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Biology

तैयारी और मोटी जैविक नमूने का अवलोकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी ट्रांसमिशन द्वारा

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

1970 के दशक के बाद से, टोमोग्राफी संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) व्यापक रूप से जैविक नमूनों 1, 2, 3 की संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है में दृष्टिकोण। संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी की अपील है कि यह कोशिकाओं की वास्तुकला और macromolecular परिसर और प्रोटीन की संरचना करने के लिए अंगों की फैटी से nanometer पैमाने पर जैविक संरचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था। फिर भी, संचरण इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी बहुत मोटी नमूने (अधिक से अधिक 0.5 माइक्रोन) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। दरअसल, मोटी नमूनों भी कई बिखर इलेक्ट्रॉनों का उत्पादन, कम संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) छवियों पैदा होता है। इसके अलावा, टोमोग्राफी नमूना झुकाव कोण के साथ बढ़ के स्पष्ट मोटाई के साथ, झुका नमूनों की छवियों का संग्रह शामिल है। हालांकि स्थिर बिखरने फ़िल्टर किया जा सकताऊर्जा फिल्टर का उपयोग कर बाहर, उच्च SNR छवियों के लिए आवश्यक इलेक्ट्रॉनों की आलोचना की राशि मात्र मंदिर में पहुँच जाता है। इसलिए, मोटी जैविक नमूनों केवल सेक्शनिंग 4 का उपयोग कर अध्ययन किया गया है।

कुछ नमूने कटा हुआ नहीं किया जा सकता: कुछ जब वे काट रहे हैं नीचा हो सकता है, और दूसरों के क्रम में उनकी जटिलता को समझने के लिए अपनी संपूर्णता में अध्ययन किया जा करने की जरूरत है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण स्कैनिंग मोड 5, 6, 7, 8 में मंदिर का प्रयोग है। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (स्टेम) स्कैनिंग में, इलेक्ट्रॉनों की ऑप्टिकल पथ कि पारंपरिक मंदिर में से अलग है। इलेक्ट्रॉनों बिखरने के बिना नमूना के माध्यम से गुजर रहा है, एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) डिटेक्टर 9 के साथ ऑप्टिकल अक्ष पर एकत्र किया जा सकता लचीलेपन से बिखरे हुए उन एक काले क्षेत्र (डीएफ) डिटेक्टर के साथ ऑप्टिकल धुरी से एक खास कोण पर एकत्र किया जा सकता है, जबकि।स्टेम के अन्य लाभ यह है कि ध्यान केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम नमूना की सतह पर जांच होती है, छवियों के पिक्सेल द्वारा पिक्सेल संग्रह सक्षम करने के लिए है। हालांकि इलेक्ट्रॉन बीम, जबकि नमूना 10 के माध्यम से गुजर broadens, इस विशेष संग्रह योजना के कम पारंपरिक मंदिर से inelastically बिखर इलेक्ट्रॉनों के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, वहाँ स्टेम में कोई लेंस के बाद नमूना है, जिससे रंगीन aberrations कि मंदिर में हो सकता है परहेज है। कैमरा लंबाई समायोजित किया जा सकता है ताकि बीएफ डिटेक्टर मुख्य रूप से unscattered इलेक्ट्रॉनों का पता लगाता है। मोटी नमूने का अध्ययन करने के DF डिटेक्टर का उपयोग कर एकाधिक बिखरने, जो गलत छवियों का उत्पादन की वजह से सिफारिश नहीं है। इसके बजाय, बीएफ डिटेक्टर 11 का इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टेम उच्च SNR छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, यह अपेक्षाकृत उच्च बीम अभिसरण मंदिर की तुलना की वजह से एक अपेक्षाकृत कम गहराई का क्षेत्र है, में गहराई से जानकारी की मात्रा है कि मोटी से बरामद किया जा सकता को कमनमूनों। विपथन को सही स्टेम सूक्ष्मदर्शी, जहां अभिसरण कोण 30 mrad के रूप में उच्च हो सकता है के मामले में, गहराई का क्षेत्र काफी कम हो सकता है इतना है कि जानकारी के ध्यान में है कि केवल कुछ नैनोमीटर के एक फोकल हवाई जहाज़ से निकलती है । समानांतर मोड में इलेक्ट्रॉन बीम की स्थापना गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम का संकल्प 12 की हानि के लिए बढ़ाता है। हालांकि, इस सेटअप हमेशा संभव नहीं है।

जब भी यह एक अभिसरण इलेक्ट्रॉन बीम का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, एक तकनीक है कि गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़ाने जब मोटी नमूने का अध्ययन कर उपयोग करना चाहिए। हाल के अध्ययनों में फोकस जानकारी 13, 14 की अधिकतम राशि की वसूली के लिए नमूना भर में विभिन्न फोकल विमानों में एकाधिक छवियों के अधिग्रहण की सूचना है। दो अध्ययनों विभिन्न फोकल विमानों से जानकारी को संभालने के लिए अलग अलग तरीकों का वर्णन है। Hovden एट अल।फूरियर अंतरिक्ष में संयुक्त छवियों कि विभिन्न फोकल विमानों पर एकत्र किए गए थे, और अंतिम पुनर्निर्माण बदलना 13 3 डी उलटा फूरियर से सीधे प्राप्त हुई थी। इसके विपरीत, Dahmen एट अल। असली अंतरिक्ष में विभिन्न फोकल विमानों 14 से 3 डी की मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए एक अभिसरण किरण पुनर्निर्माण इंजन विकसित किया है। हमारी प्रयोगशाला भी इमेजिंग मोटी जैविक नमूनों के लिए एक विधि विकसित की है। हमारी रणनीति है कि ऊपर वर्णित दो तरीकों से अलग हम जानकारी विभिन्न फोकल विमानों में ध्यान में है कि विलय कर दिया और एक समानांतर बीम प्रोजेक्टर 15 का उपयोग वास्तविक अंतरिक्ष में अंतिम 3 डी की मात्रा को खंगाला था। हमारा उद्देश्य एक तरीका है कि आसानी से किसी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगशाला में किया जा सकता है विकसित करने के लिए किया गया था। यह अंत करने के लिए, हम समय की एक सीमित मात्रा में है, पारंपरिक टोमोग्राफी प्रयोगों की समय सीमा के लिए तुलनीय में फोकल छवियों को इकट्ठा करने के उद्देश्य से। इसके अलावा, हमारे प्रस्तावित विधि गसंरेखण और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर के विभिन्न प्रकार के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा ould।

2015 में 15 से हमारे प्रकाशन के संदर्भ में, हम कल्पना और गहराई के क्षेत्र की वसूली के लिए चिह्नित करना चाहता था, इसलिए हम 25 mrad की एक बड़ी अभिसरण अर्द्ध कोण इस्तेमाल किया। यहाँ, हम विधि 2015 15 में हमारी प्रयोगशाला में विकसित के अनुसार स्टेम के माध्यम से फोकल इमेजिंग प्रदर्शन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल मौजूद है, और हम वर्तमान कैसे 2015 से डेटा संसाधित किया गया था। इस विधि को एक मोटी (750 एनएम) जैविक नमूने भर में कई फोकल विमानों से फोकस जानकारी ठीक नहीं है और उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी पुनर्निर्माण सक्षम बनाता है। जहां प्रासंगिक, इस पद्धति अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में मतभेद भी प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

सावधानी: उन्हें उपयोग करने से पहले विभिन्न अभिकर्मकों की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDSs) से परामर्श करें। नमूना तैयार करने के दौरान प्रयुक्त रसायनों के कई, और / या reprotoxic, विषाक्त कैंसर, mutagenic हैं। एक धूआं हुड के तहत व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, और बंद पैर की अंगुली जूते) और काम का उपयोग करते हुए नमूना हैंडलिंग। एक ultramicrotome साथ नमूना सेक्शनिंग तेज उपकरणों का इस्तेमाल शामिल है, और इन उपकरणों का उपयोग सावधानी अनिवार्य है। नीचे वर्णित चरणों में, लेखकों को लगता है कि नमूना एक सेल संस्कृति नमूना है। प्रोटोकॉल नमूना प्रकार, विशेष रूप से centrifugation कदम के अनुसार संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है।

1. बफ़र और मिश्रण की तैयारी

  1. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान तैयार (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, और 1.76 मिमी के.एच. 2 4 पीओ)।
  2. 30%, 50%, और 70% एट युक्त समाधान तैयारनमूना निर्जलीकरण के लिए पीबीएस में hanol। धीरे-धीरे इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में नमूना incubating द्वारा नमूना निर्जलीकरण प्रदर्शन करना।
  3. (Bisphenol-A- (epichlorohydrin) (20 एमएल), मिश्रण succinic एनहाइड्राइड (9 एमएल), मिथाइल-5-norbornene-2,3-dicarboxylic (11 एमएल), और 2,4,6-Tris dodecenyl द्वारा epoxy राल तैयार dimethylaminomethyl) फिनोल (0.7 एमएल); अन्य मिश्रण अनुपात में राल के वांछित कठोरता के आधार पर किया जा सकता है।
  4. नमूना embedding के लिए इथेनॉल में 30%, 50%, और 70% epoxy राल युक्त समाधान तैयार करें। धीरे-धीरे राल सांद्रता में वृद्धि के साथ नमूना incubating द्वारा राल एम्बेडिंग प्रदर्शन करना।
    ध्यान दें: तैयार समाधान की मात्रा नमूना के प्रकार है कि अध्ययन किया जाता है पर निर्भर करते हैं। अधिक समाधान सेल संस्कृतियों के लिए की तुलना में ऊतकों के लिए आवश्यक हैं।

2. फिक्सेशन और नमूना की रंगाई

  1. 5000 में 5 मिनट के लिए सेल संस्कृति अपकेंद्रित्र x जी। एक ही शर्तों का उपयोग निम्न centrifugations के सभी प्रदर्शन करते हैं।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4% paraformaldehyde और 2% glutaraldehyde के साथ पीबीएस (1 एमएल) में यह resuspending द्वारा सेल गोली तय कर लो। 30 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रातोंरात या सप्ताहांत में तय कर लो।
  3. centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली पीबीएस (1 एमएल) के साथ 3 बार धोने के लिए पूरी तरह से लगानेवाला एजेंटों को हटाने के लिए।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस (1 एमएल) में 1% Oso 4 के साथ नमूना पोस्ट-ठीक।
  5. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली पीबीएस (1 एमएल) के साथ 3 बार धोने के लिए पूरी तरह से Oso 4 हटा दें। तेल और त्यागने में Oso 4 निष्क्रिय करें।
  6. एक विपरीत एजेंट के रूप में पीबीएस (1 एमएल) में 2% uranyl एसीटेट जोड़ें और कमरे के तापमान (चित्रा 1 बी) पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  7. centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली अपार uranyl एसी दूर करने के लिए पीबीएस (1 एमएल) के साथ 3 बार धोनेetate; uranyl एसीटेट रेडियोधर्मी तत्व शामिल हैं और एक बिन रेडियोधर्मी कचरे के लिए समर्पित में निपटाया जाना चाहिए।
    नोट: ऊष्मायन बार नमूना के आकार के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, निर्धारण और इस तरह के ऊतकों के नमूनों के रूप में मोटा नमूने, के धुंधला के लिए, अब ऊष्मायन बार की आवश्यकता है। अब ऊष्मायन बार भी निर्जलीकरण और एम्बेडिंग चरणों के लिए बेहतर हो सकता है। Uranyl एसीटेट एक "uranyl-कम" समाधान है कि Gadolinium लवण होते द्वारा बदला जा सकता है।

3. नमूना निर्जलीकरण

  1. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 30% इथेनॉल के साथ पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस (1 एमएल) (चित्रा 1 सी) पर 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  2. दोहराएँ 3.1 कदम धीरे-धीरे बढ़ रही है इथेनॉल सांद्रता के साथ (50%, 70%, और 100% तक) समाधान का उपयोग। इन निर्जलीकरण चरणों के दौरान, नमूना संरक्षण के उद्देश्यों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना बनाए रखें।
  3. centrifugation के बाद, supernat त्यागनेचींटी और शुद्ध इथेनॉल (1 एमएल) में गोली resuspend; 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।

4. राल एम्बेडिंग

  1. Centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागें और आरटी (चित्रा -1) पर 30 मिनट के लिए 30% epoxy राल (1 एमएल) के साथ इथेनॉल में गोली resuspend।
  2. दोहराएँ 4.1 कदम धीरे-धीरे बढ़ रही है epoxy राल सांद्रता के साथ समाधान का उपयोग (50%, 70%, और 100% तक)।
  3. centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला त्यागें और शुद्ध epoxy राल (1 एमएल) में गोली resuspend; आरटी पर रातोंरात सेते हैं। DMP-30 सख्त राल के polymerization ट्रिगर हो सकता है की उपस्थिति; यदि ऐसा होता है, epoxy राल के दो बैचों, के साथ एक और DMP-30 के बिना एक तैयार करते हैं।
  4. centrifugation के बाद, शुद्ध epoxy राल के 200 μL एक प्लास्टिक कैप्सूल में (hardener युक्त) में गोली resuspend; नमूना प्लास्टिक कैप्सूल के तल पर होना चाहिए।

5. राल Polymerization

  1. मैंप्लास्टिक कैप्सूल एक मशीन 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट में नमूना युक्त ncubate; राल के अन्य प्रकार के विभिन्न सेटिंग्स के साथ भाजन हो सकता है।
  2. इनक्यूबेटर से कैप्सूल निकालें और सत्यापित करें कि राल polymerized है; राल मुश्किल होना चाहिए, अगर एक कठिन सतह के खिलाफ लगाए।
  3. शुद्ध epoxy राल नमूना युक्त polymerized राल के शीर्ष पर (hardener युक्त) जोड़ें; राल के इस अतिरिक्त परत के लिए यह आसान नमूना कटौती करने के लिए कर देगा। 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर कैप्सूल सेते हैं।

6. नमूना सेक्शनिंग

  1. एक नमूना धारक में नमूना ऊपर से नीचे माउंट इतना है कि नमूना ऊपर की ओर है और ultramicrotome की trimming खंड पर यह तय कर लो। कसकर ultramicrotome trimming के ब्लॉक सुरक्षित करने के लिए लीवर ताला।
  2. एक रेजर ब्लेड या एक समान तेज काटने साधन का प्रयोग, प्लास्टिक कैप्सूल polymerized राल से अलग करने के लिए बाहर काट दिया। राल कट इतना है कि नमूना शामिल हैमोटे तौर पर एक पिरामिड के आकार में राल में एड। पूरे प्लास्टिक कैप्सूल को दूर करने की कोई जरूरत नहीं है; केवल polymerized नमूना कवर हिस्सा हटा दें।
  3. कैप्सूल और trimming ब्लॉक के बंद नमूना धारक लो और ultramicrotome के चलते बांह पर उन्हें स्थापित करें।
  4. चाकू ब्लॉक पर एक trimming चाकू स्थापित करें और सही पिरामिड के चेहरे ट्रिम। दूरबीन के उपयोग के पिरामिड के लिए एक सही आकार देने के लिए सलाह दी जाती है; बेहतर पिरामिड, बेहतर वर्गों होगा।
  5. trimming चाकू उतारो और एक ऊतक विज्ञान चाकू कि वर्गों है कि मोटा की तुलना में 0.5 माइक्रोन हैं कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ बदलें।
  6. पानी की सही मात्रा के साथ ऊतक विज्ञान चाकू की क्युवेट भरने के बाद, नमूना की सतह के लिए चाकू की धार लाने के लिए और इतना है कि चाकू पिरामिड के लंबवत टुकड़ा होगा कैप्सूल पिच कोण समायोजित करने के लिए दूरबीन का उपयोग करें।
  7. वांछित के अनुसार कटौती की गति को समायोजित करेंखंड मोटाई सजातीय वर्गों ठीक करने के लिए।
  8. पानी के ऊपर अनुभाग नाव और एक पाश के साथ यह मछली।
  9. कि फिल्टर पेपर के शीर्ष पर रखा गया है एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तांबा ग्रिड की ओर पाश ले जाएँ।
    ध्यान दें: ग्रिड पहले इसकी hydrophilicity में वृद्धि करने के लिए इलाज किया जाना चाहिए था। यह एक ग्रिड कोटिंग कलम के साथ किया जा सकता है।
  10. फिल्टर पेपर से जल अवशोषण के कारण, खंड ग्रिड से चिपके रहते हैं। यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में डालने से पहले कुछ मिनट के लिए सूखी।

7. माध्यम से फोकल टिल्ट-श्रृंखला के डिजाइन

  1. निरंतर ध्यान अंतराल पर के माध्यम से फोकल छवियों को ले लीजिए।
    नोट: के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला के माध्यम से फोकल छवियों का एक सेट है कि झुकाव श्रृंखला के प्रत्येक झुकाव कोण पर एकत्र कर रहे हैं से मिलकर बनता है। पूरे फोकस आयाम पूरे नमूना मोटाई कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  2. ध्यान देने के अंतराल के मूल्य निर्धारित करते हैं। अंतराल घ के बराबर हैepth के क्षेत्र, ध्यान केंद्रित करने में पूरे नमूना इकट्ठा; इस सेटिंग को उच्चतम नमूना संभव प्रतिनिधित्व करता है। अंतराल गहराई के क्षेत्र से अधिक से अधिक है, तो नमूना के कुछ भागों को ध्यान में अधिग्रहण नहीं किया जाएगा, जिसका अर्थ है कि नमूना के कुछ भागों को ध्यान में एकत्र नहीं किया जाएगा।
  3. गहराई के क्षेत्र इलेक्ट्रॉन की तरंग दैर्ध्य से एक इलेक्ट्रॉन बीम और इलेक्ट्रॉन बीम के अभिसरण अर्द्ध कोण की गणना। जबकि इलेक्ट्रॉनों की तरंग दैर्ध्य सीधे त्वरण वोल्टेज से जुड़ा हुआ है, अभिसरण अर्द्ध कोण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा प्रदान का उपयोग करें या इसे प्रयोगात्मक निर्धारित एक ज्ञात नमूना 16 के विवर्तन पैटर्न से। क्योंकि इलेक्ट्रॉनों एक तरंग दैर्ध्य λ पर त्वरित एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में α के अभिसरण अर्द्ध कोण के साथ नमूना मारा, निम्न समीकरण का उपयोग गहराई के क्षेत्र (dof) निर्धारित करने के लिए:

    समीकरण
  4. डिज़ाइनफोकल श्रृंखला ताकि पूरी फोकस आयाम इसका अधिक से अधिक स्पष्ट मोटाई पर नमूना कवर किया जाएगा (यानी, अपने उच्चतम ज़ोर पर)।
    नोट: एक 0.75 माइक्रोन मोटी नमूना, एक 70 डिग्री के झुकाव पर 2.19 माइक्रोन की मोटाई एक स्पष्ट होगा तो ध्यान आयाम से अधिक 2.19 माइक्रोन होना चाहिए। इस नमूने के लिए, यदि ध्यान देने के ऊपर निर्धारित किया अंतराल 50 एनएम के बराबर है, यह 44 छवियों (2.19 माइक्रोन / 50 एनएम) इसकी अधिकतम स्पष्ट मोटाई पर नमूना कवर करने की आवश्यकता होगी। पूरे फोकस आयाम फोकस अंतराल फोकल कदम की संख्या से गुणा के मूल्य के बराबर है। उच्चतम झुकाव (θ) में नमूना स्पष्ट मोटाई निम्नलिखित के रूप में परिभाषित किया गया है:

    समीकरण

8. नमूना इमेजिंग

नोट: यह कैसे स्टेम मोड में एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप की स्थापना करने का वर्णन करने के लिए इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है; इस जानकारी का सबसे पाया जा सकता है मैंn संदर्भ मैनुअल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप निर्माता द्वारा प्रदान की। हालांकि, निम्नलिखित ध्यान दें: i) स्थान आकार वांछित बढ़ाई के अनुसार चुना जाना चाहिए; ii) Ronchigram अच्छी तरह से गठबंधन किया जाना चाहिए; और iii) बीएफ मोड में, कैमरा लंबाई unscattered इलेक्ट्रॉनों का चयन करने के लिए है, जबकि डिटेक्टर की अच्छी रोशनी को बनाए रखने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तांबे ग्रिड पर जमा राल वर्गों संकोचन को रोकने के लिए छवि अधिग्रहण से पहले प्रबुद्ध किया जाना चाहिए। राल संकोचन और चार्ज प्रभाव छवि अधिग्रहण के दौरान चकित किया जा सकता है। एक उद्देश्य लेंस एपर्चर के उपयोग नमूना स्थिरता में सुधार जब चार्ज प्रभाव हो सकता है। हालांकि, स्टेम setups के विशिष्ट मामले में, उद्देश्य एपर्चर नहीं HAADF इमेजिंग मोड के साथ संगत है, और बहुत छोटे छिद्र उद्देश्य बीएफ इमेजिंग मोड के साथ संगत नहीं हैं।

  1. कम बढ़ाई (स्टेम में 20,000X के आसपास) का उपयोग करना, नमूना के माध्यम से ब्राउज़ करें और ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने।
  2. टी समायोजित करेंवह ऊंचाई (जेड अक्ष) eucentric तो यह है कि ब्याज के क्षेत्र दूर बहाव नहीं करता है, जबकि नमूना घूर्णन।
  3. सत्यापित करें कि ब्याज की वस्तु पूरे झुकाव रेंज भर में दिखाई रहेगा।
  4. एक के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला के दौरान अर्जित छवियों की पर्याप्त संख्या के कारण, एक स्वत: संग्रह सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। या तो एक वाणिज्यिक समाधान का उपयोग करें या एक कस्टम डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर डिजाइन अगर वांछित। सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम तीन निम्न चरणों का पालन करने में सक्षम है:
    1. ट्रैक और एक मानक झुकाव श्रृंखला संग्रह योजना के रूप में ध्यान केंद्रित।
    2. सुनिश्चित करें कि के माध्यम से फोकल छवियों नमूने की जेड स्थिति के साथ ओवरलैप।
    3. स्वचालित रूप से प्रत्येक झुकाव कोण पर के माध्यम से फोकल छवियों की एक श्रृंखला के अधिग्रहण।
  5. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला के मुख्य मापदंडों दें (यानी, फोकल अंतराल, फोकल कदम है, कम से कम झुकाव कोण, अधिकतम झुकाव कोण, झुकाव कदम है, और स्कैनिंग गति)।
  6. प्रारंभसॉफ्टवेयर प्रोग्राम को समाप्त करने के लिए छवि संग्रह की प्रक्रिया और इंतजार करो।

9. इमेज प्रोसेसिंग

नोट: इस प्रोटोकॉल में, के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला प्रसंस्करण ImageJ plugins 17 का उपयोग किया जाता है। अनुपूरक डेटा 1 संरेखण कदम (Turboreg) के लिए और एक के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला तीन ध्यान मूल्यों के साथ डिजाइन के लिए में फोकस जानकारी (क्षेत्र की विस्तारित गहराई) के विलय के लिए एक ImageJ मैक्रो पता चलता है।

  1. एक ही झुकाव कोण (यानी, के माध्यम से फोकल चित्र) पर एकत्र छवियों को संरेखित। चूंकि छवियों को एक ही में फोकस जानकारी नहीं है, वे संरेखण के लिए एक ही सुविधाओं बंदरगाह नहीं है; पड़ोसी छवियों संरेखित दो द्वारा दो से संरेखण प्रदर्शन (यानी, एक पिरामिड पदानुक्रम, पहले निकटतम फोकस मूल्यों के साथ के बाद) Turboreg 18, एक ImageJ प्लगइन का उपयोग।
  2. लगातार हर झुकाव कोण पर के माध्यम से फोकल छवियों के संरेखण की जाँच करें।दृश्य निरीक्षण में सुधार करने के लिए गठबंधन के माध्यम से फोकल छवियों हो चुकी है।
    नोट: केवल जोन ध्यान में है कि जब ढेर के माध्यम से ब्राउज़िंग बढ़ना चाहिए। के बाद से निम्नलिखित कदम जानकारी के विभिन्न छवियों से ध्यान में है कि की वसूली के होते सटीक संरेखण, सबसे महत्वपूर्ण बात है।
  3. जानकारी के ध्यान में है कि फील्ड 19, एक ImageJ प्लगइन का विस्तारित गहराई का उपयोग कर मर्ज; यह अंततः छवियों के ढेर से एक ही छवि उत्पन्न होगा। कई सेटिंग्स गहराई के क्षेत्र वसूली के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन छवि जानकारी की रक्षा करने के लिए उच्चतम सेटिंग्स का उपयोग करें।
    नोट: झुकाव श्रृंखला अब झुकाव कोण प्रति एक ही छवि से बना है, में फोकस जानकारी युक्त प्रत्येक छवि के माध्यम से फोकल छवियों से बरामद किया।
  4. डेटा की प्रक्रिया।
    नोट: संरेखण और पुनर्निर्माण के लिए मानक उपकरण के बाद से डेटा अब एक मानक झुकाव श्रृंखला के लिए कम हो गया है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, TomoJ हमें हैडेटा संरेखण और डेटा पुनर्निर्माण 20, 21 के लिए एड। कैसे TomoJ का उपयोग करने के बारे में अधिक जानकारी के लिए मूल प्रकाशन 22 में पाया जा सकता है।
  5. झुकाव सीरीज के ठीक संरेखण प्रदर्शन करना।
    नोट: एक अच्छी रणनीति असंदिग्ध मार्कर के रूप में सोने की माला का उपयोग करने के लिए सही छवियों के बीच बदलाव के ट्रैक करने के लिए है। सोने की माला नमूना नहीं जोड़ा जा सकता है, अगर स्थानीय minima भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. गठबंधन डेटा की एक 3 डी पुनर्निर्माण प्रदर्शन; कई एल्गोरिदम असली अंतरिक्ष या फूरियर अंतरिक्ष, फायदे और सीमाओं के साथ प्रत्येक में पुनर्निर्माण के प्रदर्शन के लिए उपलब्ध हैं।
  7. झुकाव श्रृंखला के अंतिम संरेखण गरीब है, तो प्रारंभिक कदम के अनुकूलन के द्वारा कुछ सुधार कर सकते हैं। संरेखण कदम को दोहराते हैं, तो अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण धुंधला या विकृत प्रकट होता है; व्यवहार में, अधिक से अधिक एकत्र फोकल विमानों की संख्या, बेहतर विपरीत और 3 डी पुनर्निर्माण का विवरण।
    नोट: Several सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला पर कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण चुना गया था क्योंकि, हमारे अनुभव में, वे सबसे अच्छा प्रदर्शन किया। Turboreg 18 छवियों संरेखित जब ध्यान की एक ढाल उपस्थित थे के मामले में बेहतर प्रदर्शन किया। अधिक जानकारी के लिए समर्पित वेबसाइट 23 पर पाया जा सकता है। फील्ड प्लगइन 19 की विस्तारित गहराई, विभिन्न छवियों से फोकस में जानकारी उबरने के मामले में बहुत अच्छा प्रदर्शन किया है, जबकि अन्य उपकरणों दिखाई पिक्सल संशोधनों में हुई। अधिक जानकारी के लिए, विशेष रूप से के बारे में पटकथा लेखन, इस समर्पित वेबसाइट 24 पर पाया जा सकता है।

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Representative Results

हमारे अध्ययन में, इलेक्ट्रॉनों क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में 200 केवी करने के लिए त्वरित किया गया। छवियाँ 20 μs ध्यान केन्द्रित करना समय का उपयोग स्टेम बीएफ मोड में एकत्र किए गए थे। के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला के डिजाइन के बारे में, हमने पाया है 150 का ध्यान केंद्रित है कि अंतराल एनएम एक 750 एनएम मोटी जैविक नमूने भी केवल हालांकि इलेक्ट्रॉन बीम की गहराई का क्षेत्र था के Ultrastructural अध्ययन के लिए संतोषजनक परिणाम दे दी है 3 एनएम के बाद से हम 25 mrad की एक बहुत बड़ी अभिसरण अर्द्ध कोण इस्तेमाल किया।

नमूना इस रिपोर्ट में विश्लेषण Trypanosoma ब्रुसे, एक कोशिकीय यूकेरियोट जिसका कशाभिका अधिकता का अध्ययन किया जाता है, क्योंकि इस organelle उल्लेखनीय स्तनधारियों से 25 प्रोटिस्टा से संरक्षित किया जाता है। कोशिकाओं के रूप में नमूना तैयार प्रोटोकॉल में प्रस्तुत इलाज किया गया है, और हम टी ब्रुसे की कशाभ जेब पर संरचनात्मक विश्लेषण ध्यान केंद्रित ( (चित्रा 2 बी, सी और डी)। एकत्र छवियों पर, क्षेत्र के ध्यान में है कि पतली दिखाई देता है, और छवि के सबसे क्योंकि सीमित गहराई के क्षेत्र का धुंधला है। में फोकस जानकारी के विलय एकत्र छवियों पर प्रदर्शन किया और एक ही छवि है, जहां में फोकस क्षेत्र बहुत व्यापक है (चित्रा 2 ई) का उत्पादन किया जाता है।

में फोकस जानकारी के विलय बेहतर उच्च आवृत्ति के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला छवियों की (चित्रा 2 एफ, जी, और एच में सफेद पिक्सल) क्षेत्रों पर प्रकाश डाला द्वारा देखे जा सकते हैं। ImageJ कमांड "किनारों पता लगाएं," हमें थावर्तमान अध्ययन में एड। यह आदेश पड़ोसी पिक्सेल तीव्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक सोबेल फिल्टर का उपयोग करता है। पता चला उच्च आवृत्ति क्षेत्र के विस्थापन दूसरे के लिए एक छवि से देखा जा सकता है। छवि जहां में फोकस जानकारी विलय कर दिया गया है पर, उच्च आवृत्तियों छवि (चित्रा 2I) के सबसे अवधि। इस विधि के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला का अच्छा प्रसंस्करण के सत्यापन के लिए परमिट।

के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला का उपयोग कर, अतिरिक्त में फोकस जानकारी एकत्र की है और 3 डी पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है। यह अधिक से अधिक विपरीत पैदा करता है और SNR और गहराई का क्षेत्र सीमित छवियों 15 के 3D पुनर्निर्माण में मनाया धुंधला प्रभाव को कम करता है। फूरियर अंतरिक्ष में, अतिरिक्त जानकारी एक क्लासिक झुकाव श्रृंखला संग्रह योजना है, जहां केवल फोकल हवाई जहाज़ पर 13 एकत्र किया जाता है की तुलना में बरामद किया है। कुल मिलाकर, पूरे 3 भर में गुणवत्ताडी पुनर्निर्माण एक क्लासिक झुकाव श्रृंखला संग्रह योजना की तुलना में अधिक isotropic है।

आकृति 1
चित्रा 1: जैविक नमूने तैयारी प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों पेश छवियाँ। नमूना तैयार प्रोटोकॉल चार साधन चरणों में विभाजित किया जा सकता है। नमूना ए) paraformaldehyde और glutaraldehyde में तय हो गई है, बी) के बाद तय आज़मियम tetroxide में और uranyl एसीटेट, सी) इथेनॉल में निर्जलित के विपरीत, और डी) राल में एम्बेडेड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
गहराई के क्षेत्र में सुधार के सत्यापन। गहराई के क्षेत्र की वसूली के एक झुका नमूना के चित्र पर सत्यापित किया जा सकता। ए) 0 डिग्री के झुकाव में कई विवरण राल एम्बेडेड टी ब्रुसे सेल के कशाभ जेब (ध्वज जेब) में देखा जा सकता है। कशाभ जेब कोशिका द्रव्य (CYT) में स्थित है, और बेसल-शरीर (बी बी) कशाभ झिल्ली को कशाभिका (फ्लैग) एंकर। बी, सी और डी) एक ही कशाभ जेब, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में 70 डिग्री पर झुका के तीन छवियों, हासिल किया गया। वे 300 एनएम का ध्यान केंद्रित अंतराल के साथ एकत्र किए गए थे। ई) इस छवि को फील्ड ImageJ प्लगइन का विस्तारित गहराई से उत्पन्न किया गया था और बी, सी के फोकस में जानकारी हैं, और डी एफ, जी, एच, और मैं) इन छवियों में "किनारों मिल" कमांड के साथ गणना कर रहे थे आदेश highl करने में ImageJight उच्च आवृत्ति जानकारी बी, सी, डी और ई, क्रमशः में निहित। व्हाइट पिक्सल उच्च आवृत्तियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, में फोकस जानकारी के लिए इसी। पैमाने बार 250 एनएम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1. इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम के माध्यम से फोकल टोमोग्राफी स्टेम का उपयोग कर मोटी जैविक नमूने पर 3 डी विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड के साथ एक पारंपरिक नमूना तैयार प्रोटोकॉल उपस्थित थे। जैविक नमूनों की राल एम्बेडिंग दशकों 26 के लिए इस्तेमाल किया गया है, और वैकल्पिक प्रोटोकॉल है कि नमूने के विभिन्न प्रकार के लिए अनुकूलित कर रहे साहित्य 27 में से चुन सकते हैं। इसके विपरीत, स्टेम में इमेजिंग मोटी नमूनों के माध्यम से फोकस तरीकों के लिए एक नए उपक्रम उपयोग कर रहा है, और के रूप में इसे और अधिक व्यापक हो जाता है तरीकों की संभावना सबसे अधिक सुधार किया जाएगा।

इस काम का उद्देश्य के लिए एक नमूना तैयार प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था और अधिक विशेष रूप से, के माध्यम से फोकल उपकरण के साथ स्टेम में झुकाव श्रृंखला अधिग्रहण है कि वर्तमान में उपलब्ध है और समय का एक उचित मात्रा में प्रदर्शन के लिए इमेजिंग की स्थिति। इस कारण से, बड़े ध्यान केंद्रित अंतराल इस्तेमाल किया गया। वास्तव में, वहाँ के बारे में कोई आम सहमति नहीं है कि कैसे पासफोकल विमानों के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला के लिए स्टेम के साथ एक मोटी नमूना इमेजिंग के लिए होना चाहिए। यह आमतौर पर स्टेम छवियों को इकट्ठा करने के लिए कई सेकंड तक ले जाता है, और एक पूरे पारंपरिक झुकाव श्रृंखला को पूरा करने के लिए घंटे लग सकते हैं। एक सबूत की अवधारणा के रूप में, यह भी सैकड़ों या छवियों के हजारों इकट्ठा करने के लिए संभव है। हालांकि, यह स्पष्ट है कि लंबे समय तक संग्रह बार हर रोज इस्तेमाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं। जब इस तरह के लंबे प्रयोगों को डिजाइन किरण स्थिरता और नमूना बहाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, लंबे संग्रह बार संचित इलेक्ट्रॉन खुराक का सवाल उठाना। इस प्रकार, कुछ समय के लिए, स्टेम के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला मुख्य रूप से पर्याप्त इलेक्ट्रॉन खुराक की आवश्यकता है, क्योंकि इस तरह के राल एम्बेडेड जैविक नमूने या अकार्बनिक सामग्री के रूप में किरण-प्रतिरोधी नमूनों के अध्ययन के लिए ही उपयुक्त है। अधिग्रहण के समय और अंतिम 3 डी पुनर्निर्माण की गुणवत्ता के बीच व्यापार बंद के कारण, हम परियोजनाओं में कुछ के माध्यम से फोकल अंतराल जहां उच्च संकल्प की आवश्यकता नहीं है का उपयोग करना चाहिये, एकएन डी हम परियोजनाओं जहां उच्च संकल्प की आवश्यकता है के माध्यम से फोकल अंतराल की एक बड़ी राशि का उपयोग करना चाहिये।

वहाँ अपनी नवीनता की वजह से इस विधि में विशेष कदम के बारे में आम सहमति की कमी है। हालांकि, यह स्पष्ट है कि कई कदम के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला डेटासेट स्टेम से उच्च गुणवत्ता पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, प्रत्येक झुकाव कोण पर फोकल छवियों के संरेखण ध्यान से क्रियान्वित किया जा करने के लिए के रूप में तीन मूल के माध्यम से फोकल छवि संग्रह 13, 14, 15 का वर्णन लेख में बताया की जरूरत है। विभिन्न फोकल मूल्यों पर एकत्र छवियों आम जानकारी का हिस्सा नहीं है, भले ही Turboreg छवियों की सटीक, स्वत: संरेखण के लिए एक अच्छा समाधान बनी हुई है। दूसरा, फोकल छवियों के विलय, इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के रूप में है, जो आसानी से किसी भी झुकाव श्रृंखला संरेखित द्वारा नियंत्रित किया जाता है झुकाव कोण प्रति एक छवि, पैदा करने का फायदा हैजाहिर है और 3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम। फील्ड प्लग-इन के विस्तारित गहराई शुरू में प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए डिजाइन किया गया था; फिर भी, यह इलेक्ट्रॉन micrographs 28 से फोकस जानकारी विलय के लिए सबसे अच्छा समाधान हो गया लगता है। एक वैकल्पिक समाधान झुकाव कोण प्रति कई छवियों, वैसे ही क्या Hovden एट अल द्वारा किया गया था के साथ एक एकल झुकाव श्रृंखला डाटासेट के रूप में छवियों के पूरे सेट पर विचार करने के लिए है। 13 और Dahmen एट अल। 14। यह फूरियर आधारित पुनर्निर्माण एल्गोरिदम 13 या Ettention, जो Dahmen एट अल द्वारा विकसित किया गया था के उपयोग की आवश्यकता है। 29 और जो केवल 3 डी पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर है कि असली अंतरिक्ष में विभिन्न फोकल मूल्यों पर एकत्र छवियों से 3 डी की मात्रा को फिर से संगठित कर सकते हैं। विशेष रूप से, इस तरह के वैकल्पिक समाधान फोकल दिशा (जेड अक्ष) में एक अतिरिक्त संरेखण कदम है, जो भ्रामक resu उत्पादन हो सकता है की जरूरत होगीएलटीएस कि छवि संग्रह के दौरान चुना defocus अंतराल के साथ असंगत हैं, के रूप में Dahmen एट अल में चर्चा की। 14। में फोकस जानकारी के विलय, इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत के रूप में, एक छवि पैदा करने के रूप में यदि डेटा का उपयोग कर एक समानांतर एकत्र किए गए थे, जिससे जेड दिशा में इस अतिरिक्त संरेखण कदम से बचने का लाभ दिया है।

के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला तरीकों मोटी नमूने (1 माइक्रोन के आसपास) का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। इन तरीकों के मुख्य सीमा है कि वे, क्योंकि इलेक्ट्रॉन बीम ऐसे नमूने घुसना नहीं कर सकते कई माइक्रोन से अधिक गहरा नमूनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इस सीमा इलेक्ट्रॉनों का मतलब मुफ्त पथ, जो त्वरण वोल्टेज पर निर्भर है से आता है। बहुत उच्च वोल्टेज (यानी, 1000 केवी) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप कोशिकाओं 30 इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही बहुत मोटी नमूने अभी भी ऐसे focuse के रूप में अन्य तकनीकों के उपयोग की आवश्यकताडी आयन बीम या सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 31, 32। हालांकि, इन तरीकों anisotropic पुनर्निर्माण कि छवियों के ढेर पर विचार किया जा सकता है, क्योंकि जो विधि के काटने गहराई के रूप में परिभाषित किया गया है जेड अक्ष, एक्स और वाई कुल्हाड़ियों के बराबर नहीं है उत्पन्न करते हैं। इन तकनीकों में उच्च संकल्प अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

2014 और 2015 में, तीन मूल लेख इमेजिंग मोटी नमूने 13, 14, 15 के लिए विभिन्न तरीकों की सूचना दी। तब से, केवल कुछ अध्ययनों से इन तरीकों में से किसी का इस्तेमाल किया है मोटी नमूने 33 अध्ययन करने के लिए। के तरीकों में सुधार स्टेम के माध्यम से फोकल इमेजिंग सामान्यीकरण करने में मदद मिलेगी। विशेष रूप से जीवन विज्ञान में, के माध्यम से फोकल तरीकों क्रायोजेनिक की शर्तों के तहत नमूने के अवलोकन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता। यह एक बड़ी चुनौती है, क्योंकि क्रायोजेनिक नमूने हैंखुराक इलेक्ट्रॉन को विशेष रूप से संवेदनशील है, और के माध्यम से फोकस तरीकों कई छवियों की आवश्यकता होती है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 121 इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मोटी जैविक नमूने, गहराई का क्षेत्र के माध्यम से फोकल झुकाव श्रृंखला
तैयारी और मोटी जैविक नमूने का अवलोकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी ट्रांसमिशन द्वारा
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Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

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