Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

منذ أوائل 1970s، يقترب التصوير المقطعي في انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) وقد استخدمت على نطاق واسع لتوصيف الهيكلي من العينات البيولوجية 1، 2، 3. كان النداء من التصوير المقطعي الإلكترون أنها يمكن أن تستخدم لدراسة مجموعة واسعة من الهياكل البيولوجية على مقياس متناهي الصغر، من بنية الخلايا والتركيب الدقيق للعضيات لهيكل المجمعات الجزيئات والبروتينات. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التصوير المقطعي الإلكترون لدراسة عينات سميكة جدا (أكبر من 0.5 ميكرون). في الواقع، عينات سميكة تنتج الكثير من الإلكترونات المبعثرة، وتوليد منخفضة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وصور. وبالإضافة إلى ذلك، التصوير المقطعي ينطوي على مجموعة من الصور من العينات يميل، مع سماكة واضح من العينة زيادة مع زاوية الميل. على الرغم من نثر غير مرن يمكن أن تتم تصفيتهخارج باستخدام مرشحات الطاقة، يتم الوصول إلى كمية حرجة من الإلكترونات اللازم للصور SNR عالية بالكاد في تيم. وبالتالي، يكون فقط تم دراسة العينات البيولوجية سميكة باستخدام باجتزاء 4.

بعض العينات لا يمكن أن شرائح: البعض قد تتحلل عندما يتم قطع، والبعض الآخر بحاجة إلى أن تدرس في مجملها من أجل فهم تعقيداتها. نهج بديل هو استخدام تيم في وضع 5، 6، 7، 8 المسح الضوئي. في المجهر الإلكتروني النافذ (STEM)، مسار بصري من الإلكترونات وهو يختلف عن ذلك في TEM التقليدية. الالكترونات التي تمر عبر عينة من دون تشتت يمكن جمعها على المحور البصري مع مشرق الميدان (BF) كاشف 9، في حين أن تلك المنتشرة مطاطيا يمكن جمعها في زاوية معينة من المحور البصري مع كاشف الظلام الميدان (DF).ميزة أخرى من STEM هي أن شعاع الالكترون تركيزا يتم فحصه على سطح العينة، مما يساعد على جمع بكسل حسب بكسل للصور. على الرغم من أن شعاع الالكترون يوسع بينما يمر من خلال العينة 10، هذا المخطط مجموعة معينة هو أقل حساسية للإلكترونات المنتشرة inelastically من تيم التقليدية. وعلاوة على ذلك، ليس هناك عدسة بعد العينة في STEM، وبالتالي تجنب الانحرافات اللونية التي يمكن أن تحدث في تيم. طول الكاميرا يمكن تعديلها بحيث كاشف BF بالكشف أساسا الإلكترونات unscattered. باستخدام كاشف DF لدراسة عينات سميكة لا ينصح به بسبب تشتت متعددة، والتي تنتج صورا دقيقة. بدلا من ذلك، كشف BF يمكن استخدام 11. في حين الجذعية يمكن أن تنتج صورا SNR عالية، ولديها منخفض نسبيا العمق من الميدان نظرا للتقارب شعاع عالية نسبيا مقارنة مع تيم، والحد من كمية المعلومات المتعمقة التي يمكن استردادها من سميكةالعينات. في حالة المجهر STEM لتصحيح انحراف، حيث زاوية التقارب يمكن أن تصل إلى 30 مراد، يمكن مجال العمق من تكون منخفضة بما فيه الكفاية بحيث تنبع المعلومات التي هي في التركيز من طائرة الوصل فقط بضعة نانوميتر . إنشاء شعاع الالكترون في وضع مواز يعزز العمق من مجال شعاع الالكترون على حساب القرار 12. ومع ذلك، هذا الإعداد ليس من الممكن دائما.

كلما كان ذلك ضروريا لاستخدام شعاع متقاربة الإلكترون، لا بد من استخدام التقنيات التي تعزز العمق من مجال شعاع الالكترون عند دراسة عينات سميكة. وأفادت الدراسات الأخيرة اقتناء صور متعددة في طائرات التنسيق المختلفة في جميع أنحاء عينة لاسترداد أكبر قدر ممكن من المعلومات في التركيز 13 و 14. تصف الدراسات طريقتين مختلفتين للتعامل مع المعلومات من طائرات التنسيق المختلفة. Hovden وآخرون.الجمع في الفضاء فورييه الصور التي تم جمعها في طائرات التنسيق المختلفة، والحصول على إعادة الإعمار النهائي مباشرة من معكوس 3D تحويل فورييه 13. في المقابل، DAHMEN وآخرون. وضع محرك شعاع اعادة الاعمار متقاربة لإعادة بناء في الفضاء الحقيقي حجم 3D من طائرات التنسيق المختلفة 14. وضعت لدينا مختبر أيضا وسيلة لتصوير العينات البيولوجية سميكة. كانت استراتيجيتنا مختلفة من طريقتين المذكورة أعلاه في أننا دمج المعلومات التي هي في التركيز في طائرات التنسيق المختلفة وإعادة بنائها حجم 3D النهائي في الفضاء الحقيقي باستخدام شعاع ضوئي مواز 15. كان هدفنا هو تطوير طريقة التي يمكن أن تتم في أي مختبر المجهر الإلكتروني. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تهدف إلى جمع الصور محورية في كمية محدودة من الوقت، مقارنة الإطار الزمني للتجارب التصوير المقطعي التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا اقتراح طريقة جولد تكييفها للاستخدام مع أنواع مختلفة من التنسيق والبرمجيات إعادة الإعمار.

في سياق النشر لدينا من 2015 15، أردنا أن تصور وتميز الانتعاش من العمق من الميدان، لذلك استخدمنا تقارب كبير شبه زاوية من 25 مراد. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لأداء من خلال-تنسيق التصوير في STEM وفقا لطريقة تم تطويرها في المختبر لدينا في عام 2015 15، ونقدم كيف تمت معالجة البيانات من 2015. هذه الطريقة استرداد المعلومات في التركيز من عدة طائرات التنسيق في جميع أنحاء (750 نانومتر) عينة بيولوجية سميكة ويمكن اعادة البناء 3D عالية الجودة. حيثما كان ذلك مناسبا، وتعرض أيضا الاختلافات في هذه المنهجية مقابل الأساليب التي تستخدمها الجماعات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تحذير: استشر أوراق بيانات سلامة المواد (MSDSS) من الكواشف المختلفة قبل استخدامها. العديد من المواد الكيماوية المستخدمة في إعداد العينات سامة، مسرطنة، مطفرة، و / أو reprotoxic. استخدام معدات الوقاية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل طول، والأحذية المغلقة اصبع القدم) والعمل تحت غطاء الدخان أثناء التعامل مع العينة. باجتزاء العينة مع مشراح مستدق ينطوي على استخدام أدوات حادة، ويتوخى الحذر في استخدام هذه الأدوات إلزامي. في الخطوات الموضحة أدناه، تفترض مقدما البلاغ أن العينة عينة ثقافة الخلية. قد تحتاج إلى تعديل وفقا لنوع العينة، وخاصة الخطوات الطرد المركزي البروتوكول.

1. إعداد المخازن وخلطات

  1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، و1.76 ملي KH 2 PO 4).
  2. تحضير المحاليل التي تحتوي على 30٪، 50٪، و 70٪ آخرونhanol في برنامج تلفزيوني لعينة الجفاف. أداء عينة الجفاف التي يحتضنها تدريجيا العينة في زيادة تركيزات الإيثانول.
  3. إعداد راتنجات الايبوكسي عن طريق خلط ثنائي الفينول-A- (epichlorohydrin) (20 مل)، dodecenyl السكسينك (9 مل)، ميثيل-5-في norbornene-2،3-ثنائي الكربوكسيل (11 مل)، و2،4،6-تريس ( dimethylaminomethyl) الفينول (0.7 مل)؛ نسب خلط الأخرى يمكن استخدامها تبعا لالصلابة المطلوبة من الراتنج.
  4. تحضير المحاليل التي تحتوي على 30٪، 50٪، وراتنجات الايبوكسي 70٪ في الإيثانول لعينة التضمين. أداء الراتنج التضمين التي يحتضنها تدريجيا العينة مع زيادة تركيزات الراتنج.
    ملاحظة: تعتمد مجلدات من الحلول التي يجري اعدادها على نوع العينة التي شملتها الدراسة. وهناك حاجة إلى المزيد من الحلول لأنسجة من الثقافات الخلية.

2. التثبيت وتلوين للعينة

  1. أجهزة الطرد المركزي لزراعة الخلايا لمدة 5 دقائق في 5000 ز س. تنفيذ كافة centrifugations التالية باستخدام نفس الظروف.
  2. تجاهل طاف وإصلاح بيليه الخلية عن طريق إعادة التعليق في برنامج تلفزيوني (1 مل) مع 4٪ لامتصاص العرق، و 2٪ غلوتارالدهيد. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (الشكل 1A). بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا في 4 درجات مئوية خلال الليل أو خلال عطلة نهاية الاسبوع.
  3. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف ويغسل بيليه 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (1 مل) لإزالة وكلاء مثبت.
  4. بعد إصلاح العينة مع 1٪ أوسو 4 في برنامج تلفزيوني (1 مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف ويغسل بيليه 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (1 مل) لإزالة تماما أوسو 4. تنشيط أوسو 4 في النفط وتجاهل.
  6. إضافة 2٪ خلات اليورانيل في برنامج تلفزيوني (1 مل) كعامل النقيض واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1B).
  7. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف ويغسل بيليه 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (1 مل) لإزالة ميلان اليورانيل غير منضمetate. اليورانيل خلات تحتوي على عناصر مشعة، وينبغي التخلص منها في حاوية مخصصة للنفايات المشعة.
    ملاحظة: حضانة مرات يمكن تعديلها وفقا لحجم العينة. على سبيل المثال، تثبيت وتلطيخ للعينات سمكا، مثل عينات الأنسجة، تتطلب مرات حضانة أطول. قد تكون أوقات أطول الحضانة أيضا أفضل للجفاف والخطوات التضمين. يمكن استبدال خلات اليورانيل التي كتبها حلا "، اليورانيل أقل" التي تحتوي على أملاح الجادولينيوم.

الجفاف 3. عينة

  1. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني (1 مل) مع 30٪ من الإيثانول (الشكل 1C).
  2. كرر الخطوة 3.1 باستخدام حلول مع الزيادة التدريجية في تركيزات الإيثانول (50٪، 70٪، وتصل إلى 100٪). خلال هذه الخطوات الجفاف، والحفاظ على عينة عند 4 درجة مئوية لأغراض حفظ العينات.
  3. بعد الطرد المركزي، وتجاهل supernatالنمل و resuspend بيليه في الإيثانول النقي (1 مل)؛ احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

4. الراتنج تضمين

  1. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend بيليه في الإيثانول مع 30٪ راتنجات الايبوكسي (1 مل) لمدة 30 دقيقة في RT (1D الشكل).
  2. كرر الخطوة 4.1 باستخدام حلول مع تركيزات الراتنج زيادة تدريجيا الايبوكسي (50٪، 70٪، وتصل إلى 100٪).
  3. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend بيليه في راتنجات الايبوكسي النقي (1 مل)؛ احتضان بين عشية وضحاها في RT. وجود تصلب DMP-30 قد تؤدي إلى البلمرة من الراتنج. إذا حدث هذا، وإعداد مجموعتين من راتنجات الايبوكسي، واحد مع واحد دون DMP-30.
  4. بعد الطرد المركزي، resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من راتنجات الايبوكسي النقي (يحتوي على تصليب) في كبسولة بلاستيكية. يجب أن تكون العينة في الجزء السفلي من كبسولة بلاستيكية.

5. الراتنج البلمرة

  1. أناncubate كبسولة بلاستيكية تحتوي على عينة في مجموعة حاضنة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. أنواع أخرى من الراتنج قد تتبلمر مع إعدادات مختلفة.
  2. إزالة كبسولة من الحاضنة والتحقق من أن الراتنج تمت بلمرة. يجب أن يكون الراتنج الصلب إذا ضغطت على سطح صلب.
  3. إضافة راتنجات الايبوكسي النقي (يحتوي على تصليب) على الجزء العلوي من راتنج بلمرة التي تحتوي على عينة. وهذه طبقة إضافية من الراتنج يجعل من الاسهل لقطع العينة. احتضان الكبسولة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

باجتزاء 6. عينة

  1. جبل العينة رأسا على عقب في حامل العينة بحيث تكون العينة نحو الأعلى وإصلاحه على كتلة التشذيب من مشراح مستدق. قفل محكم على رافعة لتأمين كتلة تقليم إلى مشراح مستدق.
  2. باستخدام شفرة حلاقة أو مماثل أداة قطع حادة، وقطع كبسولة بلاستيكية لفصلها من راتنج بلمرة. قطع الراتنج بحيث تكون العينة احتواءإد في الراتنج تقريبا في شكل هرم. ليست هناك حاجة لإزالة كبسولة بلاستيكية بأكملها؛ فقط إزالة الجزء الذي يغطي عينة بلمرة.
  3. خذ كبسولة وصاحب العينة الخروج من كتلة التشذيب وتثبيتها على ذراع تتحرك من مشراح مستدق.
  4. تثبيت سكين التشذيب على كتلة سكين وتقليم بدقة وجوه الهرم. ينصح استخدام مناظير لإعطاء الشكل المثالي للهرم. أفضل الهرم، وأفضل أقسام سيكون.
  5. خلع سكين التشذيب واستبدالها بسكين الأنسجة التي يمكن استخدامها لقطع المقاطع التي هي أكثر سمكا من 0.5 ميكرون.
  6. بعد ملء كفيت السكين الأنسجة مع الكمية المناسبة من الماء، وجلب طليعة السكين على سطح العينة واستخدام المنظار لضبط زاوية كبسولة الملعب حتى أن السكين سوف شريحة عموديا على الهرم.
  7. ضبط سرعة القطع وفقا للالمطلوبسمك الباب لاستعادة أقسام متجانسة.
  8. دع قسم تطفو فوق الماء والسمك مع حلقة.
  9. نقل حلقة نحو الشبكة النحاسية المجهر الإلكتروني التي تم وضعها على رأس من ورق الترشيح.
    ملاحظة: يجب أن يكون تم التعامل مع الشبكة سابقا لزيادة hydrophilicity لها. لا يمكن أن يؤديها هذا مع قلم طلاء الشبكة.
  10. نظرا لامتصاص الماء من ورقة الترشيح، والسماح للقسم عصا إلى الشبكة. اتركها لتجف لبضع دقائق قبل إدخاله في المجهر الإلكتروني.

7. تصميم من خلال البؤرية إمالة سلسلة

  1. جمع الصور من خلال البؤرية في فترات التركيز المستمر.
    ملاحظة: من خلال البؤرية إمالة سلسلة تتكون من مجموعة من الصور من خلال البؤرية التي يتم جمعها في كل زاوية الميل للإمالة سلسلة. ينبغي أن يكون التركيز السعة كلها كافية لتغطية عينة سمك كله.
  2. تحديد قيمة الفاصل التركيز. إذا كان الفاصل الزمني يساوي دepth من الميدان، وجمع العينة بأكملها في التركيز؛ ويمثل هذا الإعداد أعلى أخذ العينات الممكنة. إذا كان الفاصل الزمني أكبر من العمق من الميدان، لن تكون حصلت بعض أجزاء من العينة في التركيز، وهذا يعني أن بعض أجزاء من العينة لن يتم جمعها في التركيز.
  3. حساب العمق من مجال شعاع الالكترون من الطول الموجي للإلكترون والتقارب شبه زاوية شعاع الالكترون. في حين أن طول موجة الإلكترونات يرتبط ارتباطا مباشرا الجهد التسارع، واستخدام التقارب شبه زاوية المقدمة من قبل الشركة المصنعة المجهر الإلكتروني أو تحديد ذلك تجريبيا من نمط حيود عينة معروفة 16. لأن الإلكترونات تسارع في λ الطول الموجي ضرب العينة مع تقارب شبه زاوية α في المجهر الإلكتروني، استخدم المعادلة التالية لتحديد مجال العمق من (DOF):

    معادلة
  4. التصميمسلسلة الاتصال بحيث التركيز السعة كلها سوف تغطي عينة في سمك واضح القصوى (أي، في أعلى إمالته).
    ملاحظة: سوف 0.75 عينة ميكرون سميكة يكون لها سمك واضح من 2.19 ميكرون في الميل 70 درجة، وبالتالي فإن السعة التركيز يجب أن يكون أكبر من 2.19 ميكرون. لهذه العينة، إذا كانت فترة التركيز تحدد فوق يساوي 50 نانومتر، وسوف تحتاج إلى 44 صور (2.19 ميكرون / 50 نانومتر) لتغطية العينة في أقصى سمك لها على ما يبدو. التركيز السعة الكاملة تساوي قيمة الفاصلة التركيز مضروبا في عدد من الخطوات المحورية. على أعلى الميل (θ)، يتم تعريف عينة سماكة واضح كما يلي:

    معادلة

التصوير 8. عينة

ملاحظة: إنه خارج نطاق هذا البروتوكول لوصف كيفية إعداد المجهر الإلكتروني في وضع الجذعية. معظم هذه المعلومات يمكن الاطلاع طن الدليل المرجعي قدمت من قبل الشركة المصنعة المجهر الالكتروني. ومع ذلك، لاحظ ما يلي: أ) يجب أن يتم اختيار حجم البقعة وفقا لالتكبير المطلوب. ثانيا) Ronchigram يجب الانحياز بشكل جيد؛ والثالث) في وضع BF، ولا بد من تعديل طول الكاميرا لتحديد الإلكترونات unscattered مع الحفاظ على إضاءة جيدة للكشف. يجب أن تكون مضيئة أقسام راتنج يترسب على شبكات النحاس المجهر الإلكتروني قبل الحصول على الصور لمنع الانكماش. قد يكون مرتبك انكماش الراتنج والآثار شحن خلال الحصول على الصور. استخدام عدسة فتحة موضوعية قد تحسن الاستقرار عينة عندما تحدث تأثيرات الشحن. ومع ذلك، في حالة معينة من الاجهزة STEM، فتحة موضوعية لا تتوافق مع وضع HAADF التصوير، وفتحات صغيرة جدا موضوعية غير متوافقة مع وضع BF التصوير.

  1. باستخدام تضخم منخفضة (حوالي 20،000X في STEM)، من خلال تصفح العينة وتحديد موقع المنطقة من اهتمام.
  2. ضبط طنانه eucentric ارتفاع (Z-محور) حتى تتمكن المنطقة من الفائدة لا ينجرف بعيدا في حين تناوب العينة.
  3. تحقق من وجوه الفائدة سوف تبقى مرئية في جميع أنحاء مجموعة الميل بأكمله.
  4. نظرا لوجود عدد كبير من الصور المكتسبة خلال من خلال البؤرية إمالة سلسلة، تستخدم برنامج جمع التلقائي. إما استخدام حل تجاري أو تصميم برامج جمع البيانات المخصصة إذا رغبت في ذلك. تأكد من أن البرنامج قادر على تنفيذ الخطوات الثلاث التالية:
    1. تتبع والتركيز كما هو الحال في مخطط قياسي جمع إمالة سلسلة.
    2. تأكد من أن الصور من خلال البؤرية تتداخل مع Z-الموقف من العينة.
    3. الحصول تلقائيا سلسلة من الصور من خلال البؤرية في كل زاوية الميل.
  5. يعطي البرنامج المعلمات الرئيسية للإمالة من خلال سلسلة البؤرية (أي فترات التنسيق، خطوة محورية، والحد الأدنى زاوية الميل، وأقصى زاوية الميل، وخطوة الميل، وسرعة المسح الضوئي).
  6. بدايةعملية جمع الصور وانتظر البرنامج لإنهاء.

تجهيز 9. صورة

ملاحظة: في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ معالجة الميل من خلال سلسلة البؤرية باستخدام يماغيج الإضافات 17. التكميلي البيانات 1 يدل على ماكرو يماغيج للخطوة محاذاة (Turboreg) ودمج المعلومات في التركيز (عمق المجال الممتد) لمن خلال البؤرية إمالة سلسلة مصممة مع ثلاث قيم التركيز.

  1. محاذاة الصور التي تم جمعها في نفس الميل زاوية (أي الصور من خلال البؤرية). منذ الصور ليست لديهم نفس المعلومات في التركيز، وأنهم لا يكنون نفس الميزات للمحاذاة. أداء محاذاة طريق مواءمة الصور المجاورة اثنين اثنين (أي بعد التسلسل الهرمي هرمي، مع أقرب قيم التركيز أولا) باستخدام Turboreg 18، المساعد يماغيج.
  2. دائما التحقق من محاذاة الصور من خلال البؤرية في كل زاوية الميل.كومة من الصور من خلال البؤرية الانحياز لتحسين الفحص البصري.
    ملاحظة: المنطقة فقط التي هي في التركيز يجب أن ينتقل أثناء التصفح من خلال المكدس. محاذاة دقيقة هي الشيء الأكثر أهمية، لأن الخطوة التالية يتكون من استرداد المعلومات التي هي في التركيز من صور مختلفة.
  3. دمج المعلومات التي هي في التركيز باستخدام عمق الممتدة من الميدان 19، المساعد يماغيج. هذا سوف يولد في نهاية المطاف صورة واحدة من كومة من الصور. ويمكن استخدام العديد من إعدادات أثناء الانتعاش العمق من الميدان، ولكن استخدام أعلى الإعدادات للحفاظ على معلومات الصورة.
    ملاحظة: يتم الآن تتكون سلسلة الميل من صورة واحدة في زاوية الميل، كل صورة تحتوي على معلومات في التركيز تعافى من الصور من خلال البؤرية.
  4. معالجة البيانات.
    ملاحظة: الأدوات القياسية لمواءمة وإعادة البناء يمكن أن تستخدم منذ الآن تم تخفيض البيانات لمعيار إمالة سلسلة. في هذا البروتوكول، TomoJ هو لناإد لمحاذاة البيانات وإعادة الإعمار البيانات 20 و 21. مزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام TomoJ يمكن العثور عليها في المنشور الأصلي 22.
  5. أداء المحاذاة الدقيقة للإمالة سلسلة.
    ملاحظة: استراتيجية جيدة لاستخدام حبات الذهب وعلامات إيمانية لتتبع بدقة التحولات بين الصور. ويمكن أيضا أن تستخدم الدنيا المحلية إذا حبات الذهب لا يمكن أن تضاف إلى العينة.
  6. إجراء إعادة الإعمار 3D من البيانات الانحياز. تتوفر لأداء عمليات إعادة البناء في الفضاء الحقيقي أو الفضاء فورييه، ولكل منها مزايا وقيود عدة خوارزميات.
  7. إذا كان الاصطفاف النهائية للإمالة سلسلة فقيرة، إجراء بعض التحسينات طريق الاستفادة المثلى من الخطوات الأولية. نكرر الخطوات المحاذاة إذا يبدو إعادة الإعمار 3D النهائي غير واضحة أو مشوهة. في الممارسة العملية، وكلما زاد عدد من طائرات التنسيق التي تم جمعها، كلما كان ذلك أفضل وعلى النقيض من تفاصيل إعادة الإعمار 3D.
    ملاحظة: سيالبرامج veral يمكن استخدامها لمعالجة من خلال البؤرية إمالة سلسلة. ومع ذلك، تم اختيار الأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول، لأنه في تجربتنا، وأدوا أفضل. Turboreg 18 أداؤها أفضل من حيث محاذاة الصور عندما كان التدرج من التركيز الحالي. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات على الموقع الإلكتروني المخصص 23. عمق الممتدة من الميدان المساعد 19 أداء جيدا للغاية من حيث استعادة المعلومات في التركيز من صور مختلفة، في حين أسفرت أدوات أخرى في التعديلات بكسل مرئية. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات، لا سيما فيما يتعلق كتابة السيناريو، على هذا الموقع مخصص 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في دراستنا، وتسارع الإلكترونات إلى 200 كيلو فولت في انبعاث المجال المجهر انتقال الإلكترون بندقية. وقد تم جمع الصور في وضع STEM BF باستخدام مدة انتظار 20 ميكرو ثانية. وفيما يتعلق تصميم الميل من خلال سلسلة البؤرية، وجدنا أن فترات التركيز من 150 نانومتر أعطى نتائج مرضية لدراسة التركيبية من 750 نانومتر سميكة البيولوجية عينة على الرغم من أن الحقل العمق من شعاع الالكترون كان فقط 3 نانومتر منذ كنا كبيرة جدا تقارب شبه زاوية من 25 مراد.

العينة التي تم تحليلها في هذا التقرير هي المثقبية البروسية، وهو حقيقي النواة وحيدة الخلية التي تدرس بشكل مكثف لأن هذا عضية يتم حفظها بشكل ملحوظ من الطلائعيات على الثدييات 25 السوط. تم علاج الخلايا على النحو الوارد في بروتوكول إعداد العينات، وركزنا على التحليل البنيوي على الجيب سوطي من T. البروسية ( (الشكل 2B، C، و D). على الصور التي تم جمعها، والمنطقة التي هي في التركيز يبدو رقيقة، والأكثر من الصورة غير واضحة بسبب مجال العمق من محدود. يتم تنفيذ دمج المعلومات في التركيز على الصور التي تم جمعها وتنتج صورة واحدة، حيث منطقة في التركيز أوسع من ذلك بكثير (الشكل 2E).

دمج المعلومات في التركيز يمكن تصور أفضل عن طريق تسليط الضوء على المناطق ذات تردد عال من الميل سلسلة الصور من خلال البؤرية (بكسل البيضاء في الشكل 2F، G و H). كان الأمر يماغيج "إيجاد الحواف" لناإد في هذه الدراسة. يستخدم هذا الأمر تصفية سوبيل للكشف عن تغيرات في شدة بكسل المجاورة. نزوح من منطقة عالية التردد الكشف يمكن ملاحظتها من صورة واحدة إلى أخرى. على الصورة حيث تم دمج المعلومات في التركيز، وترددات عالية تغطي أكثر من الصورة (الشكل 2I). يسمح هذا الأسلوب التحقق من تجهيز جيد من خلال البؤرية إمالة سلسلة.

استخدام من خلال البؤرية إمالة سلسلة، يتم جمع معلومات إضافية في التركيز وتستخدم أثناء عملية إعادة الإعمار 3D. وهذا ينتج المزيد من التباين وSNR ويقلل من آثار عدم وضوح لوحظ في اعادة البناء 3D من العمق من الميدان المحدود الصور 15. في الفضاء فورييه، يتم استرداد معلومات إضافية مقارنة مخطط جمع إمالة سلسلة الكلاسيكية، حيث لا يوجد سوى على المستوى البؤري يتم جمعها 13. وعموما، فإن نوعية في كل أنحاء 3إعادة الإعمار D هو أكثر الخواص مقارنة مخطط الكلاسيكية جمع إمالة سلسلة.

شكل 1
الشكل 1: صور عرض الخطوات المختلفة لبروتوكول إعداد العينات البيولوجية. ويمكن تقسيم بروتوكول إعداد العينات إلى أربع أنابيب الخطوات. وأ) ثابت العينة في امتصاص العرق وغلوتارالدهيد، B) وظيفة ثابتة في رباعي أكسيد الأوزميوم ويتناقض مع خلات اليورانيل، C) المجففة في الإيثانول، ودال) جزءا لا يتجزأ من الراتنج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
التحقق من الانتعاش العمق من الميدان. انتعاش مجال العمق من يمكن التحقق على الصور من عينة مائلة. أ) في 0 درجة الميل، والعديد من التفاصيل يمكن ملاحظتها في جيب سوطي (العلم جيب) للخلية T. البروسية جزءا لا يتجزأ من الراتنج. يقع جيب سوطي في السيتوبلازم (CYT)، والقاعدية الجسم (BB) المراسي السوط (العلم) لغشاء سوطي. B، C، و D) ثلاث صور من نفس جيب سوطي، يميل في 70 درجة في المجهر الإلكتروني، تم الحصول عليها. تم جمعها مع فترات التركيز من 300 نانومتر. E) ولدت هذه الصورة من عمق الممتدة من الميدان يماغيج المساعد ويحتوي على المعلومات في التركيز على B، C، و D F، G، H، وI) تم احتساب هذه الصور مع "إيجاد الحواف" الأمر في يماغيج من أجل HIGHLآيت المعلومات عالية التردد الواردة في B، C، D و E، على التوالي. تمثل بكسل البيضاء الترددات العالية، الموافق المعلومات في التركيز. شريط المقياس هو 250 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التكميلي ملف 1. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول إعداد نموذج التقليدية جنبا إلى جنب مع دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل 3D على العينات البيولوجية سميكة باستخدام STEM من خلال البؤرية التصوير المقطعي. وقد تم استخدام الراتنج التضمين من العينات البيولوجية لعقود 26، والبروتوكولات البديلة التي يتم تكييفها لأنواع مختلفة من العينات يمكن العثور على طوال الأدب 27. في المقابل، التصوير عينات سميكة في STEM باستخدام طرق من خلال التركيز هو مشروع جديد، وعلى الأرجح أن تتحسن الطرق كما أن تصبح أكثر انتشارا.

وكان الهدف من هذا العمل لوصف بروتوكول إعداد العينات، وبشكل أكثر تحديدا، وظروف التصوير لأداء من خلال-تنسيق اكتساب الميل سلسلة في STEM مع المعدات المتوفرة حاليا وفي كمية معقولة من الزمن. لهذا السبب، استخدمت فترات التركيز كبيرة. في الواقع، ليس هناك إجماع حول كيفية إغلاقوينبغي أن تكون طائرات التنسيق لتصوير عينة سميكة مع STEM عن طريق البؤرية إمالة سلسلة. وعادة ما يستغرق فترة تصل إلى عدة ثوان لجمع الصور STEM، وكلها التقليدية إمالة سلسلة يمكن أن يستغرق ساعات لإكمال. ونتيجة لإثبات صحة مفهوم، فمن الممكن لجمع مئات أو حتى آلاف من الصور. ومع ذلك، فمن الواضح أن لا تناسب الأوقات جمع طويلة للاستخدام اليومي. يجب أن تؤخذ شعاع الاستقرار وعينة الانجراف في الاعتبار عند تصميم مثل هذه التجارب الطويلة. وعلاوة على ذلك، وأحيانا جمع طويلة تثير مسألة جرعة الإلكترون المتراكمة. وهكذا، في الوقت الحاضر، STEM من خلال البؤرية إمالة سلسلة هي مناسبة فقط لدراسة عينات مقاومة للشعاع، مثل العينات البيولوجية جزءا لا يتجزأ من الراتنج أو المواد غير العضوية، وذلك أساسا بسبب جرعة الإلكترون كبيرة المطلوبة. ونظرا للمفاضلة بين اكتساب الوقت والجودة من إعادة الإعمار 3D النهائي، ونحن نوصي باستخدام فترات قليلة خلال البؤرية في المشاريع حيث لا يشترط ارتفاع القرار،الثانية ونحن نوصي باستخدام أكبر كمية من فترات خلال البؤرية في المشاريع التي تتطلب دقة عالية.

هناك عدم توافق في الآراء حول الخطوات المحددة في هذه الطريقة بسبب حداثته. ومع ذلك، فمن الواضح أن العديد من الخطوات الهامة لإعادة البناء عالية الجودة من STEM من خلال البؤرية إمالة سلسلة قواعد البيانات. أولا، محاذاة الصور التنسيق في كل زاوية الميل يجب أن يتم تنفيذها بعناية، كما أشار في المواد الأصلية ثلاثة اصفا من خلال البؤرية جمع الصور 13 و 14 و 15. على الرغم من أن الصور التي تم جمعها في القيم تنسيق مختلف لا تبادل المعلومات المشتركة، Turboreg يبقى حلا جيدا للدقيقة، المحاذاة التلقائية للصور. ثانيا، دمج الصور الوصل، كما يؤديها في هذا البروتوكول، في الاستفادة من توليد صورة واحدة في زاوية الميل، والتي يتم التعامل بسهولة من قبل أي محاذاة الميل سلسلةمنة و 3D برنامج برنامج إعادة الإعمار. تم تصميم عمق الممتدة من المكونات في الميدان في البداية للصور المجهر الخفيفة؛ ومع ذلك، يبدو أن الحل الأفضل لدمج المعلومات في التركيز من الميكروسكوب الإلكتروني 28. حل بديل هو النظر في مجموعة كاملة من الصور ومجموعة بيانات إمالة سلسلة واحدة مع عدة صور في زاوية الميل، على غرار ما قامت به Hovden وآخرون. 13 وDAHMEN وآخرون. 14. هذا يتطلب استخدام خوارزميات إعادة البناء على أساس فورييه-13 أو Ettention، الذي تم تطويره من قبل DAHMEN وآخرون. 29 والذي هو برنامج إعادة الإعمار 3D الوحيد الذي يمكن إعادة مجلدات 3D من الصور التي تم جمعها في القيم المحورية المختلفة في الفضاء الحقيقي. والجدير بالذكر، أن مثل هذه الحلول البديلة تتطلب خطوة محاذاة إضافية في الاتجاه البؤري (Z-محور)، والتي قد تنتج دورة الفتشوب مربكةLTS التي تتعارض مع فترات يزيل التباؤر المختار خلال جمع الصور، كما نوقش في DAHMEN وآخرون. 14. دمج المعلومات في التركيز، كما وردت في هذا البروتوكول، في الاستفادة من توليد صورة كما لو تم جمع البيانات باستخدام مواز، وبالتالي تجنب هذه الخطوة المواءمة إضافية في Z-الاتجاه.

وقد تم تطوير أساليب الميل من خلال سلسلة البؤرية لدراسة عينات سميكة (حوالي 1 ميكرون). القيد الرئيسي من هذه الأساليب هو أنها لا يمكن أن تستخدم لدراسة عينات أكثر سمكا من عدة ميكرون، لأن شعاع الالكترون لا يمكن أن تخترق هذه العينات. هذا التحديد يأتي من متوسط ​​المسار الحر من الإلكترونات، التي تعتمد على الجهد التسارع. على الرغم من ارتفاع الجهد (أي 1000 كيلو فولت) المجاهر الإلكترونية يمكن استخدامها جدا لتصوير الخلايا حقيقية النواة 30، وعينات سميكة جدا لا تزال تتطلب استخدام تقنيات أخرى، مثل focuseد شعاع أيون أو تسلسلي كتلة وجه مسح الإلكترون المجهري 31، 32. ومع ذلك، هذه الأساليب تولد إعادة البناء متباين الخواص التي يمكن أن تعتبر رزمة من الصور لأن المحور Z، والذي يعرف بأنه عمق القطع للأسلوب، وليس أي ما يعادل X- ومحاور Y-. هذه التقنيات لا يمكن أن تستخدم للدراسات عالية الدقة.

في عام 2014 وعام 2015، وذكرت ثلاث مواد الأصلية أساليب مختلفة للتصوير عينات سميكة 13 و 14 و 15. ومنذ ذلك الحين، استخدمت سوى عدد قليل من الدراسات على أي من هذه الأساليب لدراسة عينات سميكة 33. والتحسينات في أساليب تساعد على تعميم التصوير من خلال-تنسيق في STEM. ولا سيما في علوم الحياة، تحتاج الطرق من خلال البؤرية إلى أن يكون الأمثل لمراقبة العينات تحت ظروف المبردة. هذا يشكل تحديا كبيرا، حيث ان العينات المبردة هيحساسية خاصة إلى إلكترون جرعة، والأساليب من خلال التركيز تتطلب العديد من الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 121، التصوير المقطعي الإلكترون، المجهر الإلكتروني النافذ، عينة بيولوجية سميكة،
إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter