliderne med fluorescerende monteringsmedium (se materialebordet).
- Analysér farvningen ved hjælp af et epifluorescens og / eller konfokalmikroskop.
- Kvantificere hjernecelleproliferationen på mindst tre successive hjerneafsnit af en region af interesse i mindst tre forskellige animals.
BEMÆRK: Alternativt kan hjerneindlejring gøres i agarose for at fortsætte til vibratomsektion og fritflydende immunhistokemi, som tidligere beskrevet 24 .
- Undersøgelse af virkningen af hyperglykæmi på hjernens reparationsmekanismer
BEMÆRK: Alternativt kan undersøgelsen af hjernereparation under akut og kronisk hyperglykæmi udføres efter stiv sårskade af telencephalonen som tidligere beskrevet 24 , 25 , 26 . Kort:- Bedøve voksne zebrafisk med tricaine.
- Placer fisken under et dissekeringsmikroskop med lys.
- Hold fisken med den ene hånd.
- På den anden side skal du indsætte en 30 G sprøjte lodret gennem kraniet ind i medialområdet på den højre telencephaliske halvkugle.
- Sæt fisken tilbage i fersk fisk, D-glucose-suppleret vand (111MM) eller kontrol fisk vand. Lad fisken overleve i 7 dage efter skaden.
BEMÆRK: Se trin 4 for resten af proceduren.
5. Imaging af biodistribution af radiomærkede molekyler af PET / CT i zebrafisk: Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) til analyse af glukosemetabolisme
- Forbered en 50 μL sprøjte indeholdende 20 MBq saltopløsning af [18F] -FDG.
- Placer sprøjten bag strålingsskærmen.
- Bedøve en voksen zebrafisk med tricaine.
- Placer fisken bag en strålingsskærm.
- Injicér [18F] -FDG i det intraperitoneale hulrum. Tør indsprøjtningsstedet med et lille stykke tissuepapir for at forhindre detektion af resterende [18F] -FDG, der kunne lække ud af fiskemaven.
- Brug en radioisotopkalibrator til at måle den resterende aktivitet på sprøjten og vævet til at beregne den nøjagtige injicerede dosis.
- Placer fisken på enÆg, lille stykke absorberende væv gennemblødt med tricaine og forsigtigt pak det op. Placer fisken med det absorberende væv på sengen af PET / CT-billedet.
- Indsæt sengen i PET / CT-billeddannelsessystemet og start opkøbet.
- Fortsæt med at gennemføre PET / CT-erhvervelsen.
- Ved afslutningen af proceduren sættes fisken tilbage i en lille mængde frisk fisk.
BEMÆRK: Alternativt kan fisken efter [18F] -FDG-injektionen sættes tilbage i en lille mængde ferskvand i 10 minutter til 1 time for at lette diffusionen af [18F] -FDG, inden den igen bedøves fisken til PET / CT-billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved anvendelse af procedurerne beskrevet i denne artikel blev intraperitoneal injektion af D-glucose (2,5 g / kg legemsvægt) udført på voksne zebrafisk og ført til en signifikant stigning i blodglukoseniveauet 1,5 time efter injektion ( Figur 1A ). 24 timer efter injektion var blodglukoseniveauerne ens mellem D-glucose og PBS-injiceret fisk 12 . Til kronisk behandling blev zebrafisk nedsænket i D-glucosevand (111 mM) og blev hyperglykæmisk ved afslutningen af deres 14 dages behandling ( figur 1B ) som tidligere vist 12 , 22 .
For at undersøge virkningen af hyperglykæmi på hjernecelleproliferation blev PCNA immunhistokemi udført på zebrafiskhjerne efter induktion af akut og kronisk hyperglykæmi. Selvom akut hypergl Ykæmi påvirket ikke hjernecelleproliferation 12 , inducerede kronisk hyperglykæmi en signifikant reduktion i neural stamcelleproliferation langs ventriklen, som tidligere vist af Dorsemans og kollegaer (2016). Faktisk blev antallet af PCNA-positive celler reduceret i subpalliumet (Vv / Vd), palliumet (Dm) og de regioner, der omgiver den laterale og posterior reces af den kaudale hypothalamus (LR / PR) ( Figur 2 ).
