Biology

准备厚生物样品的观察扫描透射电子断层扫描

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215

Sylvain Trépout¹, Philippe Bastin², Sergio Marco¹

¹Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, ²Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

自从70年代初，断层扫描透射电子显微镜（TEM）已被广泛地用于生物标本^{^{^{^{^1，2，3}}}}的结构表征方法。透射电子断层扫描的吸引力是，它可用于在纳米尺度，研究了广泛的生物结构的，从细胞的结构和细胞器的大分子复合物和蛋白质的结构的超微结构。然而，透射电子断层扫描不能用来研究非常厚的样品（大于0.5微米）。的确，厚的样品产生太多的散射电子，产生低信噪比（SNR）的图像。另外，断层摄影涉及倾斜标本的图像的集合，将样品与倾斜角度增加的表观厚度。即使非弹性散射可以被过滤出用能过滤器，需要的高信噪比图像电子的临界量在TEM是勉强达到。因此，厚的生物标本只用了⁴切片研究。

有些样品不能被切片：它们被切割时一些可能会降低，和其他需要的全部进行研究，以了解它们的复杂性。另一种方法是在扫描模式^{^{^{^{^{^{^{5，6，7，8}}}}}}}使用的TEM。在扫描透射电子显微镜（STEM），电子的光路是与在常规的TEM不同。流过试样而不散射电子可以与亮场（BF）检测器⁹的光轴被收集，而那些弹性散射可以在从与暗场（DF）检测器的光轴以一定角度被收集。干的另一优点是，聚焦的电子束在所述样品的表面扫描，从而使该像素由像素集合的图像。即使通过样品^10，而电子束变宽，这种特殊的收集方案是非弹性散射电子的比常规的TEM不太敏感。此外，不存在后透镜试样在STEM，从而避免可能发生在TEM色差。相机长度可以调整，以使高炉检测器主要检测未散射电子。使用DF探测器研究厚的样品不建议，因为多次散射，从而产生不准确的图像。取而代之的是，高炉检测器可以用来^11。而干可以产生高信噪比的图像，其具有因为相比TEM相对高的电子束会聚的相对低的深度的领域中，降低，可以从厚要回收的的深入信息量标本。在像差校正STEM显微镜，其中该会聚角可高达30兆拉德的情况下，使得即在焦点中的信息，从只有几纳米的焦平面起源的深度的领域可以是足够低。设置在并行模式下的电子束增强了深度的领域的电子束的决议¹²的损害。然而，这种设置并不总是可能的。

每当有必要使用一个会聚电子束，人们必须使用学习厚样品时，可增强深度的领域的电子束的技术。最近的研究已经报道了采集在不同焦平面多个图像的整个样品回收的在焦信息^{^{^13，14}}的最大量。两项研究描述不同的方式来处理来自不同的焦平面的信息。 Hovden 等。结合在傅立叶空间中被收集在不同的焦平面的图像，并且直接从3D逆傅立叶获得的最终重建变换^13。与此相反，达门等。开发出会聚光束重建引擎在现实空间重构来自各种焦平面¹⁴中的3D体积。我们的实验室还开发了厚成像生物标本的方法。我们的策略是从在上述两种方法的不同，我们合并是在聚焦在各焦平面中的信息，并使用平行光束投影¹⁵重构了最终的3D体积在现实空间。我们的目的是开发，可以很容易在任何电子显微镜实验室中进行的方法。为此，我们的目的是收集焦点图像的时间也是有限的，与常规断层实验的时间框架。此外，我们提出的方法C乌尔德适于与不同类型的对齐和重建软件的使用。

在本刊从2015年¹⁵的背景下，我们想可视化和表征景深-的恢复，所以我们用25毫弧度大收敛半的角度。在这里，我们提出了一个一步一步的协议根据我们的实验室在2015年¹⁵开发的方法在STEM通过焦成像表现，以及我们提出从2015年数据是如何处理。这种方法恢复整个厚（750 nm）的生物样品中，重点从几个焦点平面信息，使高品质的3D重建。如果相关的，在这种方法与其他团体使用的方法的差异还提出。

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Protocol

注意：使用前请咨询各种试剂的材料安全数据表（MSDS）。几个样品制备过程中使用的化学品是有毒的，致癌，致突变，和/或生殖毒性。在处理样品使用个人防护装备（手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）和工作在通风橱内。切片与超微样本涉及使用锋利的仪器，并谨慎使用这些工具是强制性的。在下面描述的步骤中，作者认为样品是细胞培养物的样品。该协议可能需要根据样品类型，尤其是离心步骤进行修改。

1.缓冲器和混合物的制备

制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（137毫摩尔NaCl，2.7毫米氯化钾，10毫_的 Na ₂ HPO _4，和1.76毫摩尔KH ₂ PO _4）。
制备含有30％，50％，70％等的解决方案hanol在PBS样品脱水。通过逐步培养在增加乙醇浓度样品进行样品脱水。
通过混合双酚A-（表氯醇）（20毫升），十二碳烯基琥珀酸酐（9毫升），甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸（11毫升）和2,4,6-三制备环氧树脂（二甲基氨基甲基）苯酚（0.7毫升）;其它混合比率可根据树脂的所需的硬度使用。
制备含有30％，50％，和70％的环氧树脂在乙醇中样本嵌入的解决方案。逐渐培养随着树脂浓度的样品进行树脂嵌入。
注：制备的溶液的体积取决于所研究的样品的类型。所需的组织比细胞培养更多的解决方案。

2.固定与染色样品

离心细胞培养5分钟，在5000×g的。执行所有使用相同的条件下离心的。
弃去上清液，并通过与4％多聚甲醛和2％戊二醛再悬浮它于PBS（1mL）中固定细胞沉淀。在室温下30分钟（ 图1A）孵育它。可替代地，固定于4℃将细胞过夜或过周末。
离心后，除去上清，用PBS（1mL）中洗涤沉淀3次，以完全除去固定液剂。
用1％OSO ₄于PBS（1mL）中，在室温下30分钟后的固定样品。
离心后，除去上清，用PBS（1mL）中洗涤沉淀3次，以完全除去OSO _4。停用OSO ₄石油和丢弃。
于PBS（1mL）中添加2％醋酸双氧铀作为造影剂和孵化的样品在室温下（ 图1B）30分钟。
离心后，除去上清，用PBS（1mL）中洗涤沉淀3次以去除未结合的双氧铀的交流etate;醋酸铀中含有放射性元素，并应致力于放射性废物箱进行处理。
注：孵育时间可根据样品的大小进行修改。例如，固定和较厚的样品，如组织样品染色，需要较长的温育时间。较长的孵育时间还可以是用于脱水和嵌入步骤更好。醋酸铀可以通过包含钆盐一“铀少”的解决方案来代替。

3.样品脱水

离心后，弃去上清，在含有30％乙醇4℃在PBS（1mL）中（ 图1C）孵育样品30分钟。
重复步骤3.1采用的解决方案与逐渐增加的乙醇浓度（50％，70％，和最多100％）。在这些脱水步骤中，保持在4℃样品保存目的样品。
离心后，弃去supernat蚂蚁和悬浮在纯乙醇（1mL）中的小球;在4℃孵育过夜。

4.树脂嵌入

离心后，弃去上清，重悬，用30％的环氧树脂（1毫升）在乙醇中沉淀，在室温（ 图1D）30分钟。
重复步骤4.1采用的解决方案与逐渐增加的环氧树脂浓度（50％，70％，和最多100％）。
离心后，弃去上清，重悬在纯环氧树脂（1mL）中的小球;在室温孵育过夜。硬化DMP-30可能引发树脂的聚合的存在;如果发生这种情况，准备环氧树脂两批，其中一个和一个没有DMP-30。
离心后，悬浮在纯环氧树脂的200微升（含硬化剂）在塑料胶囊中的小球;样品应在塑料胶囊的底部。

5.树脂聚合

一世ncubate含有48小时设定为60℃的培养箱样品塑料胶囊;其他种类的树脂可能会使用不同的设置聚合。
从孵化器中取出胶囊并验证树脂聚合;如果按压硬表面的树脂要硬。
加在包含样品的聚合树脂的顶（含硬化剂）纯的环氧树脂;树脂的这种额外的层将使它更容易切割样品。孵育在60℃的胶囊48小时。

6.样品切片

安装在试样保持器样品倒置，使样品朝向顶部并修复它的超薄切片的修剪块上。紧紧锁定杆修剪块固定在超薄。
用刀片或类似的锋利切割器械，切出的塑料胶囊将其从聚合树脂分离。切割树脂，使所述样品是包含版在树脂在金字塔的大致形状。没有必要删除整个塑料胶囊;只能去除覆盖在聚合样品的部分。
取的胶囊和试样保持关闭修剪块的和对超微的移动臂安装它们。
刀块上安装一个修边刀，准确地修剪金字塔的面孔。使用双筒望远镜的建议给完美的体形金字塔;金字塔越好，越好的章节会。
脱下修边刀并用，可用于切割是厚度大于0.5微米的部分组织学刀替换它。
填充所述组织学刀与水的正确量的反应杯后，使刀的切割边缘到样品的表面上，并使用望远镜来调整胶囊型桨距角，使得刀将垂直切片的金字塔。
根据所希望的调整切割速度截面厚度恢复均匀部分。
让部浮在水中，并用一个循环鱼它。
走向已放置在滤纸的顶部的电子显微镜铜网环路。
注意：网格应该已经处理以前，以增加其亲水性。这可以用一个网格涂布笔来执行。
由于通过滤纸吸水率，让部分粘到电网。让它将其插入到电子显微镜前干燥几分钟。

7.通过焦点倾斜系列的设计

聚集在持续关注的时间间隔，通过焦图像。
注：通过焦点倾斜系列由一组通过焦图像被在倾斜系列的每个倾斜角度收集。整焦点振幅应足以覆盖整个样品厚度。
确定聚焦间隔的值。如果该间隔等于对dEPTH的场，收集在焦点整个样本;这个设置代表了最高采样可能。如果该间隔比场深度的更大，样品的某些部分将不会在焦点获取，这意味着样品的某些部分将不会在焦点被收集。
计算深度的领域，从电子的波长的电子束和电子束的会聚半角的。而电子的波长直接相关的加速电压，可使用通过电子显微镜的制造商提供的收敛半角度或从已知试样¹⁶的衍射图案实验确定它。因为电子在波长λ加速击中α的会聚半角样品中的电子显微镜，可使用以下公式来确定深度的领域（DOF）：
设计焦点系列，使整个焦点振幅将覆盖在其最大表观厚度的样品（即在其最高的倾斜）。
注：0.75微米厚的样品将具有2.19微米的表观厚度在70°倾斜，所以重点振幅应该大于2.19微米。对于此示例，如果上述确定的焦点间隔等于50纳米，这将需要44图（2.19微米/ 50纳米）以覆盖在其最大表观厚度的样品。整焦点幅度等于焦点时间间隔乘以焦步骤的数目的值。在最高倾斜（θ），将样品表观厚度被定义为以下：

8.样品成像

注：这已经超出了协议的范围来描述如何设置在STEM模式电子显微镜;大部分信息都可以找到我n中的参考手册由电子显微镜的制造商提供的。然而，注意以下几点：i）该点尺寸应根据所希望的倍率进行选择; ii）该Ronchigram必须很好对齐;和iii）中的BF模式下，相机长度必须被调节以选择未散射电子，同时保持检测器的良好的照明。沉积在电子显微镜铜网上树脂切片应该图像采集前被点亮，以防止收缩。树脂收缩和充电的影响可能会在图像采集过程羞愧。发生充电效果时，使用一个客观的镜头光圈可以改善样品的稳定性。然而，在STEM设置的特定情况下，目标孔不与HAADF成像模式兼容，和非常小的目标孔是不与高炉成像模式兼容。

使用低倍率（约20000倍在STEM），浏览通过样品和定位感兴趣的区域。
调整Ť他eucentric高度（Z轴），从而使在旋转样品的感兴趣的区域不漂移距离。
验证感兴趣的对象将在整个倾斜范围仍然可见。
因为通过焦倾斜系列中获取的图像的大量的，使用自动收集软件。无论是使用商业解决方案，或者如果需要设计一个自定义的数据采集软件。确保软件程序能够执行以下三个步骤：
1. 跟踪和集中在一个标准的倾斜系列采集方案。
2. 确保通过焦点的图像与样品的Z位置重叠。
3. 自动获取在每个倾斜角一系列通过焦图像。
给软件程序的通过焦点倾斜系列的主要参数（即，焦间隔，焦步骤，最小倾斜角度，最大倾斜角，倾斜步骤，和扫描速度）。
开始图像采集处理，并等待软件程序来完成。

9.图像处理

注意：在这个协议中，使用ImageJ插件¹⁷进行通焦倾斜的一系列处理。补充数据1示出了用于对准步骤（Turboreg）和用于为通过焦点倾斜系列设计有三个焦点值合并的聚焦信息（扩展景深）的ImageJ的宏。

对齐在同一倾斜角（即，通焦图像）中收集的图像。由于图像不具有相同的对焦信息，他们不怀有对准相同的特性;通过调整相邻图像两两执行校准（即下一个金字塔形的层次结构，与最接近的焦点值第一）使用Turboreg ^18，一个ImageJ的插件。
在每个倾斜角度一致验证通过焦点的图像的对准。堆栈对齐通过焦点影像以改善目视检查。
注：只有该区域是焦点，而应该通过堆栈浏览移动。准确的定位是最重要的事情，因为下面的步骤包括的是将重点从不同的图像信息的恢复。
合并使用字段^19，ImageJ的插件扩展深度是焦点中的信息;这将最终生成的图像的堆叠的单个图像。数设置可以深度的场的恢复过程中被使用，但使用最高设置保存的图像信息。
注意：倾斜系列现由每倾斜角的单个图像的，从通焦图像中回收含在焦信息的每个图像。
处理数据。
注意：用于对齐和重建标准工具可以使用，因为数据现在已经被减少到一个标准的倾斜系列。在这个协议中，TomoJ是我们ED数据比对和数据重建^{^{^20,21。}}可以在原始出版物²²中找到有关如何使用TomoJ更多细节。
执行倾斜系列精细对准。
注意：一个好的策略是用黄金珠基准标记准确地跟踪图像之间变化。也可以使用局部极小如果金珠不能被添加到样品中。
执行对齐数据的三维重建;几种算法可供在实空间或傅立叶空间中，每个与优点和局限性进行重建。
如果倾斜系列的最后对准差，通过优化的初始步骤做一些改进。重申对准步骤，如果最终的三维重建显示模糊或变形;在实践中，收集的焦平面的数量越多，对比度和三维重建的细节就越好。
注：硒veral软件程序可以用来处理通过焦点倾斜系列。因为然而，在该协议中使用的工具被选择，根据我们的经验，他们表现最好。 Turboreg ¹⁸在调整图像时的焦点梯度存在方面表现较好。更多信息可在专用网站²³上找到。现场插件¹⁹的扩展深度收回来自不同的图像对焦信息方面表现非常出色，而其他工具造成可见像素修改。更多的信息，尤其是关于剧本创作，可以在这个专用网站²⁴上找到。

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Representative Results

在我们的研究中，电子被加速到在所述场发射枪透射电镜200千伏。图像用一个20微秒的停留时间收集在STEM BF模式。关于通过焦点倾斜系列的设计中，我们发现的150焦点间隔处产生令人满意的结果的750纳米厚的生物，即使样品虽然电子束的深度的领域只是超微结构的研究3纳米，因为我们使用了25毫弧度非常大的收敛半的角度。

本报告中所分析的样品是布氏锥虫 ，单细胞真核生物，其鞭毛被深入研究，因为这种细胞器显着地从原生生物保守哺乳动物^25。细胞被视为在样品制备协议提出，我们专注于结构分析布氏锥虫的鞭毛口袋（图2B，C和D）。所收集的图像，即在焦点区域出现细，而大部分的图像是因为有限的深度的场的模糊。是对采集到的图像进行的对焦信息合并，并产生一个单一的图象，其中，在聚焦区域是宽得多（ 图2E）。

的对焦信息合并可以通过突出通过焦倾斜序列图像的高频区域（白象素在图2F，G和H）可更好地可视化。该ImageJ的命令“查找边缘”是我们编在本研究中。该命令使用Sobel滤波器检测相邻像素强度的变化。所检测到的高频区域的位移可以从一个图象被观察到的其他。上，其中在焦信息已被合并的图像中，高频率跨越大部分图像（ 图2I）的。这种方法允许通过焦点倾斜系列的良好的加工进行验证。

使用通过焦倾斜系列，额外的聚焦信息被收集并在3D重建过程中使用。这将产生更高的对比度和信噪比，并减少在深度的场有限图像¹⁵的三维重建所观察到的模糊效应。在傅立叶空间中，额外的信息进行比较的经典倾斜系列采集方案，其中仅在聚焦平面上收集¹³回收。总体而言，在整个3质量相比经典的倾斜系列采集方案三维重建更各向同性的。

图1： 图像呈现所述生物样品制备的协议的不同步骤。样品制备协议可分为四个主要步骤。将样品固定在多聚甲醛和戊二醛A），B）后固定在四氧化锇和醋酸铀，C），在乙醇中脱水对比，和D）埋入树脂。请点击此处查看该图的放大版本。

深度的场复苏的验证。的深度的领域的回收可以在一个倾斜的样品的图像进行验证。 A）在0°倾斜，几个细节可以在树脂嵌入式布氏锥虫细胞的鞭毛袋（标志袋）进行观察。鞭毛口袋位于细胞质（细胞色素），和所述基底主体（BB）锚的鞭毛（标志）的鞭毛膜。 B，C和D）相同的鞭毛口袋，在该电子显微镜70°倾斜的三个图像，被收购。它们与为300nm焦点间隔收集。 E）是由现场的ImageJ插件的扩展深度生成此形象和含有B，C的对焦信息，和D F，G，H，I等）这些图像计算的“查找边缘”命令ImageJ的以highl飞行载于B，C，D和E，分别在高频率的信息。白色象素代表高的频率，对应于在焦信息。比例尺为250nm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1. 请点击这里下载此文件。

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Discussion

在这篇文章中，我们提出了一个常规的样品制备协议与一步一步的指导使用STEM通过焦点断层扫描厚的生物样品进行三维分析一起。生物标本的树脂嵌入已使用了几十年^26，和适于不同种类的样品替代协议可以在整个文献²⁷中找到。与此相反，成像厚的样品在STEM使用通过焦方法是一种新的任务，并当它变得更普遍的方法将最有可能得到改善。

这项工作的目的是描述一个样品制备协议，并且更具体地，通过焦点在STEM倾斜系列采集的设备当前可用，并在合理的时间量进行摄像条件。出于这个原因，使用大焦点的间隔。事实上，这是毫无共识如何关闭焦平面应该是成像厚的样品与STEM通过焦点倾斜系列。它通常需要高达几秒钟以收集STEM图像，并且整个传统的倾斜系列可能需要数小时来完成。作为验证的概念，它是可以收集数百甚至数千图像。但是，很显然，长的收集时间不适合日常使用。光束稳定性和样品的漂移必须设计这种长实验时加以考虑。此外，长的收集时间提高累积剂量电子的问题。因此，其时，STEM通过焦倾斜系列只适合耐束样本，例如树脂包埋的生物样品或无机材料的研究，主要是因为需要大量的电子剂量。由于采集时间和最终的三维重建质量之间的权衡，我们建议使用的项目很少通过焦点间隔在不需要很高的分辨率，第二，我们建议在需要高分辨率的项目中使用的通焦间隔的更大数量。

有缺乏关于这个方法，因为它的新颖性的具体步骤的共识。然而，很明显，一些步骤是为高质量重建临界从STEM通过焦倾斜系列数据集。首先，焦点的图像中的各倾斜角的取向需要仔细执行，如在通过焦图像采集^{^{^{^{^{13，14，15，}}}}}描述三个原始文章指出。即使在不同的焦距值采集到的图像不共享公共信息，Turboreg仍然是图像的准确，自动对准一个很好的解决方案。第二，焦点的图像的合并，如在该协议进行的，具有产生每倾斜角的单个图像，这是很容易通过任何倾斜系列对齐处理的优点换货及三维重建软件程序。现场插件的扩展深度最初专为光学显微镜图像;尽管如此，这似乎是用于合并从电子显微照片²⁸在焦信息的最佳解决方案。一种替代的解决方案是考虑整个组图像作为一个单一的倾斜系列数据集，每个倾斜角几个图像，类似于什么被Hovden 等人所做的。 ¹³和达门等。 ^14。这需要使用的基于傅立叶重建算法¹³或Ettention，这是由达门等人开发的。 ²⁹并且是可以从在实空间中的各种焦距值采集到的图像重建3D体积唯一三维重建的软件。值得注意的是，这种替代解决方案将在必要的焦点方向（Z轴）的额外对准步骤，这可能会产生混乱的地区环境部门一道LTS是与图像采集过程中选择的散焦间隔不一致，如达门等进行讨论。 ^14。的对焦信息合并，如在该协议提出，具有与如果数据使用并行收集，从而避免在Z方向这额外对准步骤生成图像的优点。

通过焦倾斜系列的方法已被开发，研究厚样品（大约1微米）。这些方法的主要限制是，它们不能被用于研究的样品比几微米厚，由于电子束不能穿透这种样品。这一限制来自电子的平均自由路径，这是依赖于加速度的电压。即使非常高电压（即，1000千伏）电子显微镜可以用于成像真核细胞^30，非常厚的样品仍然需要使用的其他技术，诸如focuseð离子束或串行块面部扫描电子显微镜^{^{^31,32。}}然而，这些方法产生可被认为是图像的堆叠，因为Z轴，其被定义为所述方法的切割深度，不等同于X轴和Y轴的各向异性重建。这些技术不能被用于高分辨率研究。

2014年和2015年，三名原创文章报道了成像厚的样品^{^{^{^{^13，14，15}}}}种不同^的方法。自那时以来，只有少数研究使用上述任何一种方法来研究厚样品^33。在方法的改进将有助于STEM来概括通过焦成像。特别是在生命科学，通过焦方法需要在低温条件下观察样品进行优化。这是一个重大的挑战，因为低温的样品是特别敏感于电子剂量，并通过焦方法需要很多图像。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS