走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

Introduction

1970年代初頭以来、断層撮影法は、広く、生物学的標本^1、2、3の構造の特徴付けのために使用されてきた透過型電子顕微鏡（TEM）に近づきます。透過型電子断層撮影法の魅力は、細胞の構造および細胞小器官の超微細構造の巨大分子複合体およびタンパク質の構造に、ナノメートルスケールでの生物学的構造の広い範囲を研究するために使用することができるということでした。それにもかかわらず、透過型電子断層撮影法は、非常に厚い試料（0.5μm以下）を研究するために使用することができませんでした。実際、厚い標本は、低い信号対雑音比（SNR）の画像を生成し、あまりにも多くの散乱電子を生成します。さらに、断層撮影法は、試料の見かけの厚さが、傾斜角の増加と共に、傾斜片の画像のコレクションを含みます。非弾性散乱をフィルタリングすることができるにもかかわらずエネルギーフィルタを用いて、高SNR画像のために必要な電子の臨界量はほとんどTEMに達しました。したがって、厚い生体試料は、わずか^4を区画用いて研究されてきました。

それらが切断されたときにいくつかが低下する可能性があり、他はその複雑さを理解するために、その全体で検討する必要がありますいくつかのサンプルをスライスすることはできません。別のアプローチは、走査モード^{5、6、7、8}のTEMを使用することです。透過電子顕微鏡（STEM）の走査において、電子の光路は、従来のTEMと異なります。弾性散乱ものは暗視野（DF）検出器を光軸からある角度で収集することができ、一方、散乱せずに試料を通過する電子は、明視野（BF）検出器⁹との光軸上に集めることができます。STEMの他の利点は、集束電子ビームは、画像のピクセルごとの収集を可能にする、試料の表面で走査されることです。サンプル¹⁰を通過しながら電子ビームを広げても、この特定の収集方式は、従来のTEMより非弾性散乱電子の影響を受けにくいです。また、これにより、TEMで発生する可能性が色収差を回避STEMにはレンズ後の試料​​は、ありません。 BF検出器は、主に非散乱電子を検出するようにカメラの長さを調整することができます。厚い試料を研究するためにDF検出器を使用することであるため、不正確な画像を生成する多重散乱、お勧めできません。代わりに、BF検出器^11を使用することができます。 STEMは、高SNR画像を生成することができるが、それは厚いから回収することができる詳細な情報の量を減少させる、ためTEMに比べて比較的高いビーム収束比較的低い被写界深度を有します標本。フォーカスされている情報は、わずか数ナノメートルの焦点面に由来するように、輻輳角は30ミリラジアンと高くすることができ、収差補正STEM顕微鏡の場合には、被写界深度が十分に低くすることができ。パラレルモードでは、電子ビームを設定する分解能¹²の犠牲に被写界深度電子ビームを高めます。しかし、この設定は常に可能ではありません。

それは収束電子ビームを使用する必要があるたびに厚い試料を研究するとき、人は被写界深度電子ビームを高める技術を使用しなければなりません。最近の研究では、合焦情報^13、14の最大量を回収するために、試料の様々な焦点面における複数の画像の取得を報告しています。二つの研究は、異なる焦点面からの情報を処理するためのさまざまな方法について説明します。ホーブデンら。様々な焦点面で収集した画像は、フーリエ空間で組み合わせ、最終再構成^13を変換次元逆フーリエ変換から直接得ました。対照的に、ダーメンら。実空間内の様々な焦点面¹⁴から3Dボリュームを再構成する収束ビーム再構成エンジンを開発しました。私たちの研究室でも厚い生物学的標本を画像化するための方法を開発しました。当社の戦略は、我々は、様々な焦点面にフォーカスされている情報をマージして平行ビームプロジェクター^15を用いて、実空間での最終3Dボリュームを再構築し、その中に上記の二つの方法は異なっていました。私たちの目的は、簡単に任意の電子顕微鏡研究室で行うことができる方法を開発することでした。この目的のために、我々は、従来の断層撮影実験の時間枠に相当する時間の限られた量で焦点画像を収集することを目的としました。また、提案手法のC整列および再構築ソフトウェアの異なるタイプで使用するために適合されウルド。

2015年¹⁵から私たちの出版物の文脈において、我々は、被写界深度の回復を可視化し、特徴づけるために望んでいたので、私たちは25 mradでの大規模な収束半角を使用しました。ここでは、2015年¹⁵で私たちの研究室で開発された方法に従って、STEMにスルー焦点イメージングを実行するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、我々は2015年からのデータが処理された方法を提示します。この方法は、厚さ（750 nm）の生物学的サンプル中の複数の焦点面からの合焦情報を回復し、高品質の3D再構成を可能にします。該当する場合、他のグループによって使用される方法に対するこの方法論の違いも提示されています。

Protocol

注意：それらを使用する前に、種々の試薬の物質安全データシート（MSDSの）を参照してください。試料調製の際に使用される化学物質のいくつかは、毒性発がん性、変異原性、および/または生殖毒性です。サンプルの処理中にヒュームフードの下で個人用保護具（手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）とワークを使用してください。ウルトラミクロトームで試料を区画することは鋭利な器具の使用を含む、およびこれらのツールを慎重に使用することは必須です。以下に説明する手順では、著者らは、試料は、細胞培養サンプルであると仮定する。プロトコルは、サンプルの種類、特に遠心分離工程に応じて変更される必要があり得ます。

緩衝剤およびそれらの混合物の調製

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa ₂ HPO _4、および1.76 mMのKH ₂ PO _4）を調製。
2. 30％、50％、70％等を含有する溶液を調製しますサンプル脱水のためにPBS中hanol。徐々にエタノール濃度を増加させ、サンプルをインキュベートすることにより、試料の脱水を実行します。
3. （ビスフェノールA-（エピクロルヒドリン）（20mL）中、ドデセニル無水コハク酸（9 mL）を、メチル-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸（11 ml）を混合することによりエポキシ樹脂を準備し、そして2,4,6-トリスジメチルアミノメチル）フェノール（0.7 mL）を、他の混合比は、樹脂の所望の硬度に応じて使用することができます。
4. サンプル埋め込みエタノール中30％、50％、及び70％のエポキシ樹脂を含む溶液を準備します。徐々に樹脂の濃度を増加させて試料をインキュベートすることによって、樹脂の埋め込みを行います。
   注：調製した溶液の体積が検討されているサンプルの種類によって異なります。以上の溶液は、細胞培養のためのより組織のために必要とされます。

サンプルの2.固定および着色

1. 遠心分離機5000×gで5分間、細胞培養。同じ条件を用いて、以下の遠心分離のすべてを実行します。
2. 上清を捨て、4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含むPBS（1mL）にそれを再懸濁することにより細胞ペレットを修正。 30分（ 図1A）、室温で静置します。代わりに、一晩または週末の間、4℃で細胞を固定。
3. 遠心分離後、上清を除去し、完全に固定剤を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。
4. 室温で30分間、PBS中の1％のOsO _4（1 mL）でサンプルをポスト修正。
5. 遠心分離後、上清を除去し、完全のOsO ₄取り除くためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。油中のOsO _4を無効化_し 、廃棄します。
6. 造影剤としてPBS（1mL）中の2％酢酸ウラニルを追加し、室温（ 図1B）で30分間サンプルをインキュベートします。
7. 遠心分離後、上清を除去し、未結合のウラニル交流を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄etate;酢酸ウラニルは、放射性元素が含まれており、放射性廃棄物専用のビンで処分しなければなりません。
   注：インキュベーション時間は、試料の大きさに応じて変更することができます。例えば、組織試料と厚い試料の固定および染色は、より長いインキュベーション時間を必要とします。より長いインキュベーション時間は、また、脱水および埋め込みステップのためのより良いかもしれません。酢酸ウラニルは、ガドリニウム塩を含む「ウラニルレス」溶液で置き換えることができます。

3.サンプル・脱水

1. 遠心分離後、上清を捨て、30％エタノール（ 図1C）を含むPBS中で4°C（1 mL）中で30分間試料をインキュベートします。
2. 徐々に増加するエタノール濃度（50％、70％、および100％まで）溶液を用いて手順を繰り返し3.1。これらの脱水工程の間、サンプルの保存のために4℃で試料を維持します。
3. 遠心分離した後、supernatを破棄アリと純エタノール（1 mL）にペレットを再懸濁。 4℃で一晩インキュベートします。

4.樹脂埋め込み

1. 遠心分離後、上清を破棄し、RT（ 図1D）で30分間30％のエポキシ樹脂（1 mL）でエタノール中でペレットを再懸濁します。
2. 徐々にエポキシ樹脂濃度（100％まで、50％、70％など）を増加させるの溶液を使用して手順を繰り返し4.1。
3. 遠心分離後、上清を破棄し、純粋なエポキシ樹脂（1 mL）中にペレットを再懸濁します。 RTで一晩インキュベートします。 DMP-30の硬化の存在は、樹脂の重合を誘発する可能性があります。この問題が発生した場合には、エポキシ樹脂の二つのバッチ、1とし、DMP-30のないものを準備します。
4. 遠心分離した後、純粋なエポキシ樹脂の200μLプラスチックカプセル内（硬化剤​​を含む）中にペレットを再懸濁。サンプルは、プラスチックカプセルの一番下にあるべきです。

5.樹脂重合

1. 私48時間、60℃に設定したインキュベーター中でサンプルを含有するプラスチックカプセルをncubate。樹脂の他の種類は異なる設定で重合することがあります。
2. インキュベーターからカプセルを外し、樹脂が重合していることを確認してください。硬い表面に押し付けた場合の樹脂は、ハードでなければなりません。
3. 試料を含む重合樹脂の上に（硬化剤を含む）、純粋なエポキシ樹脂を追加します。樹脂のこの余分な層は、それが簡単にサンプルをカットするようになります。 48時間60℃でカプセルをインキュベートします。

6.サンプルセクショニング

1. サンプルが上に向かっているように、試料ホルダ内の試料逆さまにマウントして、ウルトラミクロトームのトリミングブロックにそれを修正。しっかりウルトラミクロトームにトリミングブロックを確保するためのレバーをロックします。
2. かみそりの刃または類似の鋭利な切断器具を使用して、重合樹脂からそれを分離するためにプラスチック製のカプセルを切り出します。サンプルが含まれているように、樹脂をカットピラミッドのおおまかな形状で樹脂中に編。全体プラスチックカプセルを削除する必要はありません。唯一の重合サンプルを覆っている部分を削除します。
3. カプセルやトリミングブロックのオフ試料ホルダーを取り、ウルトラミクロトームの移動アームに取り付けます。
4. ナイフブロックにトリミングナイフをインストールし、正確にピラミッドの顔をトリミング。双眼鏡の使用は、ピラミッドに最適な形状を与えることをお勧めします。ピラミッドより良い、より良いセクションになります。
5. トリミングナイフを脱いで、0.5ミクロンよりも厚いセクションを切断するために使用することができ、組織学ナイフと交換してください。
6. 水の正確な量の組織学ナイフのキュベットを充填した後、試料の表面にナイフの刃先を持参し、ナイフはピラミッドに垂直にスライスするように、カプセルのピッチ角を調整するために双眼鏡を使用しています。
7. 希望に応じて切削速度を調整しますセクションの厚さが均一な切片を回収しました。
8. 水上セクションフロートをしようと、ループでそれを釣ります。
9. ろ紙の上に配置された電子顕微鏡銅グリッドに向かってループを動かします。
   注：グリッドは、その親水性を高めるために、以前に処理されている必要があります。これは、グリッドコーティングペンで行うことができます。
10. ろ紙による水の吸収のために、セクションはグリッドに固執しましょう。電子顕微鏡に挿入する前に数分間、それが乾燥してみましょう。

スルー焦点チルトシリーズの7デザイン

1. 一定の焦点間隔でスルー焦点画像を収集します。
   注：スルー焦点チルトシリーズは、チルトシリーズの各傾斜角度で収集されたスルー焦点イメージのセットで構成されています。全焦点振幅は、サンプル全体の厚さをカバーするのに十分であるべきです。
2. フォーカス間隔の値を決定します。間隔がdに等しい場合epth-の視野、焦点のサンプル全体を集めます。この設定は、可能な限り最高のサンプリングを表します。間隔は、被写界深度より大きい場合、試料の一部は、サンプルの一部が焦点に収集されないことを意味し、焦点で取得されません。
3. 被写界深度電子の波長からの電子ビームと電子ビームの収束半角を計算します。電子の波長を直接加速電圧に連結されているのに対し、電子顕微鏡の製造業者によって提供収束半角を使用するか、または既知の試料¹⁶の回折パターンから実験的に決定します。電子は、波長λで加速するので被写界深度（DOF）を決定するために次の式を使用し、電子顕微鏡でαの収束半角でサンプルをヒット：
   
   
4. 設計全体の焦点振幅がその最大見かけの厚さでサンプルをカバーするように、焦点シリーズ（ すなわち、その最高の傾きで）。
   注：0.75ミクロンの厚さの試料を、70°の傾斜で2.19ミクロンの見かけの厚さを持つことになりますので、フォーカス振幅は2.19ミクロン以上でなければなりません。上記で決定したフォーカス間隔が50nmに等しい場合、このサンプルでは、​​それはその最大見かけの厚さでサンプルをカバーする44の画像（2.19ミクロン/ 50 nm）を必要とします。全焦点振幅焦点ステップの数を乗じた焦点間隔の値に等しいです。最高の傾き（θ）では、サンプル見かけの厚さは、次のように定義されます。
   
   

8.サンプル画像

注：これは、STEMモードでの電子顕微鏡を設定する方法を説明するために、このプロトコルの範囲を超えています。この情報のほとんどはI見つけることができますn個のリファレンスマニュアルは、電子顕微鏡の製造元が提供します。ただし、次の点に注意してくださいⅰ）スポットサイズは、所望の倍率に応じて選択する必要があります。 ⅱ）ロンチグラムはよく整列させる必要があります。およびiii）BFモードでは、カメラの長さは、検出器の良好な照明を維持しつつ、非散乱電子を選択するように調整されなければなりません。電子顕微鏡銅グリッド上に堆積させた樹脂のセクションでは、収縮を防ぐために、画像取得の前に点灯している必要があります。樹脂の収縮と帯電効果は、画像取得の際に混乱する可能性があります。帯電効果が発生した場合、対物レンズの開口の使用は、サンプルの安定性を向上することがあります。しかし、STEMのセットアップの特定の場合には、対物絞りはHAADF撮影モードと互換性がない、と非常に小さい目的開口は、BFの撮影モードと互換性がありません。

1. （STEMで20,000前後）低倍率を使用して、サンプルを参照し、関心領域を探します。
2. トンを調整サンプルを回転させながら、関心領域が離れてドリフトしないように、彼は高さ（Z軸）をユーセントリック。
3. 興味の対象が全体のチルト範囲全体にわたって表示されたままになりますことを確認します。
4. スルー焦点チルトシリーズの間に取得された画像の実質的な数のため、自動収集ソフトウェアを使用しています。いずれかの商用ソリューションを使用するか、または希望する場合は、カスタムデータ収集ソフトウェアを設計します。ソフトウェアプログラムは、3次の手順を実行することが可能であることを確認します。
   1. 追跡し、標準的なチルトシリーズコレクション方式のように焦点を当てます。
   2. スルー焦点画像はサンプルのZ位置と重なっていることを確認してください。
   3. 自動的に各傾斜角度におけるスルーフォーカル一連の画像を取得します。
5. ソフトウェアプログラムを介して焦点傾斜シリーズの主なパラメータ（ すなわち、焦点間隔の焦点ステップ、最小傾斜角、最大傾斜角、傾斜ステップ、および走査速度）を得ました。
6. 開始画像収集プロセスや仕上げにソフトウェアプログラムを待ちます。

9.画像処理

注：このプロトコルでは、スルーフォーカルチルト系列処理はImageJのプラグイン^17を使用して実行されます。補足データ1は、アライメント工程（Turboreg）および3焦点値で設計スルー焦点チルトシリーズの合焦情報（フィールドの拡張深さ）をマージするためのImageJのマクロを示しています。

1. 同じ傾斜角（ すなわち、スルー焦点画像）で収集した画像の位置を合わせます。イメージが同じで、フォーカスの情報を持っていないので、位置合わせのための同じ機能を抱いていません。 Turboreg ^18、ImageJのプラグインを使用して（ すなわち、最初に最も近い焦点値で、ピラミッド型の階層を次の）近隣の画像2つずつ整列させることにより位置合わせを行います。
2. 一貫して、各傾斜角でスルー焦点画像の位置合わせを確認してください。目視検査を改善するために整列スルー焦点画像スタック。
   注：スタックをブラウズ中にのみ焦点が合っているゾーンが移動する必要があります。次のステップは、異なる画像からピントが合っている情報の回復で構成されているので正確な位置合わせは、最も重要なことです。
3. フィールド^19、ImageJのプラグインの拡張深さを使用してフォーカスされている情報をマージします。これは、最終的に画像のスタックから単一の画像を生成します。いくつかの設定は、被写界深度の回復中に使用されるが、画像情報を保存するために、最高の設定を使用することができます。
   注：傾斜シリーズは、現在のチルト角毎に単一の画像、スルー焦点画像から回収された合焦情報を含む各画像から構成されています。
4. データを処理します。
   注：データは現在、標準的なチルトシリーズに還元されているので、アライメント・復興のための標準ツールを使用することができます。このプロトコルでは、TomoJは私たちですデータのアライメントおよびデータ再構成^20、21のためのエド。 TomoJを使用する方法についての詳細は、元の出版物²²に記載されています。
5. チルトシリーズのファインアライメントを実行します。
   注：良い戦略を正確に画像間のシフトを追跡するための基準マーカーとしての金のビーズを使用することです。金ビーズをサンプルに添加することができない場合、極小値を使用することもできます。
6. 整列されたデータの3D再構成を実行します。いくつかのアルゴリズムは、利点と制限が各実空間またはフーリエ空間に再構成を行うために利用可能です。
7. チルトシリーズの最終的な位置合わせが悪い場合は、最初の手順を最適化することにより、いくつかの改善を行います。最終的な3D再構成がぼやけたり変形していると思われる場合は、アライメントの手順を繰り返します。実際には、収集した焦点面のより多くの、より良いコントラストと3D再構成の詳細。
   注：セveralソフトウェアプログラムを介して焦点チルト系列を処理するために使用することができます。しかし、このプロトコルで使用されるツールが選ばれたので、私たちの経験では、彼らは最高の行わ。 Turboreg ^18は、フォーカスの勾配が存在したときに画像を整列させるという点で優れた性能を発揮しました。さらに詳しい情報は専用ウェブサイト²³上で見つけることができます。他のツールは、可視ピクセルの変更が生じたのに対し、フィールドのプラグイン¹⁹の拡張深さは、異なる画像からの合焦情報を回復するという点で非常に好調に推移しました。詳細については、特にに関するスクリプトの書き込みは、この専用のウェブサイト²⁴上で見つけることができます。

Representative Results

我々の研究では、電子が電界放出銃の透過型電子顕微鏡で200 kVのに加速しました。画像は、20マイクロ秒の滞留時間を用いてSTEMのBFモードで収集しました。スルー焦点チルトシリーズのデザインに関しては、我々は750nmの厚さの生物学的サンプルであっても、電子ビームの被写界深度があったものののみの超微細構造研究のために満足のいく結果が得られた150nmでのフォーカス間隔を見つけました3 NM-ので、私たちは25 mradでの非常に大きな収束半角を使用。

このレポートで分析されるサンプルは、 トリパノソーマ 、その鞭毛このオルガネラが著しく哺乳類²⁵に原生生物から保存されているので、集中的に研究されている単細胞真核生物です。細胞は、試料調製プロトコルで提示として扱われ、我々はT.ブルセイ （の鞭毛ポケットに構造解析を焦点を当てていました図2B、C、及びD）。収集した画像では、焦点が合っているゾーンが薄く表示され、画像のほとんどは、制限のための被写界深度のぼやけています。合焦情報のマージは収集した画像上で実行され、合焦ゾーンがはるかに広い単一の画像、（ 図2E）を生成されます。

合焦情報の統合は、より良好なスルーフォーカルチルト系列画像（ 図2F、G、及びHの白画素）の高周波数領域を強調表示することによって視覚化することができます。 ImageJのコマンド「エッジを探すには、「私たちでした本研究で編。このコマンドは、隣接画素強度の変化を検出するために、ソーベルフィルタを使用しています。検出された高周波領域の変位は、他の1つの画像から観察することができます。合焦情報がマージされた画像では、高い周波数では、画像（ 図2I）のほとんどに及びます。この方法は、スルー焦点チルトシリーズの良い処理の検証を可能にします。

スルーフォーカル傾斜シリーズを使用して、余分な合焦情報を収集し、3次元再構成プロセスの間に使用されます。これは、より大きなコントラストとSNRを生成し、被写界深度の制限画像¹⁵の3次元再構成で観察されたぼかし効果を低減します。フーリエ空間では、余分な情報のみ焦点面^13に収集される古典的な傾斜シリーズ収集方式に比べて回収されます。全3を通して全体的に、品質D再構成は、古典的なチルトシリーズの収集方式に比べてより等方性です。

図1： 生体試料調製プロトコルの異なるステップを示す画像。試料調製プロトコルは、4つの主工程に分けることができます。サンプルは、A）パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドで固定し、B）四酸化オスミウムで後固定し、酢酸ウラニル、Cと対比）エタノール、およびDで脱水）樹脂中に埋め込まれています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

被写界深度の回復の検証。被写界深度の回復は、傾斜試料の画像で確認することができます。 A）0°の傾きで、いくつかの詳細は、樹脂包埋T.ブルセイ細胞のべん毛ポケット（フラグポケット）で観察することができます。べん毛ポケットは、細胞質（CYT）に位置しており、基礎体（BB）は、鞭毛膜に鞭毛（旗）をアンカーされています。電子顕微鏡で70°で傾斜同じ鞭毛ポケットのB、C、およびD）三画像は、取得されました。それらは、300nmのフォーカス間隔で採取しました。 E）この画像は、これらの画像はに「探すエッジ」コマンドを使用して計算されたフィールドImageJのプラグインの拡張深さによって生成され、B、C、およびD、F、G、H、およびI）の合焦情報が含まれていましたhighlするためにはImageJそれぞれB、C、D、及びEに含まれる高周波数情報IGHT。白画素は、合焦情報に対応し、高周波数を表します。スケールバーは250nmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル1. このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

この記事では、スルー焦点断層撮影STEMを使用して厚い生物学的サンプルに3D解析を実行するためのステップバイステップのガイドと一緒に、従来の試料調製プロトコルを提示します。生体試料の樹脂埋め込みが何十年²⁶のために使用されており、試料の異なる種類に適合される代替のプロトコルは文献²⁷を通して見ることができます。対照的に、スルーフォーカスの方法を用いてSTEMに厚い標本を撮像すると、新しい仕事であり、それはより普及した方法は、ほとんど改善されます。

この研究の目的は、試料調製プロトコルを記述するためであり、より具体的には、現在利用可能な装置とSTEMで傾斜シリーズ取得焦点を通って、妥当な時間内に行うための撮影条件。このため、大型のフォーカス間隔を使用しました。実際、どれだけ近いかについてのコンセンサスはありません焦点面はスルー焦点チルトシリーズのためにSTEMと厚い試料を画像化するためにする必要があります。これは通常、STEM像を収集するのに数秒を要し、全体従来のチルトシリーズが完了するまでに時間がかかることがあります。概念実証として、画像の数百または数千を収集することが可能です。しかし、長い収集時間は、日常的な使用には適していないことは明らかです。そのような長時間の実験を設計する際に、ビーム安定性、試料ドリフトを考慮しなければなりません。さらに、長い収集時間は、蓄積された電子線量の問題を提起します。このため、当分の間、スルー焦点チルト・シリーズは、主に必要な実質的な電子線量のような樹脂包埋された生物学的サンプルまたは無機材料などの光耐性のサンプル、の研究のためにのみ適してSTEM。そのため、取得時間と最終的な3D再構成の品質の間のトレードオフのため、我々は、高解像度が必要とされていないプロジェクトのいくつかのスルー焦点間隔を使用することをお勧めしますND我々は高解像度が要求されるプロジェクトでスルー焦点間隔のより多くの量を使用することをお勧めします。

理由は、その目新しさのこの方法での具体的な手順についてのコンセンサスの欠如があります。しかし、いくつかのステップは、STEMスルーフォーカル傾斜シリーズデータセットから、高品質の再構成のために重要であることは明らかです。スルー焦点画像コレクション^{13、14、15の情報が} 3元の記事で指摘したように、まず、各傾斜角度における焦点画像の位置合わせは、慎重に実行する必要があります。様々な焦点値で収集した画像は、共通の情報を共有していないにもかかわらず、Turboregは、画像の正確な、自動アライメントに適したソリューションのまま。第二に、このプロトコルで実行されるように、焦点画像の統合は、簡単にチルト系列ALIGNによって処理された傾斜角ごとに単一の画像を生成するという利点を有しますメントおよび3D再構築ソフトウェアプログラム。フィールドプラグインの拡張深さは、最初に光学顕微鏡像のために設計されました。それにもかかわらず、電子顕微鏡写真²⁸からの合焦情報をマージするための最善の解決策であるように思われます。別の解決策は、同様にホーブデンらによって行われたものに、傾斜角度ごとに複数の画像を持つ単一のチルト系列データセットとして画像のセット全体を考慮することです。 ¹³とダーメンら。 ^14。これは、フーリエ変換に基づく再構成アルゴリズム¹³またはダーメンらによって開発されたEttentionを使用する必要があります。 ²⁹とその実空間における様々な焦点値で収集した画像から3Dボリュームを再構築することができる唯一の3D再構築ソフトウェアです。注目すべきは、このような代替ソリューションが混乱RESUが生じる可能性があり、焦点方向（Z軸）に余分なアライメント工程を、必要としますダーメンらに説明したように、画像収集時に選択されたデフォーカス間隔と矛盾しているLTS。 ^14。合焦情報のマージは、このプロトコルで提示されるように、データがそれによってZ方向にこの余分なアライメント工程を回避する、平行を使用して収集されたかのように画像を生成するという利点を有します。

スルーフォーカル傾斜シリーズ方法は（1ミクロン程度）の厚さの試料を研究するために開発されてきました。これらの方法の主な制限は、電子ビームは、試料に浸透することができないので、彼らは、数ミクロンより厚い試料を研究するために使用することができないことです。この制限は、加速電圧に依存している電子の平均自由行程、から来ています。非常に高い電圧（すなわち、1000 kVの）電子顕微鏡は、真核細胞^30を画像化するために使用することができるにもかかわらず、非常に厚いサンプルはまだそのようなfocuseのような他の技術の使用を必要としますDイオンビームまたはシリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡^31、32。しかしながら、これらの方法は、方法の切削深さとして定義され、Z軸は、X軸、Y-軸に等価ではないため、画像のスタックを考慮することができる異方性の再構成を生成します。これらの技術は、高解像度の研究のために使用することができません。

2014年と2015年に、3元の記事には厚手のサンプル^{13、14、15を}撮像するためのさまざまな方法を報告しました。それ以来、唯一のいくつかの研究は、厚いサンプル^33を研究するために、これらの方法のいずれかを使用しています。方法の改善は、STEMにスルー焦点イメージングを一般化するのに役立ちます。特に生命科学において、スルーフォーカスの方法は、極低温条件下で試料を観察するために最適化される必要があります。極低温のサンプルがあるので、これは大きな課題であり、特に電子投与量に敏感であり、スルーフォーカスの方法は多くの画像を必要とします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P4417
Ethanol	Sigma-Aldrich	2860
Epoxy resin	EMS	14120
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Osmium Tetroxyde	EMS	19150
Uranyl Acetate	Sigma-Aldrich	73943
Gelatin Capsule	EMS	70110
Triming and Histo knives	LFG Distribution	Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid	LFG Distribution	G200-Cu
Grid Coating Pen	LFG Distribution	70624
Specimen Holder	JEOL	EM-21311 HTR
Electron Microscope	JEOL	JEM-2200FS