Skadesinduceret neurogenese blev også undersøgt efter den mekaniske skade af telencephalon under akut og kronisk hyperglykæmi. Som tidligere beskrevet efter hjerneskade i zebrafisk forekom en første parenkymal proliferation af mikroglialceller og oligodendrocytter efterfulgt af en stærk opregulering af proliferation ved det ventrikulære lag 7 dage efter skaden 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Akut hyperglykæmi modulerede ikke det oprindelige trin i proliferation i hjernens parenchyma. I modsætning hertil reducerede kronisk hyperglykæmi hjernecelleproliferation langs de telencefalske ventrikler 7 dage efter skade ( Figur 3 ).
Zebrafish-modellen er også interessant for overvågning af biodistribution af radioaktivt mærket molekyler ved brug af PET / CT-billeddannelse. Her blev [18F] -FDG injiceret intraperitonealt i voksne zebrafisk. Efter 30 minutter viser PET / CT-erhvervelsen, at glukosen fordeles ikke kun på injektionsstedet, men også i fiskens hoved, herunder hjernen og langs rygmarven ( figur 4 ).
Xfig "> Figur 1 : Akutte og kroniske modeller af hyperglykæmi i zebrafisk. ( A ) Den intraperitoneale injektion af D-glucose (2,5 g / kg legemsvægt) resulterer i en signifikant stigning i blodglukoseniveauer 1,5 time efter injektionen (n = 3 ). ( B ) Neddybning af zebrafisk i D-glucosevand (111 mM) i 14 dage resulterer i en signifikant stigning i blodglukoseniveauer (n = 15). Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Kronisk hyperglykæmi hæmmer hjernecelleproliferation efter 14 dages behandling. Proliferative celler mærkes i grønt med et PCNA antistof. Cellekerner modstryges med DAPI (blå). Kronisk hYperglykæmi nedsætter hjernecelleproliferation efter 14 dages behandling i subpallium ( A ), i pallium ( B ) og i kaudal hypothalamus omkring den laterale og posterior reces i ventriklen ( C ). Skalestang = 120 μm (A og B), 200 μm (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 : Televasphalons skadesvækkeskader opregulerer hjerneproliferation efter 7 dage efter læsion. ( A ) Skematisk oversigt over et tværsnit af zebrafisk telencephalon på det niveau, der er angivet i den øvre sagittal. Schema er taget fra zebrafisk hjerneatlas 31 . Re D prikker angiver prolifererende celler 32 , 33 . Nålen angiver læsionsstedet. ( B ) PCNA (grøn) immunhistokemi 7 dage efter hjerneskade viser en stærk opregulation af proliferation langs hjerneventriklen i den skadede telencephalon. Skalestang = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : PET / CT-billeddannelse af [18F] -FDG (20 MBq injiceret) 30 min efter intraperitoneal injektion. Repræsentative billeder af PET / CT-billeddannelse viser en bred fordeling af [18F] -FDG i zebrafiskens krop, herunder hovedet, hjernen og rygmarven.Filer / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver forskellige metoder til at etablere akutte og kroniske modeller af hyperglykæmi hos zebrafisk. De vigtigste fordele ved disse procedurer er, at: 1) de giver mulighed for en reduktion i antallet af pattedyr, der anvendes til forskning, (2) de er enkle at etablere og hurtige at gennemføre, og (3) de er økonomiske. Derfor tillader sådanne modeller at undersøge virkningen af hyperglykæmi på et stort antal dyr for at studere dens indvirkning på forskellige fysiologiske processer, herunder atherotrombose, kardiovaskulære dysfunktioner, retinopatier, blodhjernebarriere lækage og konstitutiv og regenerativ neurogenese. Dette arbejde beskriver, hvordan man fortsætter med undersøgelser af virkningerne af hyperglykæmi på hjernecelleproliferation under normale eller skadefremkaldte tilstande.
En kritisk begrænsning af den kroniske hyperglykæmiprocedure er, at nogle fisk i nogle forsøg ikke udviser hyperglykæmi efter kronisk nedsænkningI D-glucose vand (111 mM i 14 dage). Andelen responsive og ikke-responsive fisk er tidligere estimeret af Dorsemans og kolleger (2016) til henholdsvis 83% og 17%. Det er muligt, at fisk viser individuelle susceptibiliteter i henhold til deres alder, køn og evne til at kompensere for hyperglykæmi ved at gøre flere pancreas-p-celler 34 , 35 . For akut hyperglykæmi er blodglukoseniveauerne ret homogene 1,5 timer efter injektionen, hvilket viser robustheden af metoden.
Et kritisk trin i denne procedure vedrører blodglukosemålinger. Den mængde blod, der fylder øjets hulrum, er i sjældne tilfælde for lavt til at tillade indlæsning af glucometer teststrimmel. Derudover bør fisken ikke forblive på is for længe for at undgå blodkoagulation. De bør dog forblive på is i tilstrækkelig tid til at sikre induktion af anæstesIa og dyrenes død. Det er også vigtigt at nævne, at for akut hyperglykæmi bør mængden af D-glucose injiceres ændres for at tage højde for fiskens størrelse. Den 50 μL intraperitoneale injektion er designet til en mellemstor fisk (0,5 g). Faktisk kan en lille fisk ikke være i stand til at modtage en 50 μl intraperitoneal injektion, og injektionsvolumenet skal reduceres for at forhindre dyrs lidelse og for at undgå, at opløsningen skubbes lige ud igen ved tryk.
Et andet kritisk trin er reproducerbarheden af stabs sårskade af den voksne telencephalon; Som kræver nogle tekniske erfaringer. Derudover skal tælling udføres på tre successive sektioner af en region af interesse og hos mindst tre dyr. Automatiseret tælling i større hjerneområder kan afsløre vigtige oplysninger om den globale virkning af hyperglykæmi på neurogeneseprocessen.
En anden grund til at bruge zebrafIsh er for evnen til at overvåge biodistributionen af radiomærkede molekyler ved anvendelse af PET / CT. Her blev [18F] -FDG brugt, og dens fordeling gennem zebrafisklegemet blev påvist, især med hjernen og rygmarven. Sådanne teknikker er af særlig interesse ved bestemmelse af levering og bioakkumulering af potentielle terapeutiske midler i in vivo- modeller. Denne teknik repræsenterer også en alternativ metode til undersøgelse af nogle molekylers evne til at krydse gennem blod-hjernebarrieren og at bestemme deres potentielle virkninger på centralnervesystemet under fysiologiske eller patofysiologiske forhold. Faktisk er hyperglykæmi og hypoglykæmi kendt for at modulere blod-hjernebarrierepermeabilitet 36 .
En kritisk begrænsning af PET / CT-billeddannelse i zebrafisk efter intraperitoneal injektion er nødvendigheden af at bedøve fisken for at undgå enhver bevægelse under overtagelsen. Sådan bedøvelseKan kraftigt reducere hjertefrekvensen og dermed radiotracer biodistributionen. For at løse dette problem kan fisk injiceres og få lov til at genvinde i ferskvand i nogle minutter eller timer afhængigt af billeddannelsesprotokollen og halveringstiden for den anvendte radioisotop. Desuden kan den intraperitoneale injektion resultere i den stærke akkumulering af signal i peritoneal hulrum.
Som konklusion beskriver dette arbejde effektive metoder til etablering af modeller af hyperglykæmi hos zebrafisk og overvågning af radioaktivt mærket molekylfordeling. Sådanne fremgangsmåder kunne åbne et forskningsområde vedrørende undersøgelsen af virkningen af metaboliske forstyrrelser på hjernens homeostase og om biodistribution af potentielle terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der blev ikke offentliggjort potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker i høj grad Direction des Usages du Numérique (DUN) fra La Réunion Universitet til redigering af videoen (især Jean-François Février, Eric Esnault og Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan til voiceover, Mary Osborne-Pellegrin til korrekturlæsning Voice-over og CYROI-platformen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra La Réunion University (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Den Europæiske Union (CPER / FEDER) og Philancia-foreningen. ACD er modtager af stipendium fra Ministère de l'Education Nationale de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, La Réunion Universitet (Contrat Doctoral).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
