Introduction
Depuis le début des années 1970, la tomographie par des approches en microscopie électronique à transmission (MET) ont été largement utilisés pour la caractérisation structurale des échantillons biologiques 1, 2, 3. L'appel de la tomographie d'émission d'électrons est qu'il pourrait être utilisé pour étudier un grand nombre de structures biologiques à l'échelle du nanomètre, de l'architecture des cellules et organites l'ultrastructure de la structure des complexes macromoléculaires et des protéines. Néanmoins, la tomographie d'émission d'électrons ne peut pas être utilisé pour étudier des échantillons très épais (supérieur à 0,5 um). En effet, les spécimens épais produisent trop d'électrons dispersés, générant faible rapport signal sur bruit (SNR) images. En outre, la tomographie implique la collecte d'images de spécimens basculées, l'épaisseur apparente de l'échantillon augmente avec l'angle d'inclinaison. Même si la diffusion inélastique peut être filtréeà l'aide de filtres d'énergie, la quantité critique d'électrons nécessaires pour les images SNR élevé est atteint à peine en TEM. Par conséquent, les échantillons biologiques épais ont seulement été étudiés en utilisant sectionnant 4.
Certains échantillons ne peuvent pas être tranchés: certains pourraient se dégrader quand ils sont coupés, et d'autres doivent être étudiées dans leur intégralité afin de comprendre leur complexité. Une autre approche consiste à utiliser TEM en mode 5, 6, 7, 8 numérisation. En microscopie électronique à balayage en transmission (STEM), le trajet optique des électrons est différente de celle TEM classique. Electrons passant à travers l'échantillon sans diffusion peuvent être collectées sur l'axe optique avec un champ lumineux (BF) détecteur 9, alors que ceux dispersés élastiquement peuvent être collectées à un certain angle par rapport à l'axe optique avec un détecteur de champ foncé (DF).L'autre avantage de STEM est que le faisceau d'électrons focalisé est balayé sur la surface de l'échantillon, ce qui permet la collecte de pixel par pixel des images. Même si le faisceau d'électrons élargit en passant à travers l'échantillon 10, ce système de collecte particulier est moins sensible aux électrons inélastique que TEM conventionnel. En outre, il n'y a pas d'objectif post-spécimen STEM, évitant ainsi les aberrations chromatiques qui peuvent survenir dans TEM. La longueur de la caméra peut être réglée de telle sorte que le détecteur de BF détecte principalement les électrons non dispersés. En utilisant le détecteur DF pour étudier des échantillons épais est pas recommandé en raison de la diffusion multiple, qui produit des images inexactes. Au lieu de cela, le détecteur de BF peut être utilisé 11. Alors que STEM peut produire des images SNR élevés, il a une relativement faible profondeur de champ en raison de la convergence de faisceaux relativement élevé par rapport à TEM, ce qui diminue la quantité d'informations en profondeur qui peut être récupéré à partir d'épaisseurspécimens. Dans le cas des microscopes SOUCHES aberration corrigée, où l'angle de convergence peut être aussi élevé que 30 mrad, la profondeur de champ-peut être suffisamment faible pour que l'information qui est mise au point provient d'un plan focal de seulement quelques nanomètres . La mise en place du faisceau d'électrons en mode parallèle augmente la profondeur de champ du faisceau d'électrons , au détriment de la résolution 12. Cependant, cette configuration est pas toujours possible.
Chaque fois qu'il est nécessaire d'utiliser un faisceau d'électrons convergent, on doit employer des techniques qui améliorent la profondeur de champ du faisceau d'électrons lorsque l'on étudie des échantillons épais. Des études récentes ont rapporté l'acquisition de plusieurs images à différents plans focaux à travers l'échantillon pour récupérer le maximum d'informations de mise au point 13, 14. Les deux études décrivent différentes façons de traiter les informations provenant des différents plans focaux. Hovden et al.combinés dans l' espace de Fourier les images qui ont été recueillies à divers plans focaux, et la reconstruction finale a été obtenue directement à partir de l'inverse 3D transformée de Fourier 13. En revanche, Dahmen et al. développé un moteur de reconstruction du faisceau convergent pour reconstruire dans l' espace réel le volume 3D à partir des différents plans focaux 14. Notre laboratoire a également développé une méthode pour l'imagerie des échantillons biologiques épais. Notre stratégie était différente des deux méthodes décrites ci - dessus en ce que nous avons fusionné l'information qui est mise au point dans les différents plans focaux et reconstruit le volume 3D finale dans l' espace réel à l' aide d' un projecteur de faisceau parallèle 15. Notre objectif était de développer une méthode qui peut facilement être effectuée dans un laboratoire de microscopie électronique. À cette fin, nous avons cherché à recueillir des images de liaison en une quantité limitée de temps comparable à la période des expériences de tomographie conventionnelle. En outre, notre méthode proposée could être adapté pour être utilisé avec différents types d'alignement et d'un logiciel de reconstruction.
