Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

Sedan början av 1970-talet närmar tomografi i transmissionselektronmikroskop (TEM) har använts i stor utsträckning för den strukturella karakterisering av biologiska prover 1, 2, 3. Attraktionskraften av transmissionselektron tomografi var att det kunde användas för att studera ett brett spektrum av biologiska strukturer på nanometerskala, från arkitekturen i cellerna och ultrastrukturen av organeller till strukturen av makromolekylära komplex och proteiner. Icke desto mindre skulle transmissionselektron tomografi inte användas för att studera mycket tjocka prover (större än 0,5 | j, m). Faktiskt, tjocka prover producerar för många spridda elektroner, som genererar låga signal-till-brusförhållande (SNR) bilder. Dessutom involverar tomografi insamling av bilder av tiltade exemplar, med den skenbara tjockleken hos provet ökar med snedställningsvinkeln. Även om kan filtreras inelastisk spridningmed användning av energifilter, är den kritiska mängden av elektroner som behövs för höga SNR-bilder lyckades nå i TEM. Därför har tjocka biologiska prover endast studerats med hjälp av snittning 4.

Vissa prover kan inte skivas: vissa kan försämras om de skärs, och andra behöver studeras i sin helhet för att förstå deras komplexitet. Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda TEM i skanningsläge 5, 6, 7, 8. I scanning transmissionselektronmikroskopi (STEM), är den optiska vägen för elektronerna annorlunda än i konventionella TEM. Elektroner som passerar genom provet utan spridning kan samlas på den optiska axeln med en ljusfält (BF) detektor 9, medan de spridda elastiskt kan hämtas på en viss vinkel från den optiska axeln med en mörkfält (DF) detektor.Den andra fördelen med STEM är att den fokuserade elektronstrålen skannas på ytan av provet, vilket gör att pixel-för-pixel samling av bilderna. Även om elektronstrålen breddar samtidigt som passerar genom provet 10, är detta särskilt insamlingssystem mindre känslig för oelastiskt spridda elektroner än konventionell TEM. Dessutom finns det inget objektiv efter förlagan i STEM, varigenom man undviker de kromatiska avvikelser som kan förekomma i TEM. Kameran Längden kan justeras så att BF detekterar huvudsakligen spritt elektroner. Använda DF detektorn att studera tjocka prover rekommenderas inte på grund av multipel spridning, vilket ger felaktiga bilder. Istället kan BF detektorn användas 11. Medan STEM kan producera höga SNR bilder, har det en relativt låg djup-of-field på grund av den relativt höga strålen konvergens jämfört med TEM, minska mängden ingående information som kan utvinnas ur tjockprover. I fallet med aberration-korrigerade STEM mikroskop, där konvergensvinkeln kan vara så hög som 30 mrad, kan djupet fält vara tillräckligt låg så att den information som är i fokus kommer från en fokalplan endast ett fåtal nanometer . Ställa in elektronstrålen parallellt läge förbättrar djupfält av elektronstrålen på bekostnad av upplösningen 12. Emellertid är denna installation inte alltid möjligt.

Närhelst det är nödvändigt att använda en konvergent elektronstråle, måste man använda tekniker som ökar djupet-of-field av elektronstrålen när man studerar tjocka prover. Nyligen genomförda studier har rapporterat att förvärva flera bilder på olika fokalplan hela provet för att återställa den maximala mängden i fokus information 13, 14. De två studier beskriver olika sätt att hantera information från olika fokalplan. Hovden et al.kombineras i Fourier rymden bilderna som samlades in vid olika fokalplan, och den slutliga rekonstruktionen erhölls direkt från 3D inversa fouriertransformen 13. I motsats härtill Dahmen et al. utvecklat en konvergent stråle rekonstruktion motorn rekonstruera i verkliga rymden 3D-volymen från olika fokalplan 14. Vårt laboratorium har också utvecklat en metod för avbildning av tjocka biologiska prover. Vår strategi var skiljer sig från de två metoder som beskrivs ovan genom att vi samman den information som är i fokus i de olika fokalplan och rekonstruerade den slutliga 3D-volymen i verkliga rymden med hjälp av en parallell stråle projektorn 15. Vårt mål var att utveckla en metod som lätt kan utföras i någon elektronmikroskopi laboratorium. För detta ändamål, som syftar vi att samla in kontaktbilder i en begränsad tid, jämförbar med tidsramen för konventionella tomografi experiment. Dessutom har våra föreslagna metoden could anpassas för användning med olika typer av anpassning och återuppbyggnad programvara.

