Summary
Detta protokoll är ett kostnadseffektivt alternativ för att uttrycka naket plasmid-DNA i mushud. Det övergripande målet med protokollet är att leverera immunrelaterade gener i hudvävnad för att avgränsa den funktionella rollen för en specifik gen i kutan inflammation.
Abstract
Dysreglering av immunsvar i huden är förknippad med många mänskliga hudsjukdomar. Direkt överföring av immunrelaterade gener i hudvävnad är en fascinerande metod för att undersöka immunmodulering av kutan inflammation vid musmodeller av mänskliga sjukdomar. Här presenterar vi en kostnadseffektiv protokoll som levereras naket DNA i mus huden och leder till transgen uttryck. Metoden är myntade "acufection", som betecknar acu punkteringsmedierad DNA-trans-fection. Att utföra acufection ades mushud först infunderas med DNA i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan prickas lätt med en bunt av akupunkturnålar för att underlätta absorptionen av DNA och transfektion in i celler. Plasmid-DNA antagligen tas upp av keratinocyter och dendritiska celler (DC) i huden och uttrycks in i protein. Mekanisk prick med nålar i sig inte orsaka hudskador eller framkalla keratinocytdifferentieringen aktivering. Uttrycketav de transfekterade generna detekterades i huden vid både transkriptionella och translationella nivåer efter acufection under 2 dagar och underhållas upp till 7 dagar. Det primära målet för utvecklingen av denna acufection metod var att undersöka en tidigare odefinierad isoform av IL-15. Användning av denna metod, en alternativt splitsad IL-15-isoformen med delvis borttagen exon 7 (IL-15ΔE7) uttrycktes i huden och behandlas därefter med en Toll-liknande receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), för att inducera inflammation. Acufection levererade IL-15ΔE7 i huden tryckte keratinocytproliferation, epidermal tjocklek och neutrofil rekrytering i IMQ-inducerad kutan inflammation. Med ökande intresse i att identifiera de regulatoriska mekanismerna för kutan inflammation, beskrivna protokollet här ger en kostnadseffektiv och mångsidig alternativ till genkanonen systemet eller microseeding för DNA-leverans in vivo. Det kan eventuellt tillåta upptäckten av funktionen av en nygenen i huden eller för att utreda ny behandling för kutana sjukdomar.
Introduction
Huden är den första raden av värdförsvar. Keratinocyter (KCS) är den huvudsakliga celltypen i huden hos människor och möss. Som svar på miljöstimuli (t.ex. solljus, syre, kemikalier och patogena invasion), är KCS aktiveras och producerar ett brett spektrum av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner såsom IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-a α och GM-CSF en. Tillsammans utlösa rekrytering av immunceller till huden. Förvärras kutan inflammation är ofta förknippat med många humana sjukdomar innefattande akut ektopisk kontaktdermatit och kroniska T-cellmedierad inflammation (t.ex. allergisk kontaktdermatit och psoriasis) 2. Modulera proinflammatoriska svar i huden genom att hämma KC-aktivering är ett rimligt tillvägagångssätt för att behandla kutan inflammation. Detta protokoll beskriver en ny metod för övergående uttrycka en cytokin gen i överhuden för att studera immun resPonse en följd av en sådan behandling i huden.
Epidermis komponerar det mest ytliga lagret av huden. Det fungerar som en fysisk barriär hålla externa substanser såsom nukleinsyror och patogener från att komma in de djupare hudlagren. Flera nålfria tekniker har fastställts för epidermal DNA-överföring 3, 4. DNA i lösning eller associerad med katjoniska liposomer eller adenovirusvektorer har direkt appliceras på epidermis modifierade med tekniker såsom avlägsnande av stratum corneum eller behandlingen med depilating reagens. Avlägsnande av den förhornade epitelet underlättar DNA korsar den epidermala barriären och interaktion med keratinocyter och Langerhans-celler för att inducera immunsvar 5. Medan en stor yta är tillgänglig för DNA överföring och detta tillvägagångssätt inte innebär nålar, det finns nackdelar inklusive kravetför de stora kvantiteter av DNA (10-100 ng), hård behandling på huden genom strippning, och motsägande resultat i att inducera immunsvar i de immuniserade djuren utan DNA leverans booster 6. Mikropartikel-medierad intracellulär tillförsel av naket DNA till huden har visat sig vara mycket effektiv och reproducerbar för att inducera immunsvar 7, 8. En handhållen genkanon har använts för att bombardera målstället huden med plasmid DNA-belagda guldpartiklar 2 um diameter i storlek med hjälp av trycksatt helium luftflödes 9. Plasmid-DNA antagligen tas upp av KCsand dendritiska celler (DC) i huden och proteinet lokalt uttryckta eller transporteras till dränerande lymfkörtlar från DCs 10. Även om genkanon systemet är enkelt och kräver begränsad teknisk erfarenhet, kostnaden för att förbereda och leverera "DNA-bullåt "(dvs guldpulver, heliumgaser) och för genkanonen själv har begränsat dess allmänna tillämpning. Dessutom kravet på en heliumgas avgivningssystem begränsar enkel genpistol transport när experimenten utförs på olika platser. Microseeding har visats för att uppnå en högre effektivitet av genöverföring än enda injektion och partikelbombardemang 11. Microseeding använder en tatuering pistol för att leverera DNA till huden utan användning av partikelpärlor 11. Oscillerande mikronålarna på huden med användning av detta tillvägagångssätt är sannolikt att direkt skrapa cellmembranet och sålunda överföra DNA till flera celler samtidigt. emellertid är smärta i samband med det stora antalet injektioner med 0,254 nålar mm diameter en nackdel.
Här ger vi ett alternativ till DNA-leverans in vivo. Den "acufection" 12. Medan acufection visar sig vara ett enkelt och mindre demaENDE metod för DNA-leverans in vivo, den optimala mängden av DNA för olika gener och tiderna att sticka huden måste vara noggrant optimerade för att erhålla reproducerbara resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Honmöss på 8 - 12 veckor gamla användes för denna studie. C57 / BL6 vildtyp (WT) och IL-15 deficient (IL-15 - / -) möss köptes från National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan och Taconic Farm, respektive. IL-15-deficient (IL-15 - / -) och IL-15-dominanta (IL-15 +/- och IL15 + / +) visade en 1: 3-förhållande i den andra generationen från korset av IL-15 +/- heterozygoter. Genotypen av IL15 - / - möss bekräftades genom PCR-analys. Möss hölls i specifika patogenfria (SPF) anläggning i försöksdjurs Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Alla djurförsök inklusive anestesi material och metoder genomfördes i enlighet med djur protokoll som godkänts av National Taiwan University College of Medicine och College of Public Health Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) (Intyg om godkännande av Animal Protocol 20.130.225).
<p class = "jove_title"> 1. Framställning av akupunktur,OBS: Akupunktur nålar är medicintekniska produkter som består av ett handtag och en nålände (Figur 1A). Diametrarna för akupunkturnål varierade från 0,2 mm (36 G) till 0,35 mm (28 G). Vi väljer den finaste nålspetsen för att undvika potentiell överdriven cellskador under prickning huden. Det finns 4 olika längder av den 0,2-mm nål inklusive 13 mm (0,5 tum), 25 mm (1,0 tum), 40 mm (1,5 in) och 50 mm (2,0 tum) i längd. En bunt av 10 nålar med 13 mm längd som den bästa bekvämt grepp under oscillering av nålen på C57BL / 6-mus hud. Parametrarna kan ändras om metoden appliceras på huden hos större djur eller utförs av forskare med större händer.
- Ta akupunkturnålar från den sterila, icke-pyro paket. Placera nålar på en steril duk.
- Använda klistermärkband för att binda 10 nålar tillsammans ina knippe (Figur 1B).
OBS: De 10 nålar är geometriskt anordnade att bilda en cylinder form. För bekvämlighet, använda en bit paraffinfilm för att stabilisera arrangemanget innan applicering av tejpen. Se till att alla nålen punkter är på samma plan. Med användning av ett knippe i stället för en enda nål underlättar maximal DNA-infusion genom att öka kontaktytan mellan nålarna och huden.
2. Framställning av en stor mängd och endotoxinfritt Plasmid-DNA
- Transformera kemiskt kompetenta bakterieceller med plasmid-DNA.
- Välja och ympa en enda bakteriekoloni i 3 ml LB-medium innehållande antibiotika och inkubera vid 37 ° C i en skakanordning över natten.
- Skala upp odlingen genom spädning av bakteriekultur vid en: 100 i 250 ml LB-medium med antibiotika och skakning över natten vid 37 ° C.
- Framställa en stor mängd av DNA genom användning av en hög kvalitet äry, endotoxin fri plasmid förberedelse kit enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Acufection protokollet kräver hög renhet och en stor kvantitet av plasmid-DNA. Användning av en hög kvalitet, är endotoxinfritt och kolumn-renat plasmid-DNA rekommenderas. - Eluera DNA i sterilt vatten. Förvara DNA i små alikvoter vid -20 ° C tills redo för acufection.
OBS: Undvik upprepad frysning-och-tining av DNA för att säkerställa konsekvent plasmid-DNA-expression. - Späd plasmid-DNA till en mg / ml i steril PBS under acufection.
3. Förfarande för Acufection
OBS: Den optimala mängden av DNA och det område av mål-hudytan kan variera för olika gener och måste optimeras ytterligare. Den prickning kraft och antal gånger för att lossa hornskiktet i huden också kan variera beroende på tjockleken huden. Dessa betingelser måste bestämmas noggrant efter att ha utvärderat expressionsnivån av acufected gene transcripts av QRT-PCR.
- Väga mössen och administrera tribrometanol (400 ug per g kroppsvikt) genom peritoneal injektion.
OBS: 2,2,2-tribrometanol är ett injicerbart anestesimedel som vanligen används i möss. Lösningar görs genom att lösa ett icke-farmaceutisk kvalitet 2,2,2-tribrometanol (2,5 g) i destillerat vatten (200 ml) innehållande 2,5% av 2-metyl-2-butanol. - Använd vet oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
OBS: bedövande effekt kommer att induceras i 1-2 min. Kontrollera tå nypa reflex för att säkerställa tillräcklig anestesidjupet före operation. - Raka ryggflank huden och tillämpa hårborttagningskräm att upplösa keratin proteiner i hårstrået.
OBS: Användning av hårborttagningskräm att ta bort hår kommer att underlätta infusion av DNA in i huden. - Använd vatten indränkt bomullstussar att torka av hårborttagningskräm.
OBS! Hårborttagningskräm är löslig i vatten. Fullständigt avlägsnande av krämen Will förhindra en oljig yta och säkerställa en bättre stickande resultat. - Använd en steril bomullstopp indränkt i 70% etanol för att desinficera hudytan.
- Märket målområdet (1 cm x 1 cm) på den avhårade huden med en i förväg uppmätt stencil. OBS: Märk målplatsen kommer att bidra till att tillämpa nålen bunt upp och ner inom ett avgränsat område. Detta är viktigt att säkerställa leverans av samma mängd av DNA till en specifik ytarea för att minimera experiment-till-experimentvariant.
- Placera en 10 mikroliter droppe av plasmid-DNA (10 | ig) på den markerade hud.
OBS: Den mängd DNA för acufection varierar med olika gener och den typ av expressionsvektor. Mängden DNA som används bör noggrant titreras innan de utför försöket av intresse. Den 10 mikroliter är en liten vätskedroppe och det sitter väl på den rakade och avhårade huden utan att rulla ner medan pricking. Inkluderar en kontrollgrupp av möss behandlade med 10 mikroliter tom vektor-DNA för att jämföra med möss encufected med studien genen. - Håll akupunkturnål knippet (Figur 1B) och prick den markerade ytan med en upp-och-ner rörelse för 100 gånger eller tills fukten från DNA i PBS på huden försvinner. OBS! Vissa rodnad i huden kan förekomma. Undvik att göra djupa nedskärningar som blöder. Antalet upp-och-ner pricking rörelser på hudytan är operabelt bestäms när fukt från DNA i PBS (10 mikroliter) försvinner på huden. Vi bestämde oss 100 gånger i 30 sekunder, eftersom det har gett de mest konsekventa resultat från acufection levererade generna. Om tillämpligt, kan nålarna återanvändas i upp till 6 mål hud stick (1 cm x 1 cm vardera). Skölja nålarna i 70% etanol och PBS mellan acufection. Ändra till nya nålar när de är matta eller för olika plasmid-DNA för att undvika korskontaminering.
- Placera acufected möss på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen tills vaken.
- Återgå möss till sin bur när de haråterfått tillräcklig medvetandet. Anmärkning: Behåll acufected möss i separat bur (mindre än 5 djur per bur) från buren av un-acufected möss.
- Sätta vattenflaska på plats och återgå buren till IVC (individuellt ventilerade bur) rack.
4. postoperativ vård
- För de första 48 h efter ingreppet, noga övervaka möss för något obehag inklusive beteendeförändringar (rastlöshet, agitation eller ätstörningar) eller onormalt utseende (grov pälsen eller krökt kroppshållning).
5. Imiquimod (IMQ) Behandling av IL-15ΔE7-acufected Skin
OBS: Transkriptionell expression och proteinproduktion av acufected gen kan detekteras på dag 3. Möss acufected med plasmiden av intresse kan behandlas med olika typer av stimulantia 3 dagar efter transfektion. Vi visar här genom att behandla IL-15ΔE7-acufected mushud med IMQ grädde. IMQ är en imidazoquinolin amin godkänd feller behandla externa genitala och perinatal vårtor 13. Topisk IMQ behandling visas för att inducera humana psoriasisliknande hudsjukdomar hos möss med manifestationen av flagnande hud, epidermal proliferation och dermal neutrofil infiltration 12, 14, 15.
OBS: plasmidvektor innehöll fullängds-mus IL-15-cDNA, under reglering av förlängningsfaktor-1 α (pEF), flankerad med en IL-2-signalpeptiden och en FLAG-markör vid C-terminalen (pEF-IL- 15, 5859 baspar), som konstruerades såsom beskrivits av Bamford et al. 16. Plasmiden används som en IL-15 mall för att ta bort de första 16 aminosyrorna vid resterna 33-48 i exon 7 av IL-15-genen för IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 baspar) genom SOE (syntes genom överlappningsförlängning) PCR-metod 17. Bakteriekolonier som var framgångsrikttransformerad med IL-15ΔE7 verifierades genom restriktionsenzymdigerering, följt av DNA-sekvensering 12, 18. En stor mängd av endotoxinfri plasmid-DNA framställdes såsom beskrivs i protokollet steg 2.
- Söva acufected möss genom intraperitoneal injektion av tribrometanol (400 ug per g kroppsvikt) och tillämpa veterinären oftalmologiska salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi. Kontrollera tå nypa reflex för att säkerställa tillräckligt djup anestesi innan de operativa rutiner. OBS: Eftersom en 2 cm x 2 cm hud kommer att behandlas för IMQ, är 2 doser av pIL-15ΔE7 plasmid-DNA (10 pg i 10 mikroliter PBS per dos) acufected på 2 målställen (1 cm x 1 cm vardera).
- Märke flankerar huden (2 cm x 2 cm) som täcker acufected området.
- Använd Q-tip applikator att lokalt tillämpa IMQ grädde på den markerade ytan. Anmärkning: steg 5,1 endast genomförs för den första dosen (60 mg / dos).De kommande konsekutiva doser tillämpas på icke-sövda möss.
- Dokumentera förändringar av IMQ behandlad rygg hud dagligen med en HD-videokamera. Notera: En person håller musen medan en annan spelar in. Stillbilder skjuts och redigeras vid ett senare tillfälle.
- Euthanize möss genom injektion av en överdos av tribrometanol (800 ug per g kroppsvikt), följt av cervikal dislokation på dag 4 eller dag 7 efter IMQ behandling. Huden skärs och bearbetas (steg 4,1-4,5).
6. Homogenat av Mouse Skin
- Använd ett par av kirurgiska sax för att göra ett horisontellt snitt från svansroten. Fortsätt bilateralt till basen på bakbenen och fortsätter att skära vertikalt längs flanken till basen på forelimb.
- Dra försiktigt huden från underliggande vävnad från bakre till den främre. Använd sax för att klippa bort rygghuden. Placera huden på en steril petriskål.
- Använd en skalpell för att skära målHud och frysa den i flytande kväve omedelbart. Notera: Samma storlek acufected hud utan (1 cm x 1 cm) eller med IMQ behandling (2 cm x 2 cm) är fixerad för varje mus för att minimera experiment-to-experimentet variationer.
- Placera frysta hud vävnad i mitten av en pre-kyld två fack murbruk med handtag och en mortelstöt. Använd en ledande hammare på murbruk att pulvrisera vävnaden.
- Snabbt placera det pulveriserade vävnaden till ett nytt rör innehållande 500 mikroliter av cellysering reagens för RNA-extraktion eller till ett rör innehållande 50 | il av PBS och 1x proteasinhibitorcocktail att erhålla protein lysat.
7. H & E och immunhistokemisk färgning av hud Avsnitt
- Placera hudvävnaden i en kassett och doppa den i 4% paraformaldehyd över natten.
- Bädda och vävnadssnitt, som i vårt fall utfördes av Pathology Laboratory vid LAC, NTU. Notera: Avsnittet skärs vid en tjocklek av 5 um. Plats vävnads avsons på positivt laddade objektglas.
- Värma objektglasen vid 65 ° C under 15 min.
- Placera glasen i en färgning rack. Doppa kuggstången till motsvarande tank innehållande xylen substitut för 5 minuter två gånger följt av sekventiell nedsänkning i 100%, 95%, 80%, 75%, 60% och 50% etanol (5 min vardera) för rehydrering. Doppa objektglasen i kranvatten under 3 min före färgning.
- Utför hematoxylin och eosin färgning. Obs: H & E färgning utfördes på begäran Pathology Laboratory vid LAC, NTU.
- För immunohistokemisk fläck, blockera sektion med blocket lösning vid rumstemperatur under 5 min för att reducera icke-specifik bakgrundsfärgning. Notera: Blocklösningen kommersiellt utvecklats med immunfärgning tekniker. Inget djur serum finns i denna produkt.
- Doppa sliden i PBS för att skölja ur blocklösning.
- Utspäda blocklösning i PBS vid 1:10 och tillsätt 2% fetalt bovint serum (FBS) (utspädningslösning).
- Färga en seriell sektion i samma körning med samma lösning utelämna den primära antikroppen för att kontrollera icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen.
8. fotograferar och analys av Stained Tissue Avsnitt
- Visualisera H & E-färgade och IHC vävnadssnitt under ett ljusfältmikroskop. Fånga bilder med hjälp av laddningskopplad anordning (CCD) kamera ansluten till mikroskopet. för qVANTITATIV analys kan bildbehandlingsprogram användas
- Scan hela färgade snitt med hjälp av en scanscope med en 20X mål.
- Mäta epidermal tjocklek inom en 1-mm segmentet av epidermis och räkna antalet Ki67-immunoreaktiva celler inom segmentet.
OBS: Kvantitativ analys utförs med hjälp av mikroskopi Automation & bildanalysprogram. Epidermal tjocklek är definierad av avståndet mellan basalskiktet och det yttersta skiktet av epidermis. - Räkna antalet Ly6G-immunreaktiva celler i det dermala området (230 x 270 ^ m 2 rektangel) omedelbart under topisk IMQ-behandlad hud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan vissa rodnad var tydlig inom den första timmen efter prickning med akupunkturnålar, huden rensas på dag 2 och ingen negativ hudreaktion upp till dag 7 observerades efter prickning (Figur 2A). Nål prickning inducerade mycket låg nivå av epidermal orthokeratosis och minimal dermal infiltration av H & E-analys jämfört med obehandlad hud (Figur 2B). Den epidermal tjocklek (figur 2C) och antalet Ki67 + -celler (Figur 2D) var jämförbara mellan nål-prickas och obehandlad hud, vilket visar att akupunkturnål-pricked huden orsakade inte vävnadsstörningar märkbar eller cellulär proliferation i epidermis. Jämfört med sprutnålen (1.067 mm i diameter) 12, stickande med akupunkturnålar inducerade reducerade nivåer av de uttryck för kemokin CXCL-1 och proinflammatorisk cytokin IL-6 på dag 2 som fortsatte att minska på dag 5 (figur 3A). Att validera uttrycket av acufected transgenen i mushud rades en plasmid som uttrycker IL-15-cDNA acufected i huden av IL-15-deficient C57BL / 6 (IL-15 KO) möss. Även om låga nivåer av transkription från acufected plasmid-DNA observerades i avhårade huden, oscillering med akupunkturnålar förbättrad nivån av gentranskription (figur 3B). IL-15 produktion detekterades på dagen 2 och förblev stabil upp till dag 7 (figur 3C). Dessa resultat visar att acufection infuserar effektivt plasmid-DNA och tillåter uttryck av det kodade proteinet i huden utan att inducera överdriven keratinocyt aktivering.
WT-möss acufected med en plasmid som kodar IL-15ΔE7. Möss uttryckte IL-15ΔE7 mRNA och proteinet tills 3dagar efter transfektion (Figur 4A). Mössen därefter topiskt behandlas med IMQ kräm på dag 3. Medan IMQ behandlings inducerade silverflingor i kontroll WT möss, var IMQ-inducerade silverflingor reducerad i IL-15ΔE7 acufected WT-möss (Figur 4B). Interestingly, expression av acufected IL-15ΔE7 inhiberade signifikant Ly6G + neutrofil infiltrering i IMQ-behandlad hud jämfört med unacufected WT huden (Figur 4C) 12. Genom acufection visade vi den nya funktionen hos IL-15ΔE7 i huden. IL-15ΔE7 modulerar IMQ-inducerande neutrofil infiltration.
Figur 1. Illustration av akupunktur nålar. (A) Den akupunkturnål (36 G x 0,5" ) är sammansatt av enhandtag och en nål ände. (B) Tio akupunkturnålar är bundna i ett knippe med hjälp av tejp. Längden av knippet är ca 4 cm, mätt med linjalen (lägre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Stickande av akupunktur nålar inte orsakar Märkbar Skin Skador eller Keratinocyte Activation. (A) Triple anvisade platserna i grå rutor på den rakade och avhårade flank huden på musen stack 100 gånger vardera med akupunkturnålar. Fotografier togs på den första timmen och upp till 7 dagar efter prickning att övervaka hudskador. Rakade och avhårade huden utan nål prickning användes som kontroll. <strong> (B) H & E-analys av formalinfixerade, paraffininbäddade hudsektioner från obehandlade eller nål-pricked mushud. Scale bar: 100 | j, m. (C) En millimeter etapper av H & E-färgade sektioner från obehandlade eller nål-pricked mushud valdes för mätning av epidermal tjocklek (avståndet från basala till det yttersta skiktet). Varje stapel representerar medelvärdet av epidermal tjocklek mätt från 3 hudsektioner. Fel stapel representerar standardfelet av medelvärdet (SEM). Betydelsen av skillnaden mellan grupperna testades genom oparat Students t-test. (D) Seriella sektioner av samma prover färgades med anti-Ki67 för immunohistokemisk analys. Varje stapel representerar medelvärdet av Ki67 + celler lokaliserade i varje 150 | j, m-epidermis i längd per 1 mm segment. Fel stapel representerar standardfelet av medelvärdet (SEM). Betydelsen av skillnaden mellan grupperna testades genom tvåvägs ANOVA follskyldigt Bonferronis post hoc-test. (ns: ej signifikant). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Acufection uttrycker effektivt proteinet av intresse utan att orsaka märkbar Keratinocyte Aktivering. (A) rakade och avhårade flank hud lämnades obehandlad (NTC), slipning med 1,067 mm diameter (19 G) sprutnål (Syr.) Eller pricking 100 gånger av akupunkturnålar (ACU.). De transkriptionella nivåer av CXCL-1 och IL-6 på dag 2 och dag 5 mättes genom QRT-PCR (n = 3). (B) rakade och avhårade huden hos IL-15-deficient mus anbringades topiskt med en droppe av ett plasmid-DNA som uttrycker IL-15 without (depilering) eller med akupunkturnål prickning (depilering + prick). Transkription av IL-15 i varje grupp på dag 2 mättes genom TaqMan QRT-PCR. Transkription av IL-15 kunde inte detekteras i PBS-kontroll (NTC) av IL-15-defekta möss. (C) IL-15-produktion från IL-15-deficient mushud som var obehandlade eller IL-15-acufected för olika dagar (en vävnad för varje dag) mättes genom IL-15 ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Demonstration av IL-15ΔE7 Dämpar IMQ-inducerad silvriga flagnande hud och hämmar neutrofil infiltration. (A) Den transkriptionsnivå och proteinproduktion av IL-15ΔE7-acufected (WT / pIL-15 [6; E7) eller tom vektor-kontroll (WT / pEmpty) hud mättes med QRT-PCR och ELISA (n = 2, varje tidpunkt), respektive. (B) Töm vektor för eller IL-15ΔE7-acufected flanken huden vid dag tre topiskt behandlade med IMQ grädde (60 mg). Fotografier av WT / pEmpty och WT / pIL-15ΔE7 mus flanken vid dag 6 efter IMQ behandling. (C) Hud sektioner från WT / pEmpty eller WT / Pil-15ΔE7 möss efter IMQ behandling på dagarna 3 och 6 färgades med anti-Ly6G antikropp och räknades. Varje stapel representerar medelvärdet för Ly6G + celler från 4 IMQ-behandlade möss. Fel stapel representerar standardfelet av medelvärdet (SEM). Betydelsen av skillnaden mellan grupperna testades genom tvåvägs ANOVA följt av Bonferronis post hoc test. Paneler A och C är modifierade med tillstånd från Journal of Investigative Dermatology, licensnummer 3901890227597. Klickahär för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiska steget för att säkerställa uttryck av den acufected plasmid-DNA är att jämnt oscillera och lossa hornlagret i huden. Samtidigt som du trycker nålarna försiktigt utan att skära huden, bör kraften vara tillräckligt hårt för att trycka ytan. För att underlätta absorption av DNA i 10 mikroliter lösning på en 1 cm x 1 cm ytarea, bör nålarna oscillera upp-och-ner i ca 100 gånger i 30 s. Man kan bestämma den kraft som behöver sticka huden och genom att notera hur många gånger som behövs för att ge den bästa uttrycksnivån för den acufected genen.
Modifiering för mängden plasmid-DNA som använts för att få en tillfredsställande nivå av expression efter acufection kan behövas eftersom den kan variera för olika gener. Titreringsexperiment bör utföras för att bestämma den optimala mängden plasmid-DNA som skall appliceras före experimentet samt. Resultat från kvantitativ RT-PCR-analys kommer att bidra till att avgöra optimal kvantitet av plasmid-DNA och bästa skick för att erhålla reproducerbara resultat.
Den exakta mekanismen för den acufection processen återstår att klargöras. Medan transkription från topiskt levererade plasmid-DNA inträffade i rakade och avhårade huden vid låg nivå, pricking av akupunkturnålar förbättrad transfektionseffektivitet (fig 3B). Analogt av microseeding protokoll i vilket multipla perforeringar med tatuering pistol 11, är acufection levererade plasmid-DNA sannolikt underlättas genom scrape av cellmembranet hos keratinocyter och hårsäckar 19, 20. Stimuleringar av epidermis efter hårborttagning, depilating reagens och nål oscillation kan inducera keratinocyt aktivering i viss utsträckning och ytterligare förstärka DNA-upptag av Langerhans och DCs 6. En begränsning hos detta protokoll är att mängden plasmid-DNA togs uppav celler kan inte styras exakt. Vi föreslår inte att använda denna metod för att behandla ett stort hudområde. För att minimera variationer i uttrycksnivåerna av den levererade genen bland experiment bör volymen av DNA-lösningen och storleken på målet hudyta fastställas för samma uppsättning experiment. Att generera reproducerbara resultat, är det lämpligt att upprepade experiment är som skall utföras av samma individ.
Med avseende på den gen pistolanordningen och microseeding, till användning av ett knippe av akupunkturnålar leverera naket DNA är billigt. Procedurerna är också enkelt. Det kräver väldigt lite teknisk erfarenhet att följa acufection protokollet. Acufection orsakar minimal trauma för djur och ingen viktförlust hittas efter operationen. Smärtnivån är låg såsom bedömdes genom frånvaron av signifikant beteendeförändring efter acufection operationen.
Sammanfattningsvis att använda akupunkturnålar lossahornlager av huden för DNA-upptagning av värdceller ger ett ekonomiskt alternativ metod för att uttrycka ett protein i mushud. Ett brett spektrum av immunrelaterade gener har ännu inte funktionellt känne i huden 21, och detta understryker behovet av en snabb studie av en ny gen på huden. Användning av denna metod, kan man lätt bestämma huruvida produkten av genen av intresse har någon ny funktion. Denna acufection protokoll ger en bekväm och genomförbar verktyg för nya upptäckter att modulera immunsvar mot bota kutan sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av anslag från ministeriet för vetenskap och teknologi (MOST 103-2633-B-002 till 002; 104 till 2320-B-002 till 048). Vi tackar Dr.. Betty Wu-Hsieh och Chien-Kuo Lee på NTU, Leigh Zerboni vid Stanford University och Dr. Peter Hoffmann vid University of Hawaii för att läsa manuskriptet, Yun Chien på NTU för tekniskt stöd, och Dr. Wen-Chi Wei på jordbruk bioteknik Research Center vid Academia Sinica för teknisk rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