Dans le cadre de notre publication à partir de 2015 15, nous voulions visualiser et caractériser la récupération de la profondeur de champ, nous avons donc utilisé un demi-angle de 25 mrad grande convergence. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour effectuer par focale imagerie STEM selon la méthode développée dans notre laboratoire en 2015 15, et nous présentons comment les données de 2015 ont été traitées. Cette méthode récupère les informations de mise au point de plusieurs plans focaux à travers un (750 nm) échantillon biologique épais et permet des reconstructions 3D de haute qualité. Le cas échéant, les différences dans cette méthode par rapport aux méthodes utilisées par d'autres groupes sont également présentés.
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Protocol
Attention: Consultez les fiches de données de sécurité (FDS) des différents réactifs avant de les utiliser. Plusieurs des produits chimiques utilisés lors de la préparation de l'échantillon sont toxiques, cancérigènes, mutagènes et / ou reprotoxiques. Utiliser un équipement de protection individuelle (gants, blouse, pantalon pleine longueur et des chaussures fermées) et de travailler sous une hotte lors de la manipulation de l'échantillon. Sectionnement l'échantillon avec un ultramicrotome implique l'utilisation d'instruments tranchants, et l'utilisation judicieuse de ces outils est obligatoire. Dans les étapes décrites ci-dessous, les auteurs supposent que l'échantillon est un échantillon de culture cellulaire. Le protocole peut devoir être modifiée selon le type d'échantillon, en particulier les étapes de centrifugation.
1. Préparation des tampons et des mélanges
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4 et 1,76 mM de KH 2 PO 4).
- Préparer des solutions contenant 30%, 50% et 70% etHanol dans du PBS pour l'échantillon déshydratation. Effectuer échantillon déshydratation par incubation progressivement l'échantillon dans l'augmentation des concentrations d'éthanol.
- Préparer la résine époxy en mélangeant le bisphénol-A (épichlorhydrine) (20 ml), de l'anhydride dodécénylsuccinique (9 ml), la méthyl-5-norbornène-2,3-dicarboxylique (11 ml) et de 2,4,6-tris ( diméthylaminométhyl) phénol (0,7 ml); d'autres rapports de mélange peuvent être utilisés en fonction de la dureté désirée de la résine.
- Préparer des solutions contenant 30%, 50%, et une résine époxy 70% dans l'éthanol pour l'échantillon enchâssement. Effectuer enrobage de résine en incubant progressivement l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine.
NOTE: Les volumes des solutions préparées dépendent du type d'échantillon qui est étudié. Plusieurs solutions sont nécessaires pour les tissus que pour les cultures cellulaires.
2. Fixation et Coloration de l'échantillon
- Centrifuger la culture cellulaire pendant 5 min à 5000 x g. Effectuer toutes les centrifugations suivantes en utilisant les mêmes conditions.
- Jeter le surnageant et on fixe le culot de cellules en remettant en suspension dans du PBS (1 ml) avec du paraformaldehyde à 4% et 2% de glutaraldéhyde. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes (figure 1A). Vous pouvez également fixer les cellules à 4 ° C pendant la nuit ou le week-end.
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer complètement les agents fixants.
- Post fixer l'échantillon avec 1% de OsO 4 dans du PBS (1 ml) pendant 30 min à température ambiante.
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer complètement le OsO 4. Désactiver l'OSO 4 dans l' huile et le rejet.
- Ajouter 2% d' acétate d'uranyle dans de la PBS (1 ml) en tant qu'agent de contraste et laisser incuber l'échantillon pendant 30 min à température ambiante (figure 1B).
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot 3 fois avec du PBS (1 ml) pour éliminer l'uranyle ac non liéeetate; l'acétate d'uranyle contient des éléments radioactifs et doivent être éliminés dans un bac dédié aux déchets radioactifs.