Inom ramen för vår publikation från 2015 15, ville vi att visualisera och karakterisera återhämtning av djupet-of-field, så vi använde en stor konvergens halvvinkel på 25 mrad. Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för att utföra genom fokus avbildning i STEM enligt den metod som utvecklats i vårt laboratorium i 2015 15, och presenterar vi hur data från 2015 bearbetades. Denna metod återvinner i fokus information från flera fokalplan under en tjock (750 nm) biologiskt prov och möjliggör högkvalitativa 3D-rekonstruktioner. I förekommande fall, är skillnaderna i denna metod jämfört med de metoder som används av andra grupper också presenteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Varning: Se de säkerhetsdatablad (MSDS) för de olika reagenserna innan du använder dem. Flera av de kemikalier som används vid provberedningen är giftiga, cancerframkallande, mutagena och / eller reproduktionsstörande. Använd personlig skyddsutrustning (handskar, skyddsrock, full längd byxor, och sluten tå skor) och arbeta under ett dragskåp vid hantering av provet. Sektionering av provet med en ultramicrotome innebär användning av vassa instrument, och försiktig användning av dessa verktyg är obligatorisk. I de steg som beskrivs nedan, författarna antar att provet är en cellodlingsprov. Protokollet kan behöva modifieras i enlighet med den provtyp, särskilt de centrifugeringssteg.

1. Beredning av buffertar och blandningar

  1. Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, och 1,76 mM KH 2 PO 4).
  2. Bereds lösningar som innehåller 30%, 50% och 70% ethanol i PBS för prov uttorkning. Utför prov uttorkning genom att gradvis inkubering av provet i ökande etanolkoncentrationer.
  3. Förbereda epoxiharts genom blandning av bisfenol A (epiklorhydrin) (20 ml), dodecenyl-bärnstenssyraanhydrid (9 ml), metyl-5-norbornen-2,3-dikarboxylsyra (11 ml), och 2,4,6-tris ( dimetylaminometyl) fenol (0,7 ml); andra blandningsförhållanden kan användas beroende på den önskade hårdheten av hartset.
  4. Bereds lösningar som innehåller 30%, 50% och 70% epoxiharts i etanol för prov inbäddning. Utför harts inbäddning genom att gradvis inkubera provet med ökande hartskoncentrationer.
    OBS: Volymerna av de framställda lösningarna beror på vilken typ av prov som studeras. Fler lösningar behövs för vävnader än för cellkulturer.

2. Fixering och färgning av prov

  1. Centrifugera cellkulturen under 5 min vid 5000 x g. Utföra alla de följande centrifuge med samma villkor.
  2. Kassera supernatanten och fixera cellpelleten genom att återsuspendera det i PBS (1 ml) med 4% paraformaldehyd och 2% glutaraldehyd. Inkubera det vid rumstemperatur under 30 min (Figur 1A). Alternativt, fixera cellerna vid 4 ° C över natten eller under helgen.
  3. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och tvätta pelleten 3 gånger med PBS (1 ml) för att fullständigt avlägsna fixativet agenter.
  4. Post-fixera provet med 1% OSO4 i PBS (1 ml) under 30 min vid rumstemperatur.
  5. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och tvätta pelleten 3 gånger med PBS (1 ml) för att helt ta bort OSO4. Avaktivera OSO4 i olja och kassering.
  6. Lägg 2% uranylacetat i PBS (1 ml) som kontrastmedel och inkubera provet under 30 min vid rumstemperatur (Figur 1B).
  7. Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och tvätta pelleten 3 gånger med PBS (1 ml) för att avlägsna det obundna uranyl acetate; uranylacetat innehåller radioaktiva grundämnen och ska kasseras i en behållare avsedd för radioaktivt avfall.
    OBS: De inkubationstider kan modifieras i enlighet med storleken av provet. Till exempel, fixering och infärgning av tjockare prover, såsom vävnader prover, kräver längre inkubationstider. Längre inkubationstider kan också vara bättre för uttorkning och inbäddningsrestriktioner stegen. Uranylacetat kan ersättas med ett "uranyl-mindre" lösning som innehåller Gadolinium salter.

3. Prov Dehydrering

  1. Efter centrifugering, kasta supernatanten och inkubera provet under 30 min vid 4 ° C i PBS (1 ml) med 30% etanol (figur 1C).
  2. Upprepa steg 3,1 med hjälp av lösningar med successivt ökande etanolkoncentrationer (50%, 70%, och upp till 100%). Under dessa uttorkning steg, hålla provet vid 4 ° C för provbevarandeändamål.
  3. Efter centrifugering, kasta supernatant och suspendera pelleten i ren etanol (1 ml); inkubera över natten vid 4 ° C.

4. Harts Inbäddning

  1. Efter centrifugering, kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i etanol med 30% epoxiharts (1 ml) under 30 min vid RT (figur 1D).
  2. Upprepa steg 4,1 med hjälp av lösningar med successivt ökande epoxiharts koncentrationer (50%, 70%, och upp till 100%).
  3. Efter centrifugering, kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i ren epoxiharts (1 ml); inkubera över natten vid RT. Närvaron av härdning DMP-30 kan utlösa polymerisationen av hartset; om detta händer, förbereda två satser av epoxiharts, en med och en utan DMP-30.
  4. Efter centrifugering resuspendera pelleten i 200 mikroliter av rent epoxiharts (innehållande härdare) i en plastkapsel; provet bör vara i botten av plastkapsel.

5. Harts Polymerisation

  1. jagncubate plastkapsel innehållande provet i en inkubator inställd på 60 ° C under 48 h; andra typer av harts kan polymerisera med olika inställningar.
  2. Ta ut kassetten ur kuvösen och kontrollera att hartset har polymeriserat; hartset bör vara svårt om pressas mot en hård yta.
  3. Lägga rent epoxiharts (innehållande härdare) ovanpå det polymeriserade hartset som innehåller provet; detta extra lager av harts kommer att göra det lättare att skära provet. Inkubera kapseln vid 60 ° C under 48 h.

6. Prov Sektione

  1. Montera provet upp och ned i en provhållare så att provet är mot toppen och fixa det på trimnings block av ultramicrotome. Tätt låsa spaken för att fästa trim block till ultramicrotome.
  2. Med ett rakblad eller liknande skarp skärinstrument, skär ut plastkapseln att separera den från den polymeriserade hartset. Skär plasten så att provet är innehållaed i hartset i ungefär formen av en pyramid. Det finns ingen anledning att ta bort hela plastkapsel; bara ta bort den del som omfattar den polymeriserade provet.
  3. Ta kapseln och preparathållaren bort av trimnings blocket och installera dem på den rörliga armen i ultramicrotome.
  4. Installera en trimning kniv på knivblocket och korrekt trimma ansikten pyramiden. Användningen av kikare rekommenderas att ge en perfekt form till pyramiden; desto bättre pyramiden, desto bättre sektionerna kommer att bli.
  5. Ta bort trim kniv och ersätta den med en histologi kniv som kan användas för att skära sektioner som är tjockare än 0,5 pm.
  6. Efter fyllning av kyvetten enligt histologi kniv med rätt mängd vatten, ta med skärkanten av kniven till ytan av provet och använda kikare för att justera kapseln stigningsvinkel så att kniven kommer att skära vinkelrätt pyramiden.
  7. Justera skärhastigheten i enlighet med den önskadesnittjockleken att återvinna homogena delar.
  8. Låt avsnittet flyta över vattnet och fiska med en slinga.
  9. Flytta slingan mot en elektronmikroskopi koppargaller som har placerats ovanpå filterpapper.
    OBS: Nätet borde ha behandlats tidigare för att öka dess hydrofilicitet. Detta kan utföras med ett rutnät-beläggning penna.
  10. På grund av absorption vatten genom filterpappret, låt sektionen fastnar på gallret. Låt det torka i några minuter innan du sätter in den i elektronmikroskop.

7. Design av de genomgående fokus Tilt-serien

  1. Samla genombränn bilder på konstant fokus mellanrum.
    OBS: Genom focal tilt-serien består av en uppsättning av genomgående bränn bilder som samlas vid varje lutningsvinkel tilt-serien. Hela fokus amplitud bör vara tillräcklig för att täcka hela provtjockleken.
  2. Bestämma värdet på fokusintervallet. Om intervallet är lika med depth-of-field, samla hela provet i fokus; denna inställning representerar den högsta samplings möjligt. Om intervallet är större än djupet-of-field, kommer vissa delar av provet inte förvärvas i fokus, vilket innebär att vissa delar av provet inte kommer att samlas i fokus.
  3. Beräkna djupet-of-området för en elektronstråle från elektronlens våglängd och konvergensen halvvinkel av elektronstrålen. Medan våglängden för elektroner är direkt kopplad till accelerationsspänningen, använd konvergenshalv vinkel från elektronmikroskop tillverkaren eller bestämma den experimentellt från diffraktionsmönstret av en känd prov 16. Eftersom elektroner accelereras vid en våglängd λ träffa provet med en konvergenshalvvinkel α i ett elektronmikroskop, använd följande ekvation för att bestämma djupet-of-field (DOF):

    Ekvation
  4. Designbränn serien så att hela fokus amplitud kommer att täcka provet vid sin maximala sken tjocklek (dvs på sin högsta lutning).
    OBS: Ett 0,75 | j, m-tjockt prov kommer att ha en skenbar tjocklek av 2,19 | j, m vid en 70 ° lutning, så fokus amplituden bör vara större än 2,19 | im. För detta prov, om fokusintervallet bestäms ovan är lika med 50 nm, kommer det att krävas 44 bilder (2.19 pm / 50 nm) för att täcka provet vid sin maximala sken tjocklek. Hela fokus amplitud är lika med värdet av fokusintervallet multiplicerat med det antal fokala steg. Vid den högsta lutning (θ), provet uppenbara tjocklek definieras som följande:

    Ekvation

8. Prov Imaging

OBS: Det är utanför ramen för detta protokoll för att beskriva hur man ställer in ett elektronmikroskop i STEM läge; det mesta av denna information kan hittas in referensmanual från elektronmikroskop tillverkaren. Observera dock följande: i) plats storlek ska väljas i enlighet med den önskade förstoringen; ii) Ronchigram måste vara väl i linje; och iii) i BF läge, måste kameran längden justeras för att välja spritt elektroner med bibehållen god belysning av detektorn. Hartssektioner avsatta på elektronmikroskopi koppargaller bör belysas innan bildtagning för att förhindra krympning. Harts krympning och laddnings effekter kan förväxlas under bildtagning. Användningen av en objektiv bländar kan förbättra prov stabilitet när laddningen effekter uppstår. Men i det specifika fallet med STEM uppställningar, är målet öppningen inte är kompatibel med HAADF imaging läge, och mycket små objektiv öppningar är inte kompatibla med BF bildläget.

  1. Använda låg förstoring (cirka 20.000 i STEM), bläddra igenom provet och lokalisera regionen av intresse.
  2. justera than eucentric höjd (Z-axel), så att regionen av intresse inte glida iväg under rotation av provet.
  3. Kontrollera att syftet med intresse kommer att vara synlig i hela lutningsintervall.
  4. På grund av det stora antalet bilder som förvärvats under en genomgående fokus tilt-serien använder en automatisk insamling programvara. Antingen använda en kommersiell lösning eller designa en egen datainsamling programvara om så önskas. Se till att programmet kan utföra följande tre steg:
    1. Spåra och fokusera som i en vanlig ordning tilt-serien samling.
    2. Se till att de genomgående fokal bilderna överlappar varandra med Z-positionen av provet.
    3. Automatiskt förvärva en serie genomgående fokus bilder på varje lutningsvinkel.
  5. Ge programmet de viktigaste parametrarna för den genombränn tilt-serien (dvs fokala intervall, fokal steg, minsta lutningsvinkeln maximal lutningsvinkel, tilt steg, och scanningshastighet).
  6. Startbild insamlingen och vänta på programmet att avsluta.

9. Bildbehandling

OBS: I detta protokoll är det genomgående fokus tilt-serien bearbetning utförs med hjälp av ImageJ plugins 17. Kompletterande information 1 visar en ImageJ makro för inriktningssteget (Turboreg) och sammanslagning i-fokusinformation (Extended skärpedjup) för en genom-focal tilt-serien utformad med tre fokusvärden.

  1. Rikta in bilder som tas ut vid samma lutningsvinkel (dvs. genombränn bilder). Eftersom bilderna inte har samma fokus information de inte hyser samma funktioner för anpassning; utföra anpassningen genom att rikta in intilliggande bilder två och två (dvs efter en pyramidal hierarki, med de närmaste fokus först) genom att använda Turboreg 18, en ImageJ plugin.
  2. Konsekvent kontrollera inriktningen av genomgående fokala bilder vid varje tiltvinkel.Stapla inriktade genomgående bränn bilder för att förbättra visuell inspektion.
    OBS: Endast den zon som är i fokus ska flytta medan du surfar genom stapeln. Exakt inriktning är det viktigaste, eftersom det följande steget består av återvinning av den information som är i fokus från olika bilder.
  3. Sammanfoga den information som finns i fokus med Extended skärpedjup 19, en ImageJ plugin; Detta kommer så småningom att generera en enda bild från stapeln av bilder. Flera inställningar kan användas under djup-of-field återhämtning, men använder den högsta inställningarna för att bevara bildinformation.
    OBS: Lutningen-serien består nu av en enda bild per lutningsvinkeln, varje bild innehåller i-fokusinformation återvinns från genombränn bilder.
  4. Bearbeta data.
    OBS: Standardverktyg för uppriktning och rekonstruktion kan användas eftersom den data har nu reducerats till en standard tilt-serien. I detta protokoll är TomoJ ossed för dataanpassning och datarekonstruktion 20, 21. Mer detaljer om hur man använder TomoJ kan hittas i den ursprungliga publikationen 22.
  5. Utför fin justering av lutningen-serien.
    OBS: En bra strategi är att använda guld pärlor som referensmarkörer för att exakt spåra förändringar mellan bilderna. Lokala minima kan också användas om guld pärlor inte kan tillsättas till provet.
  6. Utför en 3D-rekonstruktion av den inriktade data; flera algoritmer finns tillgängliga för att utföra de rekonstruktioner i verkliga rymden eller Fourierrymden, var och en med fördelar och begränsningar.
  7. Om den slutliga anpassningen av lutningen-serien är dålig, göra vissa förbättringar genom att optimera de första stegen. Upprepa justerings steg om den slutliga 3D-rekonstruktion suddig eller deformeras; i praktiken, ju större antalet av insamlade fokalplan, desto bättre kontrast och detaljer om 3D-rekonstruktion.
    OBS: SeVeral mjukvaruprogram kan användas för att behandla de genomgående fokal tilt-serien. Emellertid var de verktyg som används i detta protokoll valdes eftersom, enligt vår erfarenhet, utförde de bästa. Turboreg 18 bättre resultat när det gäller att anpassa bilderna när en gradient av fokus var närvarande. Mer information kan hittas på särskild webbplats 23. Den utökade skärpedjup plugin 19 utförs mycket väl när det gäller att få tillbaka i fokus information från olika bilder, medan andra verktyg resulterade i synliga pixlar ändringar. Mer information, särskilt när det gäller manusförfattande, kan hittas på denna särskilda webbplats 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vår studie var elektroner accelereras till 200 kV i fältemission pistolen transmissionselektronmikroskop. Bilder samlades i STEM BF läge med en 20-us uppehållstid. När det gäller utformningen av de genomgående fokus tilt-serien, fann vi att fokusintervall av 150 nm gav tillfredsställande resultat för ultra studie av en 750 nm tjock biologiskt prov, även om djupfält av elektronstrålen var bara 3 nm-eftersom vi använde en mycket stor konvergenshalvvinkel på 25 mrad.

Provet analyseras i denna rapport är Trypanosoma brucei, en encellig eukaryot vars flagellum är intensivt studerat eftersom denna organell är anmärkningsvärt bevaras från protister till däggdjur 25. Celler behandlades som presenteras i provberedningsprotokollet, och vi fokuserat strukturanalys på flagellar ficka T. brucei ( (Figur 2B, C och D). På de insamlade bilderna, den zon som är i fokus visas tunn, och de flesta av bilden är suddig på grund av begränsat djup-of-field. Sammanslagningen av i-fokusinformation utförs på de insamlade bilderna och ger en enda bild, där in-fokusområdet är mycket större (figur 2E).

Sammanslagningen av fokus information kan bättre visualiseras genom att markera de höga frekvensområden av de genomgående fokus tilt-serien bilder (vita pixlar i figur 2F, G och H). ImageJ kommandot "Hitta konturer" var ossed i föreliggande studie. Detta kommando använder en Sobel filter för att upptäcka förändringar i grann pixelintensiteter. Förskjutningen av den detekterade högfrekventa området kan observeras från en bild till en annan. På bilden där i fokus information har slagits samman, de höga frekvenserna spänner mest av bilden (Figur 2I). Denna metod medger kontroll av god behandling av de genomgående fokus tilt-serien.

Använda genom focal tilt-serien är extra i fokus information som samlas in och används under 3D återuppbyggnadsprocessen. Detta ger större kontrast och SNR och minskar oskärpa effekter som observerats i 3D rekonstruktioner av djup fältbegränsade bilder 15. I Fourier utrymme är extra information som återvinns jämfört med en klassisk system tilt-serien samling, där endast på fokalplanet samlas 13. Sammantaget kvaliteten i hela 3D rekonstruktion är mer isotropisk jämfört med en klassisk system tilt-serien samling.

Figur 1
Figur 1: Bilder som presenterar de olika stegen i det biologiska provberedning protokoll. Provberedningsprotokoll kan delas in i fyra elnätet steg. Provet A) fixerades i paraformaldehyd och glutaraldehyd, B) efterfixerade i osmiumtetroxid och kontrasterade med uranylacetat, C) dehydratiserades i etanol, och D) inbäddade i harts. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Kontroll av djupet fält återhämtning. kan verifieras Återhämtningen av djupet-of-field på bilder av en lutande exemplar. A) Vid 0 ° lutning, kan observeras flera detaljer i flagellar fickan (Flag ficka) för hartset inbäddade T. brucei cell. Den flagellar fickan ligger i cytoplasman (Cyt), och den basala kroppen (BB) förankrar flagellen (Flag) till flagellar membranet. B, C, och D) Tre bilder av samma flagellära ficka, lutas på 70 ° i elektronmikroskop, förvärvades. De samlades med fokusintervall på 300 nm. E) Den här bilden genererades av den utökade skärpedjup ImageJ plugin och innehåller i fokus information B, C och D. F, G, H och I) Dessa bilder beräknades med "Hitta konturer" kommando i ImageJ för att highlight informationen högfrekvent som finns i B, C, D och E, respektive. Vita pixlar representerar höga frekvenser, vilket motsvarar i-fokusinformation. Skalan bar är 250 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I den här artikeln presenterar vi en konventionell provberedning protokoll tillsammans med en steg-för-steg guide för att utföra 3D analys på tjocka biologiska prover med hjälp STEM genom fokus tomografi. Harts inbäddning av biologiska prover har använts i årtionden 26, och alternativa metoder som anpassas till olika typer av prover kan hittas i hela litteraturen 27. Däremot imaging tjocka exemplar i STEM använder genomgående fokus metoder ett nytt företag, och metoderna kommer sannolikt att förbättras, eftersom det blir allt vanligare.

Syftet med detta arbete var att beskriva en provberedning protokoll och närmare bestämt avbildningsbetingelser för att utföra genom focal tilt-serien förvärv i STEM med utrustning som finns för närvarande och i en rimlig tid. Av denna anledning har stora fokusintervall som används. I själva verket finns det ingen enighet om hur närafokalplan bör vara för avbildning en tjock prov med STEM för genom focal tilt-serien. Det tar vanligtvis upp till flera sekunder att samla STEM bilder, och en hel konventionell tilt-serien kan ta timmar att slutföra. Som ett proof-of-concept, är det möjligt att samla hundratals eller tusentals bilder. Det är dock tydligt att långa insamlings gånger inte är lämpade för dagligt bruk. Beam stabilitet och provdriften måste beaktas när man utformar så långa experiment. Vidare, långa insamlings gånger upp frågan om ackumulerade elektrondosen. Således, för närvarande, STEM genom focal tilt-serien är endast lämplig för studier av balkresistenta prover, såsom harts inbäddade biologiska prover eller oorganiska material, främst på grund av den stora elektron dos som krävs. På grund av den kompromiss mellan förvärvstiden och kvaliteten på slut 3D-rekonstruktion, rekommenderar vi att du använder några genomgående bränn mellanrum i projekt där det inte krävs hög upplösning, ennd vi rekommenderar att du använder en större mängd genomgående brännintervall i projekt där det krävs hög upplösning.

Det finns en brist på enighet om de specifika stegen i denna metod på grund av dess nyhet. Det är emellertid uppenbart att flera steg är kritiska för högkvalitativa rekonstruktioner från spindeln genom-fokal tilt-serien datamängder. Först måste inriktningen av de viktigaste bilderna vid varje lutningsvinkeln noga exekveras, såsom påpekats i de tre ursprungliga artiklar som beskriver genom fokus bildsamling 13, 14, 15. Även om bilder som samlats in vid olika bränn värden inte delar gemensam information förblir Turboreg en bra lösning för noggrann, automatisk justering av bilder. För det andra, en sammanslagning av de viktigaste bilderna, som utförs i detta protokoll, har fördelen att generera en enda bild per lutningsvinkeln, som lätt hanteras av någon tilt-serien alignning och 3D-rekonstruktion program. Den utökade skärpedjup plug-in ursprungligen avsedd för ljusmikroskop bilder; ändå, verkar det vara den bästa lösningen för en sammanslagning av fokusinformation från elektronmikrofotografier 28. En alternativ lösning är att betrakta hela uppsättningen av bilder som en enda lutning-serien dataset med flera bilder per lutningsvinkeln, på liknande sätt som vad som gjordes av Hovden et al. 13 och Dahmen et al. 14. Detta kräver användning av Fourier-baserade rekonstruktionsalgoritmer 13 eller Ettention, som utvecklats av Dahmen et al. 29 och som är den enda 3D-rekonstruktion programvara som kan rekonstruera 3D volymer från bilder som samlats på olika fokus värden i realtid utrymme. Noterbart är att sådana alternativa lösningar kräver en extra inriktnings steg i fokus riktning (Z-axel), vilket kan producera förvirrande Results som är oförenliga med oskärpa intervall som valts under bildsamling, som diskuteras i Dahmen et al. 14. Sammanslagningen av fokus information som presenteras i detta protokoll, har fördelen att generera en bild som om uppgifterna samlades in med hjälp av en parallell, och därmed undvika denna extra inriktnings steg i Z-riktningen.

Genom-focal tilt-serien metoder har utvecklats för att studera tjocka prover (ca 1 mikrometer). Den största begränsningen av dessa metoder är att de inte kan användas för att studera prover tjockare än flera mikron, eftersom elektronstrålen inte kan tränga sådana prover. Denna begränsning kommer från den genomsnittliga fria banan av elektronerna, som är beroende av accelerationsspänningen. Även om mycket hög spänning (dvs., 1000 kV) elektronmikroskop kan användas för avbildning av eukaryota celler 30, mycket tjocka prover kräver fortfarande användning av andra tekniker, såsom focused jonstråle eller serieblock ansikte svepelektronmikroskopi 31, 32. Men dessa metoder genererar anisotropa rekonstruktioner som kan anses högar av bilder eftersom Z-axeln, som definieras som skärdjup av metoden, är inte likvärdigt med X- och Y-axlarna. Dessa tekniker kan inte användas för högupplösta studier.

År 2014 och 2015 rapporterade tre originalartiklar olika metoder för avbildning tjocka prover 13, 14, 15. Sedan dess har endast ett fåtal studier använt någon av dessa metoder för att studera tjocka prover 33. Förbättringar i metoder kommer att bidra till att generalisera genom fokus avbildning i STEM. Särskilt i biovetenskap, genomgående brännmetoder behöver optimeras för att observera prov under kryogeniska förhållanden. Detta är en stor utmaning, eftersom kryogeniska proversärskilt känsliga för elektron dosering, och genom fokus metoder kräver många bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).

Tags

Cellulär Biology elektron tomografi skanning transmissionselektronmikroskopi tjocka biologiskt prov, Djup-of-field genom focal tilt-serien
Beredning och övervakning av Thick Biologiska Prover av Scanning transmissionselektronmikroskopi Tomography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter