Summary
Bu çalışma, zebra balığı içinde akut ve kronik hiperglisemi modelleri oluşturmak için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır. Amaç, hipergliseminin, yapısal ve yaralanmaya bağlı nörogenez gibi fizyolojik süreçler üzerindeki etkisini araştırmaktır. İş ayrıca PET / CT'yi kullanarak radyoaktif işaretlenmiş molekülleri (burada [18F] -FDG) takip etmek için zebrafish kullanımını vurguluyor.
Abstract
Hiperglisemi kardiyovasküler ve serebral disfonksiyona yol açan önemli bir sağlık sorundur. Örneğin, inmeden sonra artmış nörolojik problemlerle ilişkilidir ve nörojenik süreçleri zayıflattığı gösterilmiştir. İlginçtir, yetişkin zebra balığı son zamanlarda hiperglisemi / şeker hastalığını taklit etmek ve yapıcı ve rejeneratif nevrojenezi araştırmak için ilgili ve faydalı bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışma, homeostatik ve beyin tamir koşulları altında hipergliseminin beyin hücresi çoğalması üzerindeki etkisini araştırmak için zebrafish hiperglisemi modelleri geliştirmek için yöntemler sunmaktadır. Akut hiperglisemi, yetişkin zebra balığı içine D-glukoz (2.5 g / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonu kullanılarak oluşturulmuştur. Kronik hiperglisemi, yetişkin zebra balığının, 14 gün boyunca su içeren D-glukoz (111 mM) içine batırılmasıyla indüklenir. Bu farklı yaklaşımlar için kan-glikoz düzeyinde ölçümler açıklanmaktadır. Hipergliseminin konstitütif a ve hiperglisemi üzerindeki etkilerini araştıran yöntemlerRetanatif nevrojenez, telencefalonun mekanik hasarını tarif ederek, beynin parçalanarak, bir mikro-top ile parafin gömülüp, kesitlendirilerek ve immünohistokimya prosedürleri uygulayarak gösterilir. Son olarak, PET / CT'yi kullanarak radyoaktif işaretli moleküllerin biyolojik dağılımını (burada [18F] -FDG) incelemek için zebrafish'i ilgili bir model olarak kullanma yöntemi de açıklanmaktadır.
Introduction
Hiperglisemi, aşırı kan şekeri seviyeleri olarak tanımlanır. Akut stres durumunu yansıtabilmesine rağmen, hiperglisemi de sıklıkla diyabetin teşhisine, insülin sekresyonu ve / veya dirençli kronik bir bozukluğa neden olan bir durumdur. 2016'da diyabetli yaşayan yetişkinlerin sayısı dünya çapında 422 milyona ulaştı ve her yıl 1.5 milyondan fazla kişi bu hastalıktan ölmekte ve bu durum önemli bir sağlık sorunu haline gelmektedir 1 . Gerçekten de, kontrolsüz şeker hastalığı, kardiyovasküler sistemi, böbrekleri ve periferik ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli fizyolojik bozukluklara neden olur.
İlginçtir, akut ve kronik hiperglisemi, bilişimi değiştirebilir ve demans ve depresyona katkıda bulunur 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Buna ek olarak, hastaların wHiperglisemi, iskemik inme sonrası kötü fonksiyonel, nörolojik ve sağkalım sonuçları ile ilişkilendirilmiştir 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Ayrıca hiperglisemi / diyabetin nöronal kök hücre aktivitesini ve nöronal farklılaşma, göç ve sağkalımı etkileyerek yeni nöronların oluşumuna yol açan bir süreç olan erişkin nörogenezini etkilediği gösterildi 2 , 12 .
Memelilerin aksine, zebra balığı gibi teleost balıkları, tüm beyin boyunca yoğun bir nörojenik aktivite gösterir ve yetişkinlikte beyin onarımı için olağanüstü bir kapasite sergiler. 13 , 14 , 15 , 16 . Özellikle, bu tür kapasiteler neu'nun ısrarlı olması nedeniyle mümkündürRadyal glia ve nöroblastlar da dahil olmak üzere ral kök / progenitör hücreler 17 , 18 , 19 . Buna ek olarak, zebrafish son zamanlarda obezite ve hiperglisemi / diabet 20 , 21 , 22 dahil olmak üzere metabolik bozuklukların incelenmesi için bir model olarak ortaya çıkmıştır.
Zebra balığı hiperglisemi ve nörogenezin iyi bilinen bir model olmasına rağmen, çok az çalışma, hipergliseminin beyin homeostazı ve bilişsel işlev üzerindeki etkisini araştırmıştır 12,23. Yapısal ve yaralanmaya bağlı beyin hücresi çoğalması üzerine hipergliseminin etkisini belirlemek için intraperitoneal D-glukoz enjeksiyonu yoluyla bir akut hiperglisemi modeli oluşturuldu. Buna ek olarak, kronik hiperglisemi modeli, balıkları suya eklenen suya daldırmak suretiyle üretildi.D-glikoz 12 . Zebra balığı, araştırmada birçok avantaj sergilemektedir. Gelişmenin ilk aşamalarında ucuz, yükseltilmesi kolay ve şeffaftır ve genomları dizilenmiştir. Bu çalışma bağlamında, ek avantajlar da sunmaktadır: (1) insanlarla benzer fizyolojik süreçleri paylaşıyorlar, bunları biyomedikal araştırmalar için kritik bir araç haline getiriyorlar; (2) yaygın ve güçlü nörojenik aktiviteleri göz önüne alındığında, hipergliseminin beyin homeostazı ve nörogenezis üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde incelenmesine izin verdikleri; Ve (3) bunlar araştırma için kullanılan memelilerin sayısının azaltılmasına izin veren alternatif bir model. Son olarak, zebrafish, PET / CT kullanan radyoaktif işaretlenmiş moleküllerin ve potansiyel terapötik ajanların biyolojik dağılımını test etmek için bir model olarak kullanılabilir.
Aşağıdaki prosedürün genel amacı, zebra balığı ile ilgili akut ve kronik hiperglisemi modellerinin nasıl kurulacağını görsel olarak belgelemek, zebHiperglisemik koşullarda beyin tadilatını değerlendirmek ve radyoaktif işaretlenmiş molekülleri (burada, [18F] -FDG) PET / BT kullanarak izlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin yabani tip zebra balığı ( Danio rerio ), standart fotoperiyod (14/10 saat aydınlık / karanlık) ve sıcaklık (28 ° C) koşullar altında tutuldu. Tüm deneyler, Fransa ve Avrupa Topluluk Araştırmaları'nda Hayvanların Kullanımına ilişkin Kılavuz (86/609 / EEC ve 2010/63 / AB) uyarınca gerçekleştirildi ve hayvan deneyleri için Yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Zebra balığı ile ilgili bir Akut Hiperglisemi Modelinin Oluşturulması
- 400 mg tricaine tozu 97.9 ml su ve 2.1 ml 1 M Tris / HCl tamponu (pH 9) içinde eritilerek bir stok solüsyonu olan tricaine (MS-222) hazırlayın. PH'ı 7'ye, alikuotu -20 ° C'de saklama için ayarlayın.
- Yetişkin zebra balığı için 100 mL balık suyuna (son tricaine konsantrasyonu:% 0.02) 5 mL tricaine (stok solüsyonu) koyarak bir anestetik hazırlayın.
- Bir zebra balığını (3 ila 6 ay) depodan anestezi cihazına hareket etmeden durana kadar aktarın.
- YenidenKesilmiş bir pipet kullanarak balıkları hareket ettirin ve emici doku kağıdına çabucak kurutun.
- Balık tartın.
- 1X PBS içinde çözülmüş bir D-glikoz şırınga hazırlayın ve 50 uL D-glikoz (2.5 g / kg vücut ağırlığı enjekte) enjekte edin.
NOT: Örneğin, 0,6 g'lık bir balık 50 μL% 3 D-glikoz / PBS solüsyonu alacaktır. - Balıkları sırtına koyun ve şırınganın iğnesini intraperitoneal boşluğa sokun.
- D-glikoz / PBS solüsyonunu yavaşça enjekte edin ve sonra balıkları tekrar suya koyun.
- Balık tamamen iyileşinceye kadar kontrol et. Kan şekeri ölçümünün yapılması için gerekli zamana gelene kadar tankına geri koyun.
NOT: Kan şekeri enjeksiyondan 1.5 saat sonra ölçülür.
2. Zebra bifisinde Kronik Hiperglisemi Modeli Oluşturmak
- 2 L'lık temiz balık suyu haznesi hazırlayın.
- Son bir D-glikoz konsantrasyonu için 40 g D-glikozu 2 L balık suyuna eritin.111 mM.
- D-glikoz içeren suda 5-7 yetişkin zebra balığına daldırın.
- Bakterilerin veya diğer mikroorganizmaların büyümesini önlemek için D-glikoz balık suyunu her 2 günde değiştirin.
- Tedaviden 14 gün sonra, kan glikoz düzeyini ölçmeden önce vücudun dışındaki D-glukozu çıkarmak için balıkları kısaca temiz suya koyun.
3. Zebra balığı içinde kan glikoz düzeylerini ölçme
- Hızlı ötanazi için balıkları buzla kapatın.
NOT: Tricaine'in aşırı dozu kullanmayın, çünkü bu kan glikoz düzeylerinde geniş değişiklikler meydana getirir. Balıkları pıhtılaştıracağından, balıkları buzda çok uzun süre bırakmayınız. - Tüm suyu çıkarmak ve kan şekeri ölçümü sırasında herhangi bir kan seyreltmesinden kaçınmak için, balıkları emici doku kağıdıyla silin.
- Diseksiyon forseps kullanarak bir göz kaldırın ve göz boşluğu kan dolu olana kadar bekleyin.
- Bir glikozimetreye bir test şeridi koyun veŞeridi göz boşluğuna sokun.
- Kan şekeri düzeylerini ölçün.
4. Hiperglisemiyi takiben Beyin Hücresi Proliferasyonunun Analizi
- Çözümler ve tamponlar: gereksinimler ve hazırlama
- Distile H20 (dH20) 900 mL'ye 100 mL 10x PBS ilave ederek 1 L PBS hazırlayın ve karıştırın.
- % 0.2 deterjan (PBS-T ile 1x PBS hazırlayın, materyal tablosuna bakın).
NOT: 1 L PBS-T'yi hazırlamak için 1 L PBS'ye 2 mL deterjan ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın ). - Bir etanol serisi (% 100 x 2,% 95;% 85;% 70;% 50 ve% 30) ve% 0.85 NaCl hazırlayın.
- Blokaj tamponu hazırlayın:% 0.5 ila% 1 süt tozu içeren PBS-T.
NOT: 200 mL bloke edici tampon çözeltisi hazırlamak için 200 mL PBST'ye 2 g süt tozu ekleyin. - Antijen alım tamponu, sodyum sitrat hazırlayın.
NOT: 1 L sodyum sitrat tamponu hazırlamak için 2.94 g sodyum sitrat triSodyum tuzu, 1 L dH 2 0'a dehidrat. 1 L'ye doldurmadan önce pH'ı 6'ya ayarlayın. - 100 mL 1x PBS'ye 4 g paraformaldehit ilave ederek% 4 paraformaldehid-PBS tamponu hazırlayın. Karıştırılarak 58-60 ° C'de tamamen eriyene kadar ısıtın.
- İmmünohistokimya için numune hazırlama: fiksasyon ve dehidrasyon
- Kan şekeri seviyesini ölçdükten sonra, solungaçların arkasındaki başı keserek kafayı bedeninden ayırın.
Not: Alternatif olarak beyin, mRNA ekstraksiyonu gibi diğer deneyler için doğrudan ekstrakte edilebilir ve dondurulabilir. - Başları 4 ° C'de PBS (PFA-PBS) içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid içinde gece boyunca fikse edin.
- Ertesi gün, kısaca PBS'de başları yıkayın.
- Mikroskop kullanarak beyinleri dikkatlice parçalara ayırın. PBS ile sabit başları durulayın ve bir mikroskop altında bir başkanı sabitlemek için bir iğne kullanın. Forseplerle gözleri ve kafatasını çıkarın. dikkatli bir şekildBeyni çıkarın ve 1x PBS'ye yerleştirin.
- Sabit beyni 20 dakika için% 85 EtOH, 15 dakika süreyle% 70 EtOH (iki kez), 30 dakika boyunca 30 dakika,% 0.85 NaCl,% 70 EtOH /% 0.85 NaCl (v / v), 1x PBS ile yıkayın Dak,% 95 EtOH 20 dakika ve% 100 EtOH 20 dakika (iki kez). Bir gece boyunca nihai% 100 EtOH çözeltisi içerisinde inkübe edin.
NOT: Kurutulmuş beyinler parafin yerleştirmeden önce 4 ° C'de% 100 EtOH'de birkaç ay kalabilir.
- Kan şekeri seviyesini ölçdükten sonra, solungaçların arkasındaki başı keserek kafayı bedeninden ayırın.
- İmmünohistokimya için örnek hazırlama: parafin gömülmesi için doku hazırlama
- Beyni küçük bir cam beherin içine koyun.
NOT: Toluen bazı plastiklere zarar verebileceğinden, plastik bir kap kullanmayın. - Etanolü çıkarın ve tolüen ile değiştirin, zira beyinler tamamen toluen ile geri kazanılmalıdır. İki 30 dakika boyunca toluen banyosu yapın.
- Tolueni çıkarın ve beyinleri bir gömme kasetine yerleştirin. Kapatılan kaseti eritilmiş parafin serisi beherlerde 58-60 ° C (her bir parafin beherglasında 30 dakika). Isıtma kapsül forsepsini açın. Parafin banyolarının sonunda, kasedi çıkarın ve bir kalıba biraz sıvı parafin dökün.
- Erimiş parafini bir kalıba dökün ve beyni içine yerleştirin. Kılavuz olarak beynin ön-arka yönünü kullanarak, ısınan kapsül forsepsini kullanarak beyninizi yönlendirin. Parafin, gömme makinesinin soğutma kısmı üzerinde sertleşsin.
- Teknik sebeplerden ötürü, beyinleri anteroposterior eksen boyunca konumlandırın. Parafin bloğunu açtıktan sonra, çapraz kesit vermeye izin vermek için eritilmiş parafin uygun yönde olacak şekilde kırpın ve bir kaset üzerine sabitleyin.
- Paralin blokunu mikrotomun koluna yerleştirin. Beyin numunesi seviyesine ulaşılana kadar 50 μm kalınlıktaki kesitleri kesin. Bir trapez elde etmek için parafin bloğunu kesin ve kesit kalınlığını 7 μm'ye ayarlayın. Parafin şeritlerini, fırça kullanarak toplayın ve siyah papaya koyun.er. Onları nazikçe her 3-4 bölüme kesin.
- Isıtma plakasına bir slayt yerleştirin ve dH20 su ile örtün.
- Kesilen şeritleri suya yavaşça yerleştirin. Parafin şeritleri yeterince serilip açıldığında, suyu emici kağıt mendili ile çıkarın. Son damlaları mekanik olarak çıkarın. Suları kaydıraklardan çıkarın ve yaklaşık 30-40 ° C'de ısıtma plakasında en az 3 saat kurumalarını bekleyin.
- Beyni küçük bir cam beherin içine koyun.
- İmmunohistokimya prosedürü
- Parafin mumunu, her biri 7 dakika süreyle üç kutu ksilen içine yerleştirerek çıkarın.
- Slaytları, her biri 2 dakika süreyle iki kapta% 100 EtOH ile koyun, ardından her biri 30 saniye boyunca% 95 EtOH,% 85 EtOH,% 70 EtOH ve% 30 EtOH ham su ile koyun. Son olarak, slaytları dH20 ile kısaca koyun ve her biri 5 dakika boyunca PBS'de iki kez yerleştirin.
- Bölümleri bir mikrodalga (500 W'de 2 dakika) sitrat tamponu içinde inkübe ederek antijen geri alma gerçekleştirinTampon kaynar. Slaytlar 15 dakika boyunca oda sıcaklığında geri gelsin.
- PBST'de üç kez, her biri 5 dakika yıkayın ve% 1 süt içeren PBST'de 45 dakika kesitleri bloke edin. Bir gece boyunca birincil antikorlarla ( örn. , Proliferatif hücre boyaması için çoğalan hücre nükleer antijen (PCNA); 1/100) bloke edici tamponda seyreltilmiş ( yani PBST,% 1 süt) inkübe edin.
- PBST'de üç kez, her biri 5 dakika yıkayın ve kesitleri bloke edici tampon ve DAPI (1/500) ile seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar ( örneğin keçi anti-fare Alexa Fluor 488; 1/200) ile 90 dakika inkübe edin.
- PBST'de üç kez, her biri 5 dakika yıkayın ve slaytları floresan montaj ortamı ile monte edin (materyal tablosuna bakın).
- Epifloresans ve / veya konfokal mikroskop kullanarak lekeyi analiz edin.
- Beyin hücresi çoğalmasını, ilgilenilen bölgenin en az üç ardışık beyin bölümünde, en az üç farklı bölgede ölçünimals.
NOT: Alternatif olarak, daha önce tarif edildiği gibi 24 , vibratome kesit alma ve serbestçe kayan immünohistokimyaya ilerlemek için beyin gömülü agarozda yapılabilir.
- Hipergliseminin beyin tamir mekanizmalarına etkisini incelemek
NOT: Alternatif olarak, akut ve kronik hiperglisemi altındaki beyin onarımının araştırılması telesensefalonun bıçak yarası hasarından sonra, daha önce 24 , 25 , 26'da tarif edildiği gibi gerçekleştirilebilir. Kısaca:- Tricaine ile yetişkin zebra balığı uyuşturucu.
- Balıkları ışıklı bir mikroskop altında bırakın.
- Bir elle balığı tutun.
- Öte yandan, kafatası boyunca sağ telencefalik yarı kürenin medial bölgesine dikey olarak 30 G şırınga yerleştirin.
- Balıkları taze balık suyuna geri koyun, D-glikoz takviyeli su (111MM) veya balık suyunu kontrol edin. Balıkların yaralanmadan 7 gün sonra hayatta kalmasına izin verin.
NOT: İşlemin geri kalan kısmı için 4. adıma bakın.
5. Zebra balığı: Fluorodeoxyglucose ([18F] -FDG) 'de PET / CT ile Radyoseptik Moleküllerin Biyo-Dağılımının Glikoz Metabolizmasını Analiz Ettirmek İçin Görüntüleme
- [18F] -FDG'nin 20 MBq'lik salin solüsyonu içeren 50 mcL'lik bir şırınga hazırlayın.
- Şırınga radyasyon koruyucu ekranın arkasına yerleştirilir.
- Tricaine ile yetişkin bir zebra balığı uyuşturucu.
- Balıkları bir radyasyon koruyucu ekranın arkasına yerleştirin.
- [18F] -FDG'yi intraperitoneal boşluğa enjekte edin. Balık göbeğinden sızıntı yapabilecek kalıntı [18F] -FDG'nin tespitini önlemek için enjeksiyon yerini küçük bir kağıt parçasıyla silin.
- Enjektör dozunu hesaplamak için şırınganın ve dokunun içerdiği kalan aktiviteyi ölçmek için bir radyoizotop kalibratör kullanın.
- Balıkları birEch, küçük bir parça emici doku tricaine ile ıslatılmış ve hafifçe sarın. Balıkları emici doku ile birlikte PET / CT görüntüleyicinin yatağına yerleştirin.
- Yatağı PET / CT görüntüleme sistemine yerleştirin ve alım işlemine başlayın.
- PET / CT alımını yapmak için devam edin.
- İşlemin sonunda, balıkları az miktarda taze balık suyuna geri koyun.
NOT: Alternatif olarak, [18F] -FDG enjeksiyonundan sonra, balık, PET için bir kez daha anestezi yapmadan önce, [18F] -FDG'nin difüzyonunu kolaylaştırmak için 10 dakika ila 1 saat boyunca az miktarda taze suya konabilir. / CT görüntüleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makalede açıklanan prosedürleri kullanarak, yetişkin zebra balığı üzerine D-glukoz (2,5 g / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonu yapıldı ve enjeksiyondan 1.5 saat sonra kan şekeri seviyelerinde belirgin bir artışa neden oldu ( Şekil 1A ). Enjeksiyondan 24 saat sonra, kan şekeri seviyeleri D-glikoz ve PBS ile enjekte edilen balıklar arasında benzerdi ( 12) . Kronik tedavide zebra balığı, D-glikoz suyuna (111 mM) batırılmış ve daha önce 12 , 22 gösterildiği gibi, 14 günlük tedavi sonunda ( Şekil 1B ), hiperglisemik hale gelmiştir.
Hipergliseminin beyin hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için akut ve kronik hiperglisemi indüksiyonunu takiben zebra bağı beyinleri üzerinde PCNA immünohistokimyası yapıldı. Akut hiperglis Yememi, beyin hücresi çoğalmasını etkilemedi 12 , daha önce Dorsemans ve meslektaşları (2016) tarafından gösterildiği gibi, kronik hiperglisemi, ventrikül boyunca nöral kök hücre proliferasyonunda belirgin bir düşüşe yol açtı. Gerçekten de, PCPA pozitif hücrelerin sayısı, subpalliumda (Vv / Vd), palliumda (Dm) ve kaudal hipotalamusta (LR / PR) lateral ve posterior girintiyi çevreleyen bölgelerde azaldı ( Şekil 2 ).
Akut ve kronik hiperglisemi altında telencefalonun mekanik yaralanmasından sonra yaralanmaya bağlı nörogenez incelendi. Zebrafish'de beyin hasarından sonra daha önce tarif edildiği gibi, mikroglial hücrelerin ve oligodendrositlerin ilk parankimal proliferasyonu, bunu takiben yaralanmadan 7 gün sonra ventriküler tabakada proliferasyonun kuvvetli bir yukarı regülasyonu meydana geldi. 25 , 27 , Ref "> 28 , 29 , 30. Akut hiperglisemi, beyin parankimasındaki proliferasyonun başlangıç basamağını modüle etmemiştir Aksine, kronik hiperglisemi, yaralanmadan 7 gün sonra telencefalik ventriküller boyunca beyin hücresi proliferasyonunu bozmuştur ( Şekil 3 ).
Zebra balığı modeli PET / BT görüntüleme yöntemini kullanarak radyoaktif işaretlenmiş moleküllerin biyolojik dağılımını izlemek için de ilginçtir. Burada [18F] -FDG, yetişkin zebra balığı içine intraperitoneal olarak enjekte edildi. 30 dakika sonra, PET / CT edinimi, glikozun sadece enjeksiyon yerinde değil, aynı zamanda beyin dahil balık başında ve omurilik boyunca dağılım gösterdiğini gösterir ( Şekil 4 ).
( A ) D-glukozun (2.5 g / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonu, enjeksiyondan 1.5 saat sonra kan glikoz düzeylerinde belirgin bir artışa neden olur (n = 3 ) ( B ) Zebra balığı 14 gün boyunca D-glikoz suyuna (111 mM) daldırıldığında, kan glikoz düzeylerinde (n = 15) önemli bir artış meydana gelir .Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Kronik hiperglisemi, 14 günlük tedaviden sonra beyin hücresi çoğalmasını etkiler. Proliferatif hücreler bir PCNA antikoru ile yeşil renkte etiketlenir. Hücre çekirdeği, DAPI ile karşıt lekelenir (mavi). Kronik hYalpglisemi, subgarit ( A ), palyum ( B ) ve kaudal hipotalamusta ventrikülün lateral ve arka girintisi çevresinde ( C ) 14 günlük tedaviden sonra beyin hücresi çoğalmasını azaltır. Ölçek çubuğu = 120 μm (A ve B), 200 μm (C). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Telencefalonun bıçak yarası yaralanması, lezyon sonrası 7. günde beyin proliferasyonunu yukarı düzenler. ( A ) Üst sagitalde belirtilen seviyedeki zebrafish telencephalon'un enine kesitinin şematik görünümü. Şema, zebra balığı beyin atlası 31'ten alındı. Orada D noktaları çoğalan hücreleri 32 , 33 göstermektedir . İğne lezyonun bölgesini gösterir. ( B ) PCNA (yeşil) immünohistokimyası, beyin hasarından 7 gün sonra, yaralı telencefalonda beyin ventrikülü boyunca proliferasyonun güçlü bir upregülasyonunu gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : intraperitoneal enjeksiyondan 30 dakika sonra [18F] -FDG'nin (20MBq enjekte edilmiş) PET / BT görüntülemesi. PET / CT görüntüsünün temsili görüntüleri, baş, beyin ve omurilik gibi zebra balığı vücudundaki geniş bir [18F] -FDG dağılımı göstermektedir.Files / ftp_upload / 55203 / 55203fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, zebrafishte hiperglisemi akut ve kronik modelleri oluşturmak için çeşitli yöntemleri açıklamaktadır. Bu prosedürlerin başlıca avantajları şunlardır: (1) araştırma için kullanılan memelilerin sayısının azaltılmasına izin verdikleri, (2) kurulması kolay ve hızlıdırlar ve (3) ekonomiktirler. Bu nedenle, bu tür modeller, atherothrombosis, kardiyovasküler işlev bozuklukları, retinopatiler, kan-beyin bariyeri sızıntısı ve konstitütif ve rejeneratif nörogenez dahil olmak üzere, farklı fizyolojik süreçler üzerindeki etkisini incelemek için çok sayıda hayvanda hipergliseminin etkisinin araştırılmasına izin verir. Bu çalışma normal veya yaralanmaya bağlı koşullar altında hipergliseminin beyin hücresi çoğalması üzerindeki etkileri üzerine araştırmalara nasıl devam edileceğini açıklamaktadır.
Kronik hiperglisemi prosedürünün kritik bir kısıtlılığı, bazı deneylerde, bazı balıkların, kronik daldırmadan sonra hiperglisemi göstermediğidirD-glikoz suyunda (111 mM, 14 gün süreyle). Duyarlı ve tepki vermeyen balıkların yüzdesi daha önce Dorsemans ve arkadaşları (2016) tarafından sırasıyla% 83,% 83 olarak tahmin edilmiştir. Balıkların yaşlarına, cinsiyetlerine ve daha fazla pankreatik β hücresi oluşturarak hiperglisemi telafi etme kapasitesine göre bireysel duyarlılıkları göstermeleri mümkündür 34 , 35 . Akut hiperglisemi için kan şekeri seviyeleri, enjeksiyondan 1,5 saat sonra oldukça homojen olup, yöntemin sağlamlığını gösterir.
Bu prosedürün kritik bir adımı kan-glikoz düzeyindeki ölçümlerle ilgilidir. Göz boşluğunu dolduran kan miktarı, nadir durumlarda glukometre test şeridinin yüklenmesine izin vermek için çok düşüktür. Buna ek olarak, kan pıhtılaşmasını önlemek için balık çok uzun süre buzda kalmamalıdır. Bununla birlikte, anestezinin indüksiyonunu sağlamak için yeterli bir süre buzda kalmalıdırlarIa ve hayvanların ölümü. Akut hiperglisemi için, enjekte edilen D-glukoz hacminin balık boyutunu hesaba katmak için değiştirilmesi gerektiğini de belirtmek gerekir. 50 μL intraperitoneal enjeksiyon, orta boy bir balık için tasarlanmıştır (0.5 g). Gerçekten de, küçük bir balık 50 μL intraperitoneal enjeksiyon alamayabilir ve enjeksiyon hacmi hayvanlarda acı çekilmesini önlemek ve solüsyonun basınca maruz bırakılmasını önlemek için azaltılmalıdır.
Bir diğer kritik adım, yetişkin telesensefalonun bıçak yarası hasarının tekrarlanabilirliğidir; Hangi teknik deneyim gerektirir. Ek olarak, ilgi çeken bir bölgenin birbirini izleyen üç bölümünde ve en az üç hayvanda sayım yapılmalıdır. Daha büyük beyin bölgelerinde otomatik sayım, hipergliseminin nörojenez sürecine global etkisi ile ilgili önemli bilgileri ortaya çıkarabilir.
Zebraf kullanmak için bir başka sebepIsh, PET / CT'yi kullanarak radyoaktif olarak işaretlenmiş moleküllerin biyolojik dağılımını izleme yeteneği içindir. Burada, [18F] -FDG kullanıldı ve özellikle beyin ve omurilik de dahil olmak üzere zebra balığı cismi boyunca dağılımı gösterildi. Bu teknikler, in vivo modellerde potansiyel terapötik ajanların verilmesini ve biyoakümülasyonunu belirlerken özellikle ilgi çekicidir. Bu teknik aynı zamanda bazı moleküllerin kan-beyin bariyerini geçme ve fizyolojik veya patofizyolojik koşullar altında merkezi sinir sistemi üzerindeki potansiyel etkilerini belirleme yeteneğini araştırmak için alternatif bir yöntem sunmaktadır. Gerçekten, hiperglisemi ve hipogliseminin kan-beyin bariyeri permeabilitesini modüle ettiği bilinmektedir 36 .
İntraperitoneal enjeksiyondan sonra zebrafish'de PET / BT görüntülemenin kritik bir sınırlaması, satın alım sırasında herhangi bir hareketi önlemek için balıkları anestezi altına almak için gereklidir. Bu tip anesteziKalp atış hızını ve dolayısıyla radyo-traktör biyolojik dağılımını önemli ölçüde azaltabilir. Bu sorunu çözmek için, görüntü protokolüne ve kullanılan radyoizotopun yarılanma ömrüne bağlı olarak, balık enjekte edilebilir ve temiz suda birkaç dakika veya saatte iyileşmesine izin verilir. Buna ek olarak, intraperitoneal enjeksiyon periton boşluğunda güçlü bir sinyal birikmesine neden olabilir.
Sonuç olarak, bu çalışma, zebra bağıda hiperglisemi modelleri oluşturmak ve radyo-etiketli molekül dağılımını izlemek için etkili yöntemler tanımlamıştır. Bu tür yaklaşımlar, metabolik bozuklukların beyin homeostazı ve potansiyel terapötik ajanların biyolojik dağılışı üzerindeki etkisinin araştırılmasıyla ilgili bir araştırma alanı açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Olası bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.
Acknowledgments
Videoyu düzenlemek için (özellikle Jean-François Février, Eric Esnault ve Sylvain Ducasse) La Réunion Üniversitesi'nden Du Numérique Yönergesi (DUN), sözlüğe okumak için Lynda-Rose Mottagan'a, yazım okuması için Mary Osborne-Pellegrin'e çok teşekkür ediyoruz Sesli görüşme ve CYROI platformu. Bu çalışma, La Réunion Üniversitesi (Bonus Nitelikli Rehberlik, Dispositifs incitatifs), Conseil Régional de La Réunion, Avrupa Birliği (CPER / FEDER) ve Philancia derneği tarafından sağlanan hibeler tarafından desteklendi. ACD, La Réunion Üniversitesi'nden (Contrat Doktora) Enseignement Supérieur et de la Recherche Ministère de l'Education Nationale'den bir burs hibe alıcısıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm× 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
References
- W. Diabetes. , Available from: http://www.who.int/diabetes/en (2016).
- Ho, N., Sommers, M. S., Lucki, I. Effects of diabetes on hippocampal neurogenesis: links to cognition and depression. Neurosci Biobehav Rev. 37 (8), 1346-1362 (2013).
- Cukierman, T., Gerstein, H. C., Williamson, J. D. Cognitive decline and dementia in diabetes--systematic overview of prospective observational studies. Diabetologia. 48 (12), 2460-2469 (2005).
- Gaudieri, P. A., Chen, R., Greer, T. F., Holmes, C. S. Cognitive function in children with type 1 diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care. 31 (9), 1892-1897 (2008).
- Brismar, T., et al. Predictors of cognitive impairment in type 1 diabetes. Psychoneuroendocrinology. 32 (8-10), 1041-1051 (2007).
- Ojo, O., Brooke, J. Evaluating the Association between Diabetes, Cognitive Decline and Dementia. Int J Environ Res Public Health. 12 (7), 8281-8294 (2015).
- Capes, S. E., Hunt, D., Malmberg, K., Pathak, P., Gerstein, H. C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 32 (10), 2426-2432 (2001).
- Stead, L. G., et al. Hyperglycemia as an independent predictor of worse outcome in non-diabetic patients presenting with acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 10 (2), 181-186 (2009).
- Kagansky, N., Levy, S., Knobler, H. The role of hyperglycemia in acute stroke. Arch Neurol. 58 (8), 1209-1212 (2001).
- Gilmore, R. M., Stead, L. G. The role of hyperglycemia in acute ischemic stroke. Neurocrit Care. 5 (2), 153-158 (2006).
- Desilles, J. P., et al. Diabetes mellitus, admission glucose, and outcomes after stroke thrombolysis: a registry and systematic review. Stroke. 44 (7), 1915-1923 (2013).
- Dorsemans, A. C., et al. Impaired constitutive and regenerative neurogenesis in adult hyperglycemic zebrafish. J Comp Neurol. , (2016).
- Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Dev. 8, 3 (2013).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
- Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
- Lindsey, B. W., Tropepe, V. A comparative framework for understanding the biological principles of adult neurogenesis. Prog Neurobiol. 80 (6), 281-307 (2006).
- März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
- Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L.
- Lindsey, B. W., Darabie, A., Tropepe, V. The cellular composition of neurogenic periventricular zones in the adult zebrafish forebrain. J Comp Neurol. 520 (10), 2275-2316 (2012).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. Zebrafish. , 2611-2619 (2012).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 274, 319-325 (2014).
- Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. J Vis Exp. (90), e51753 (2014).
- Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
- Rodriguez Viales, R., et al. The helix-loop-helix protein id1 controls stem cell proliferation during regenerative neurogenesis in the adult zebrafish telencephalon. Stem Cells. 33 (3), 892-903 (2015).
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Wullimann, M., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain: A topological atlas. , Birhaüser Verlag. Basel, Switzerland. 1-144 (1996).
- Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J Comp Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. J Comp Neurol. 488 (3), 290-319 (2005).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of Zebrafish as a Disease Model Provides a Unique Window For Understanding the Molecular Basis of Diabetic Metabolic Memory. iConcept Press. , 2611-2619 (2013).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate Immersion in an External Glucose Solution Differentially Affects Blood Sugar Values in Older Versus Younger Zebrafish Adults. Zebrafish. , (2016).
- Prasad, S., Sajja, R. K., Naik, P., Cucullo, L. Diabetes Mellitus and Blood-Brain Barrier Dysfunction: An Overview. J Pharmacovigil. 2 (2), 125 (2014).