REMARQUE: Les durées d'incubation peuvent être modifiées en fonction de la taille de l'échantillon. Par exemple, la fixation et la coloration des échantillons plus épais, comme un échantillon tissulaire, nécessitent de plus longues durées d'incubation. Des durées d'incubation peuvent également être mieux pour la déshydratation et les étapes d'incorporation. l'acétate d'uranyle peut être remplacée par une solution «uranyle-less" qui contient des sels de gadolinium.
Déshydratation 3. Sample
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et on incube l'échantillon pendant 30 min à 4 ° C dans du PBS (1 ml) avec 30% d' éthanol (figure 1C).
- Répétez l'étape 3.1 en utilisant des solutions avec des concentrations progressivement croissantes d'éthanol (50%, 70% et jusqu'à 100%). Au cours de ces étapes de déshydratation, de maintenir l'échantillon à 4 ° C à des fins de conservation de l'échantillon.
- Après centrifugation, jeter le supernatant et resuspendre le culot dans de l'éthanol pur (1 ml); incuber une nuit à 4 ° C.
4. Résine Embedding
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans de l' éthanol avec de la résine époxy à 30% (1 ml) pendant 30 min à température ambiante (figure 1D).
- Répétez l'étape 4.1 en utilisant des solutions avec des concentrations de résine époxy augmentant progressivement (50%, 70% et jusqu'à 100%).
- Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans une résine époxy pur (1 ml); incuber une nuit à température ambiante. La présence de durcissement DMP-30 pourrait déclencher la polymérisation de la résine; si tel est le cas, de préparer deux lots de résine époxy, une avec et une sans DMP-30.
- Après centrifugation, remise en suspension du culot dans 200 pl de résine époxy pur (contenant le durcisseur) dans une capsule en matière plastique; l'échantillon doit être au fond de la capsule en matière plastique.
5. Résine Polymérisation
- jencubate la capsule en plastique contenant l'échantillon dans un incubateur réglé à 60 ° C pendant 48 h; d'autres types de résine peuvent polymériser avec des paramètres différents.
- Retirer la capsule de l'incubateur et vérifier que la résine a polymérisé; la résine doit être difficile si elle est pressée contre une surface dure.
- Ajouter une résine époxy pur (contenant le durcisseur) au-dessus de la résine polymérisée contenant l'échantillon; cette couche supplémentaire de résine, il sera plus facile à couper l'échantillon. Incuber la capsule à 60 ° C pendant 48 heures.
Sectionnement 6. Sample
- Monter l'échantillon à l'envers dans un porte-échantillon de telle sorte que l'échantillon est vers le haut et la fixer sur le bloc de coupe de l'ultramicrotome. verrouiller fermement le levier pour fixer le bloc de coupe à l'ultramicrotome.
- En utilisant une lame de rasoir ou un instrument similaire tranchant, découper la capsule en plastique pour le séparer de la résine polymérisée. Découper la résine de telle sorte que l'échantillon contiented en résine dans à peu près la forme d'une pyramide. Il n'y a pas besoin de retirer la capsule en plastique ensemble; seulement enlever la partie couvrant l'échantillon polymérisé.
- Prenez la capsule et le porte-échantillon hors du bloc de coupe et les installer sur le bras mobile de l'ultramicrotome.
- Installez un couteau de coupe sur le bloc de couteau et couper avec précision les faces de la pyramide. L'utilisation de jumelles est conseillé de donner une forme parfaite à la pyramide; mieux la pyramide, plus les sections seront.
- Enlever le couteau coupe et le remplacer par un couteau d'histologie qui peut être utilisé pour couper des sections qui sont plus épais que 0,5 um.
- Après avoir rempli la cuvette du couteau d'histologie avec la bonne quantité d'eau, amener le bord de coupe du couteau à la surface de l'échantillon et utiliser les jumelles pour régler l'angle d'inclinaison de la capsule de sorte que le couteau trancher perpendiculairement à la pyramide.
- Ajuster la vitesse de coupe souhaitée en fonction de lal'épaisseur de coupe pour récupérer des sections homogènes.
- Laissez la section flottant sur l'eau et les poissons avec une boucle.
- Déplacer la boucle en direction d'une grille de cuivre en microscopie électronique qui a été placé sur le dessus du papier filtre.
NOTE: La grille doit avoir été préalablement traitée pour augmenter son hydrophilie. Ceci peut être effectué avec un stylo à grille revêtement. - En raison de l'absorption d'eau par le papier filtre, laissez la section coller à la grille. Laissez sécher pendant quelques minutes avant de l'insérer dans le microscope électronique.
7. Conception du Tilt-série Through-focale
- Collecter des images par le biais-focaux à intervalles de discussion constants.
NOTE: L'inclinaison de la série grâce à focale se composent d'un ensemble d'images par le biais-focaux qui sont collectées à chaque angle d'inclinaison de l'inclinaison de la série. Toute amplitude de mise au point doit être suffisante pour couvrir la totalité de l'épaisseur de l'échantillon. - Déterminer la valeur de l'intervalle de mise au point. Si l'intervalle est égal à la depth de champ, de recueillir l'ensemble de l'échantillon au point; ce paramètre représente le plus haut possible l'échantillonnage. Si l'intervalle est supérieur à la profondeur de champ, certaines parties de l'échantillon ne sont pas acquises au point, ce qui signifie que certaines parties de l'échantillon ne sont pas collectées dans le foyer.
- Calculer la profondeur de champ d'un faisceau d'électrons à partir de la longueur d'onde de l'électron et la convergence demi-angle du faisceau d'électrons. Tandis que la longueur d' onde d'électrons est directement liée à la tension d'accélération, utiliser le demi-angle de convergence fourni par le fabricant au microscope électronique ou à déterminer expérimentalement à partir du motif de diffraction d'un échantillon connu 16. Parce que les électrons accélérés à une longueur d'onde λ de frapper l'échantillon avec un demi-angle de α de convergence dans un microscope électronique, utiliser l'équation suivante pour déterminer la profondeur de champ (DOF):
- Conceptionla série focale de sorte que toute l' amplitude de mise au point portera sur l'échantillon à son épaisseur apparente maximale (ie, à son plus haut inclinaison).
REMARQUE: Un échantillon de 0,75 um d'épaisseur aura une épaisseur apparente de 2,19 um à une inclinaison de 70 °, de sorte que l'amplitude de la mise au point doit être supérieure à 2,19 um. Pour cet exemple, si l'intervalle de mise au point déterminé ci-dessus est égale à 50 nm, il faudra 44 images (2.19 pm / 50 nm) pour couvrir l'échantillon à son épaisseur maximale apparente. L'ensemble de l'amplitude de mise au point est égale à la valeur de l'intervalle de mise au point, multipliée par le nombre d'étapes d'intervention. Au plus haut inclinaison (θ), l'épaisseur apparente de l'échantillon est défini comme suit:
Imaging 8. Sample
NOTE: Il est hors de la portée de ce protocole pour décrire comment mettre en place un microscope électronique en mode STEM; la plupart de ces informations peuvent être trouvées in le manuel de référence fourni par le fabricant de microscope électronique. Cependant, notez ce qui suit: i) la taille du spot doit être choisi en fonction du grossissement souhaité; ii) l'Ronchigram doit être bien aligné; et iii) en mode BF, la longueur de la caméra doit être ajustée pour sélectionner des électrons non dispersés, tout en maintenant un bon éclairage du détecteur. sections de résine déposée sur la microscopie électronique des grilles de cuivre devraient être éclairés avant l'acquisition d'image pour empêcher le retrait. retrait de la résine et les effets de charge pourraient être confondus lors de l'acquisition d'image. L'utilisation d'une ouverture de l'objectif pourrait améliorer la stabilité échantillon lorsque les effets de charge se produisent. Cependant, dans le cas spécifique des configurations SOUCHES, l'ouverture de l'objectif n'est pas compatible avec le mode d'imagerie HAADF, et de très petites ouvertures objectives ne sont pas compatibles avec le mode d'imagerie BF.
- En utilisant un faible grossissement (environ 20,000X en STEM), naviguer à travers l'échantillon et de localiser la région d'intérêt.
- Régler til eucentrique hauteur (axe Z) de sorte que la région d'intérêt ne dérive pas de distance tout en faisant tourner l'échantillon.
- Vérifiez que l'objet d'intérêt restera visible sur toute la plage d'inclinaison.
- En raison du nombre important d'images acquises au cours d'une inclinaison de la série grâce à focale, utilisez un logiciel automatique de collecte. Soit utiliser une solution commerciale ou de concevoir un logiciel de collecte de données personnalisée si vous le souhaitez. Assurez-vous que le logiciel est capable d'exécuter les trois étapes suivantes:
- Suivre et se concentrer comme dans un système de collecte d'inclinaison de la série standard.
- Faire en sorte que les images se chevauchent à travers focale avec la position Z de l'échantillon.
- acquérir automatiquement une série d'images par le biais de focale à chaque angle d'inclinaison.
- Donnez le logiciel les principaux paramètres de l'inclinaison de la série grâce à focale (c. -à- intervalles correspondants, étape focale, l' angle d'inclinaison minimum, l' angle d'inclinaison maximale, l' étape d'inclinaison, et la vitesse de balayage).
- Débutle processus et de collecte d'images attendre le logiciel pour terminer.
Traitement 9. Image
NOTE: Dans ce protocole, le traitement tilt-série à travers focale est effectuée en utilisant ImageJ plugins 17. Données supplémentaires 1 montre une macro ImageJ pour l'étape d'alignement (Turboreg) et pour la fusion des informations de mise au point (profondeur de champ) pour une inclinaison de la série grâce à focale conçu avec trois valeurs de mise au point.
- Alignez les images recueillies dans le même angle d'inclinaison (ie, les images par le biais-focaux). Comme les images ne sont pas les mêmes informations de mise au point, ils ne pas héberger les mêmes caractéristiques pour l'alignement; procéder à l' alignement en alignant les images voisines deux par deux ( à savoir, suite à une hiérarchie pyramidale, avec les valeurs de discussion les plus proches premiers) en utilisant Turboreg 18, un plugin ImageJ.
- Toujours vérifier l'alignement des images par le biais-focaux à chaque angle d'inclinaison.Empilez les images par le biais-focaux alignés pour améliorer l'inspection visuelle.
NOTE: Seule la zone qui est mise au point doit se déplacer tout en naviguant à travers la pile. Un alignement précis est la chose la plus importante, puisque l'étape suivante consiste à la récupération de l'information qui est mise au point à partir de différentes images. - Fusionner l'information qui est mise au point en utilisant profondeur de champ 19, un plugin ImageJ; ce qui finira par générer une seule image à partir de la pile d'images. Plusieurs paramètres peuvent être utilisés lors de la reprise de la profondeur de champ, mais utilisent les réglages les plus élevés pour préserver les informations d'image.
NOTE: L'inclinaison de la série est maintenant composé d'une seule image par angle d'inclinaison, chaque image contenant les informations de mise au point récupéré des images par le biais-focaux. - Traiter les données.
REMARQUE: les outils standards pour l'alignement et la reconstruction peut être utilisé depuis que les données ont maintenant été réduit à une inclinaison de la série standard. Dans ce protocole, nous TomoJ ested pour l' alignement des données et à la reconstruction de données 20, 21. Plus de détails sur la façon d'utiliser TomoJ peuvent être trouvés dans la publication originale 22. - Effectuer l'alignement de l'inclinaison de la série.
NOTE: Une bonne stratégie consiste à utiliser des billes d'or comme marqueurs de référence pour suivre avec précision les changements entre les images. minima locaux peuvent également être utilisés si des billes d'or ne peuvent pas être ajoutés à l'échantillon. - Effectuez une reconstruction 3D des données alignées; plusieurs algorithmes sont disponibles pour effectuer les reconstructions dans l'espace réel ou de l'espace de Fourier, chacune ayant ses avantages et ses limites.
- Si l'alignement final de l'inclinaison de la série est pauvre, apporter quelques améliorations en optimisant les étapes initiales. Réitérer les étapes d'alignement si la reconstruction 3D finale apparaît floue ou déformée; dans la pratique, plus le nombre de plans focaux recueillis, mieux le contraste et les détails de la reconstruction 3D.
NOTE: Sedes programmes logiciels peuvent être utilisés sieurs pour traiter l'inclinaison de la série traversants focale. Cependant, les outils utilisés dans ce protocole ont été choisis parce que, dans notre expérience, ils ont joué le meilleur. Turboreg 18 fait mieux en termes d'alignement des images quand un gradient de concentration était présent. Plus d' informations peuvent être trouvées sur le site dédié 23. La profondeur étendue du plug - in Zone 19 a très bien performé en termes de récupération des informations de mise au point à partir de différentes images, alors que d' autres outils ont abouti à pixels visibles modifications. Plus d' informations, en particulier en ce qui concerne l' écriture de scénario, peut être trouvé sur ce site dédié 24.
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Representative Results
Dans notre étude, les électrons sont accélérés à 200 kV dans le microscope électronique à transmission du pistolet à émission de champ. Les images ont été recueillies en mode STEM de BF en utilisant un temps de séjour de 20 ms. En ce qui concerne la conception de l'inclinaison de la série par le biais-focal, nous avons constaté que les intervalles de mise au point de 150 nm ont donné des résultats satisfaisants pour l'étude ultrastructurale d'un échantillon-même 750 nm d'épaisseur biologique si la profondeur de champ-du faisceau d'électrons était seulement 3 nm puisque nous avons utilisé une convergence très grande semi-angle de 25 mrad.
L'échantillon analysé dans le présent rapport est Trypanosoma brucei, un eucaryote unicellulaire dont flagelle est intensivement étudiée car cet organite est remarquablement conservé des protistes aux mammifères 25. Les cellules ont été traitées tel que présenté dans le protocole de préparation des échantillons, et nous nous sommes concentrés sur l'analyse structurelle de la poche flagellaire de T. brucei (
La fusion des informations de mise au point peut être mieux visualisé en mettant en évidence les zones de haute fréquence des images par le biais de focale tilt-série (pixels blancs dans la figure 2F, G et H). La ImageJ commande "Trouver Edges" nous a étéed dans la présente étude. Cette commande utilise un filtre Sobel pour détecter les changements dans les intensités des pixels voisins. Le déplacement de la zone à haute fréquence détectée peut être observée à partir d'une image à l'autre. Sur l'image où les informations de mise au point a été fusionné, les hautes fréquences couvrent la majeure partie de l'image (Figure 2I). Cette méthode permet la vérification du bon traitement de l'inclinaison de la série par le biais-focal.
Utilisation par le biais-focal tilt-série, des informations supplémentaires de mise au point sont collectées et utilisées pendant le processus de reconstruction 3D. Cela produit un plus grand contraste et SNR et réduit les effets de flou observés dans les reconstructions 3D de profondeur de champ limitée dans les images 15. Dans l' espace de Fourier, des informations supplémentaires est récupéré par rapport à un système de collecte d' inclinaison série classique, où seulement sur le plan focal est recueilli 13. Dans l'ensemble, la qualité dans l'ensemble 3reconstruction de D est plus isotrope par rapport à un système de collecte d'inclinaison série classique.
Figure 1: Tableau montrant les différentes étapes du protocole de préparation de l' échantillon biologique. Le protocole de préparation d'échantillon peut être divisé en quatre principales étapes. L'échantillon est A) fixé paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde, B) de post-fixes dans du tétroxyde d' osmium et en contraste avec l' acétate d'uranyle, C) dans de l' éthanol déshydraté et D) noyée dans la résine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Supplemental 1. Fichier S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans cet article, nous présentons un protocole de préparation d'échantillon classique avec un guide étape par étape pour effectuer une analyse en 3D sur des échantillons biologiques épais en utilisant STEM par focale de positons. Enrobage de résine de spécimens biologiques a été utilisé pendant des décennies 26, et d' autres protocoles qui sont adaptés aux différents types d'échantillons peuvent être trouvés dans la littérature 27. En revanche, l'imagerie épais spécimens STEM en utilisant des méthodes de mise au point par le biais est une nouvelle entreprise, et les méthodes seront très probablement être améliorés car il devient plus répandue.
Le but de ce travail était de décrire un protocole de préparation des échantillons et, plus spécifiquement, les conditions d'imagerie pour effectuer grâce à focale acquisition inclinaison série STEM avec un équipement qui est actuellement disponible et dans un laps de temps raisonnable. Pour cette raison, de grands intervalles de discussion ont été utilisés. En effet, il n'y a pas de consensus sur la proximité de laplans focaux devraient être pour l'imagerie d'un épais spécimen avec STEM pour par-focal tilt-série. Il faut généralement plusieurs secondes pour recueillir des images SOUCHES, et toute une série d'inclinaison classique peut prendre des heures pour terminer. Comme preuve de concept, il est possible de collecter des centaines voire des milliers d'images. Cependant, il est clair que de longs temps de collecte ne sont pas adaptés pour un usage quotidien. la stabilité du faisceau et de la dérive de l'échantillon doivent être pris en compte lors de la conception de ces expériences longues. De plus, les temps de collecte longues soulèvent la question de la dose d'électrons accumulée. Ainsi, pour le moment, par le biais STEM-focal tilt-série ne convient que pour l'étude des échantillons de faisceau résistant, tels que des échantillons biologiques résine embarqués ou des matériaux inorganiques, principalement en raison de la dose d'électrons substantielle nécessaire. En raison du compromis entre le temps et la qualité de la reconstruction 3D finale acquisition, nous vous recommandons d'utiliser quelques intervalles dans les projets par le biais focal où la haute résolution est pas nécessaire, unnd nous recommandons d'utiliser une plus grande quantité d'intervalles par focale dans des projets où haute résolution est nécessaire.
Il y a un manque de consensus sur les mesures spécifiques en raison de sa nouveauté dans cette méthode. Cependant, il est clair que plusieurs étapes sont essentielles pour les reconstructions de haute qualité à partir de STEM grâce à focale des ensembles de données d'inclinaison de la série. Tout d' abord, l'alignement des images focales à chaque angle d'inclinaison doit être soigneusement exécuté, comme l' a souligné dans les trois articles originaux décrivant par-focal collection d'images 13, 14, 15. Même si les images recueillies à diverses valeurs focales ne partagent pas l'information commune, Turboreg reste une bonne solution pour la précision, l'alignement automatique des images. Deuxièmement, la fusion des images focales, comme réalisé dans ce protocole, a l'avantage de générer une image unique par l'angle d'inclinaison, qui est facilement manipulé par toute align tilt-seriesment et le programme de logiciel de reconstruction 3D. La profondeur de champ étendue plug-in a été initialement conçu pour les images de microscopie optique; néanmoins, il semble être la meilleure solution pour fusionner les informations de mise au point à partir de micrographies électroniques 28. Une solution alternative est de considérer l'ensemble des images en un seul jeu de données tilt-série avec plusieurs images par l' angle d'inclinaison, de manière similaire à ce qui a été fait par Hovden et al. 13 et Dahmen et coll. 14. Cela nécessite l'utilisation d'algorithmes de reconstruction à base de Fourier 13 ou Ettention, qui a été développé par Dahmen et al. 29 et qui est le seul logiciel de reconstruction 3D qui peut reconstruire des volumes 3D à partir d' images collectées à différentes valeurs focales dans l' espace réel. Notamment, ces solutions de rechange nécessiteront une étape d'alignement supplémentaire dans la direction focale (axe Z), ce qui pourrait produire resu confusionlts qui sont incompatibles avec les intervalles de défocalisation choisis lors de la collecte d'images, tel que discuté dans Dahmen et al. 14. La fusion des informations de mise au point, tel que présenté dans ce protocole, a l'avantage de générer une image comme si les données ont été recueillies au moyen d'un parallèle, évitant ainsi cette étape supplémentaire d'alignement dans la direction Z.
Grâce à focale méthodes d'inclinaison de la série ont été développées pour étudier des échantillons épais (environ 1 um). La principale limitation de ces méthodes est qu'elles ne peuvent pas être utilisés pour étudier des échantillons plus épais que plusieurs microns, étant donné que le faisceau d'électrons ne peut pas pénétrer dans ces échantillons. Cette limitation provient du libre parcours moyen des électrons, qui dépend de la tension d'accélération. Même si de très haute tension ( par exemple, 1000 kV) microscopes électroniques peuvent être utilisés pour l' imagerie des cellules eucaryotes 30, des échantillons très épais nécessitent toujours l'utilisation d'autres techniques, telles que focused faisceau d'ions ou par microscopie série bloc-face électronique à balayage 31, 32. Cependant, ces procédés génèrent des reconstructions anisotropes qui peuvent être considérés comme des piles d'images parce que l'axe Z, qui est définie comme étant la profondeur du procédé de coupe, ne correspond pas à l'axes X et Y. Ces techniques ne peuvent pas être utilisées pour des études à haute résolution.
En 2014 et 2015, trois articles originaux ont rapporté différentes méthodes pour l' imagerie des échantillons épais 13, 14, 15. Depuis, seules quelques études ont utilisé l' une de ces méthodes pour étudier des échantillons épais 33. L'amélioration des méthodes aideront à généraliser l'imagerie grâce à focale en STEM. En particulier dans les sciences de la vie, grâce à focale méthodes doivent être optimisés pour l'observation des échantillons dans des conditions cryogéniques. Ceci est un défi majeur, car les échantillons cryogéniques sontparticulièrement sensible aux électrons dosage, et les méthodes de mise au point par le biais nécessitent de nombreuses images.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
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