Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

Published: March 12, 2017 doi: 10.3791/55215
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Introduction

1970'lerin başından beri, tomografi yaygın biyolojik örneklerin 1, 2, 3 yapısal karakterizasyonu için kullanılmıştır transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yaklaşımları. Transmisyon elektron tomografi Temyizinizi hücre mimarisi ve makromoleküler kompleksler ve proteinlerin yapı organellerin ultrastrüktürü arasında, nanometre ölçeğinde biyolojik yapıların geniş bir çalışma için kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, elektron tomografisi çok kalın örnekleri (daha büyük 0,5 um) incelemek için kullanılabilir olabilir. Nitekim, kalın örnekleri düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) görüntüler oluşturmak, çok dağınık elektronlar üretir. Buna ek olarak, tomografi eğim açısı ile artan numunenin belirgin kalınlıkta, eğimli örneklerin görüntüleri koleksiyonu içerir. Hatta inelastik saçılma filtre edilebilir olsa daEnerji filtreleri kullanarak, yüksek SNR görüntüler için gerekli elektron kritik miktarı ancak TEM ulaşılır. Bu nedenle, kalın biyolojik örnekler sadece 4 kesit kullanılarak incelenmiştir.

onlar kesilir bazı düşürebilir, ve diğerleri kendi karmaşıklığını anlamak için kendi bütünlüğü içinde çalışılması gereken: Bazı numuneler dilimlenmiş edilemez. Alternatif bir yaklaşım, tarama modu 5, 6, 7, 8 TEM kullanmaktır. transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tarayarak olarak, elektronların optik yol, geleneksel TEM farklıdır. Elastik dağılmış olan koyu alan (DF) detektörü ile optik eksenden belirli bir açı ile toplanabilir ise saçılma olmadan örnek geçen elektronlar, parlak-alan (BF) detektörü 9 optik eksen üzerinde toplanabilir.KÖK diğer avantajı odaklanmış bir elektron ışını görüntüleri piksel-piksel toplama sağlayan numunenin yüzeyi taranır olmasıdır. Numune 10 geçerken elektron ışını genişletir olsa da, bu özel koleksiyon düzeni geleneksel TEM daha esnek olmayan dağınık elektron daha az duyarlıdır. Ayrıca, bu suretle TEM oluşabilir kromatik sapmaları kaçınarak STEM hiçbir objektif sonrası numune vardır. BF detektörü esas unscattered elektronlar algılaması için Kamera boyu ayarlanabilir. Kalın örnekleri incelemek için DF dedektörü kullanılarak, çünkü yanlış görüntüler üretir çoklu saçılma, tavsiye edilmez. Bunun yerine, BF detektörü 11 kullanılabilir. KÖK yüksek SNR görüntüler üretmek mümkün olmakla birlikte, kalın elde edilebilir derinlemesine bilgi miktarını azaltarak, çünkü TEM kıyasla nispeten yüksek ışın yakınsama nispeten düşük derinliği-of-field vardırnumuneler. odakta bilgi sadece birkaç nanometre bir odak düzlemi kaynaklanan şekilde yakınsama açısı 30 Mrad kadar yüksek olabilir sapmaları düzeltilmiş KÖK mikroskobu, durumunda, derinliği alanı kadar düşük olabilir . Paralel mod elektron ışını ayarlama derinliğini alan elektron ışınının çözünürlüğü 12 zararına artırır. Bununla birlikte, bu kurulum her zaman mümkün değildir.

Bir yakınsak elektron demeti kullanımı için gerekli olan zaman, tek bir kalın örnekleri incelenirken derinliğini alan elektron ışını arttırmak teknikleri kullanmak gerekir. Son çalışmalar içinde odak bilgileri 13, 14 maksimum miktarda kurtarmak için numune boyunca çeşitli odak düzlemleri birden fazla görüntü alımını bildirdi. İki çalışmalar, farklı odak düzlemleri bilgi işlemek için farklı yolları açıklanmaktadır. Hovden ve diğ.Çeşitli odak düzlemleri toplanmıştır görüntüleri Fourier uzayında birleştirildi ve nihai imar 13 dönüşümü 3D ters Fourier doğrudan elde edilmiştir. Bunun aksine, Dahmen ve ark. Gerçek uzayda çeşitli odak düzlemleri 14 3D hacmini yeniden bir yakınsak ışın yeniden motorunu geliştirdi. Laboratuvarımız ayrıca kalın biyolojik örneklerin görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Bizim stratejimiz, biz çeşitli odak düzlemleri içinde odak olan bilgileri birleşti ve bir paralel ışın projektörü 15 kullanarak gerçek uzayda son 3D hacmini yeniden ki yukarıda anlatılan iki yöntemden farklı oldu. Amacımız, kolaylıkla bir elektron mikroskobu laboratuarda yapılabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, geleneksel tomografi deneylerin zaman çerçevesi ile karşılaştırılabilir zaman sınırlı bir miktarda, odak görüntüleri toplamak amaçlanmıştır. Ayrıca, önerilen yöntem chizalama ve yeniden yazılım farklı tipleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir ould.

2015 15 bizim yayın bağlamda, görselleştirmek ve derinliği alanının kurtarma karakterize etmek istedim, bu yüzden biz 25 mrad büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. Burada, 2015 yılında 15 laboratuvarda geliştirilen yönteme göre STEM yoluyla odak görüntüleme gerçekleştirmek için bir adım-adım protokolü mevcut ve biz 2015 verileri işlendi nasıl sunuyoruz. Bu yöntem kalın (750 nm) biyolojik numune boyunca birçok odak düzlemleri gelen odak bilgileri kurtarır ve yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon sağlar. Uygun durumlarda, diğer gruplar tarafından kullanılan yöntemlerden karşı bu metodoloji farklılıklar da sunulmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: kullanmadan önce çeşitli reaktif malzeme güvenliği veri sayfaları (MSDS) başvurun. Numune hazırlama sırasında kullanılan kimyasalların çeşitli ve / veya üreme için, toksik, kanserojen, mutajen bulunmaktadır. örnek işlerken davlumbaz altında kişisel koruyucu donanım (eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayak ayakkabılar) ve çalışmayı kullanma. Ultramikrotomla örnek kesit keskin aletlerin kullanımını gerektirir ve bu araçların dikkatli kullanılması zorunludur. Aşağıdaki açıklanan adımların, yazarlar örnek, bir hücre kültürü örneği olduğu varsayılmaktadır. Protokol örnek tipi, özellikle santrifüj adımlarına göre modifiye edilmesi gerekebilir.

Tamponlar ve Karışımların hazırlanması 1.

  1. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4 ve 1.76 mM KH 2 PO 4).
  2. % 30,% 50 ve% 70 et içeren çözümleri hazırlayınNumune dehidrasyon için PBS içinde HANOL. yavaş yavaş etanol konsantrasyonları artan inkübe edilmesiyle örnek dehidratasyon gerçekleştirin.
  3. (Süksinik anhidrür (9 mL), metil-5-norbornen-2,3-dikarboksilik (11 ml) ve 2,4,6-tris dodesenil bisfenol-A- (epiklorohidrin) (20 mL) karıştırılarak epoksi reçine hazırlanması dimetilaminometil) fenol (0.7 mL); Diğer karışım oranları reçine arzu edilen sertliğine bağlı kullanılabilir.
  4. Örnek yerleştirilmesi için etanol içinde% 30,% 50, ve% 70 epoksi reçine içeren çözeltiler hazırlayın. yavaş yavaş reçine artan konsantrasyonlarda ile inkübe edilmesiyle reçine katıştırma gerçekleştirin.
    NOT: Bu şekilde hazırlanan solüsyonlardan hacimleri incelenmiştir numune tipine bağlıdır. Daha çözeltileri hücre kültürleri için daha dokular için ihtiyaç vardır.

Örnek 2. Fiksasyon ve Renklendirme

  1. x g 5,000 5 dakika boyunca hücre kültürü santrifüj. aynı koşullar kullanılarak, aşağıdaki santrifüj tümünü gerçekleştirebilir.
  2. Süpernatant atılır ve% 4 paraformaldehid ve% 2 glutaraldehid ile, PBS (1 mL) içinde yeniden süspanse hücre pelletini düzeltin. 30 dakika (Şekil 1A), oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, bir gecede ya da hafta sonu 4 ° C'de hücreleri saptamak.
  3. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak tespit edici maddeler uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (1 mL) içinde% 1 OsO 4 örnek sonrası düzeltin.
  5. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak OsO 4 kaldırmak için, PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. Petrol ve ıskarta olarak OSO 4 devre dışı bırakın.
  6. Bir kontrast maddesi olarak PBS (1 mL) içinde% 2'lik üranil asetat ilave edilir ve oda sıcaklığında (Şekil 1B), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  7. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve bağlanmamış uranil ac uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kere yıkayınasetatın; uranil asetat radyoaktif elementler içerir ve radyoaktif atık adanmış bir bin atılmalıdır.
    Not: Örnek ölçülerine uygun bir bekleme süresi değiştirilebilir. örneğin tespit ve doku örnekleri gibi kalın örneklerde, boyama için, uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Daha uzun inkübasyon süreleri de dehidrasyon ve katıştırma adımlar için daha iyi olabilir. Uranil asetat Gadolinyum tuzlar içeren bir "uranil-az" bir çözüm ile değiştirilebilir.

3. Numune Dehidrasyon

  1. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve% 30 etanol ile PBS içinde 4 ° C'de (1 mL) içinde (Şekil 1C), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  2. giderek artan etanol konsantrasyonları ile (% 50,% 70, ve% 100'e kadar) çözümlerini kullanarak adımı tekrarlayın 3.1. Bu dehidrasyon adımları sırasında, numune saklama amaçlı 4 ° C 'de örnek muhafaza.
  3. Santrifüj işleminden sonra, supernat atmakAnt ve saf etanol (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; 4 ° C'de bir gece inkübe edilir.

4. Reçine Gömme

  1. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve oda sıcaklığında (Şekil 1D) 30 dakika boyunca% 30 epoksi reçine (1 mL) ile etanol içinde pelletini.
  2. giderek artan epoksi reçine konsantrasyonları ile çözümlerini kullanarak adımı yineleyin 4,1 (% 50,% 70, ve% 100'e kadar).
  3. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve saf epoksi reçinesi (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. reçine polimerizasyonu tetikleyebilir DMP-30 sertleşme varlığı; Bu olursa, epoksi reçine iki toplu, ile bir ve DMP-30 olmadan birini hazırlamak.
  4. Santrifüj işleminden sonra, saf epoksi reçinesi 200 uL plastik bir kapsül içinde (bir sertleştirici içeren) pelet tekrar süspansiyon; Numune plastik kapsül altında olmalıdır.

5. Reçine Polimerizasyon

  1. ben48 saat boyunca 60 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde örneği içeren plastik kapsül ncubate; reçine diğer tür farklı ayarlarla polimerize olabilir.
  2. inkübatör kapsülü çıkartın ve reçine polimerize olduğunu doğrulamak; Sert bir yüzeye bastırılır eğer reçine zor olmalı.
  3. örnek içeren polimerize reçinenin üzerine (sertleştirici ihtiva eder) saf epoksi reçinesi ekleme; reçine bu ekstra katman daha kolay örnek kesmek için yapacaktır. 48 saat boyunca 60 ° C 'de kapsül inkübe edin.

6. Numune Kesit

  1. Numune üste doğru olacak şekilde numune tutucu örnek ters monte edin ve ultramicrotome kırpma blok üzerine sabitleyin. Sıkıca ultramicrotome için düzeltme bloğu sabitlemek için kolu kilitleyin.
  2. Bir jilet veya benzeri keskin kesme aleti kullanılarak, polimerize reçine ayırmak için plastik kapsül kesip. örnek içeren böylece reçinenin kesinbir piramit yaklaşık şeklindeki reçine Ed. Tüm plastik kapsül kaldırmak için gerek yoktur; Sadece polimerize örnek kaplayan kısmını kaldırın.
  3. kapsül ve kırpma blok kapalı numune tutucu alın ve ultramicrotome hareketli koluna monte edin.
  4. bıçak blokta bir düzeltme bıçağı takın ve doğru bir piramit yüzleri kırpın. dürbün kullanımı piramit için mükemmel bir şekil vermek için tavsiye edilir; piramit daha iyi bölümler olacak.
  5. kırpma bıçağı çıkar ve daha kalın 0.5 mikron olan bölümleri kesmek için kullanılabilecek bir histoloji bıçakla değiştirin.
  6. uygun miktarda su ile histolojik bıçağının küvet doldurduktan sonra, numunenin yüzeyine bıçağın kesici kenar getirmek ve bıçak piramit dik dilim böylece kapsülün hatve açısını ayarlamak için dürbün kullanın.
  7. İstenilen göre kesme hızını ayarlayınkesit kalınlığı homojen bölümleri kurtarmak için.
  8. su üzerinde bölüm şamandıra edelim ve bir döngü ile balık.
  9. filtre kağıdı üzerine yerleştirilmiş olan bir elektron mikroskobu bakır ızgara doğru döngü hareket ettirin.
    NOT: Izgara onun hydrophilicity artırmak için önceden tedavi edilmiş olması gerekirdi. Bu ızgara kaplama kalem ile gerçekleştirilebilir.
  10. Nedeniyle filtre kağıdı su emilimi, bölüm ızgara dönelim. Elektron mikroskobu yerleştirmeden önce birkaç dakika kurumaya bırakın.

Through-odak Tilt-serisi 7. Tasarım

  1. sabit odak aralıklarla aracılığıyla odak görüntüleri toplayın.
    NOT: aracılığıyla odak tilt serisi tilt-serisi her eğim açısı toplanır aracılığıyla odak görüntülerin bir dizi oluşur. Bütün odaklama genliği, tüm numune kalınlığının karşılamak için yeterli olmalıdır.
  2. Odak aralığı değerini belirler. aralığı d eşitseepth-of-field, odak tüm örnek toplamak; Bu ayar mümkün olan en yüksek örnekleme temsil eder. aralık derinliği alanında büyükse, numunenin bazı bölümleri numunenin bazı kısımları odak tahsil edilmeyecektir, yani odak elde edilmeyecektir.
  3. derinliğini alan elektronun dalga boyu arasında bir elektron ışını ve elektron ışını yakınsama yarı açısı hesaplanır. Elektronların dalga boyu doğrudan ivme gerilimine bağlı iken, elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan yakınsama yarı açı kullanmak veya bilinen numune 16 kırınım deseninden deneysel olarak belirler. Elektronlar bir dalga boyu l hızlandırılmış Çünkü bir elektron mikroskobu a bir yakınsama yarı açı ile örnek vurmak, derinliği alanını (DOF) belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:

    Denklem
  4. dizaynBütün odak genlik maksimal belirgin kalınlıkta örnek kapsayacak şekilde odak serisi (yani en yüksek hızıyla).
    NOT: Odak genlik fazla 2.19 mikron olmalı böylece A 0,75 mikron kalınlığında numune, 70 ° hızıyla 2.19 mikron belirgin bir kalınlığa sahip olacak. Yukarıda belirlenen odak aralığı 50 nm'ye eşit ise, bu örnek için, bu maksimum belirgin kalınlıkta örnek kapak 44 görüntü (2.19 um / 50 nm) gerektirecektir. Bütün odak genlik odak adım sayısı ile çarpılır odak aralığının değerine eşittir. En yüksek eğim (θ) 'de, örnek görülür kalınlığı şu şekilde tanımlanır:

    Denklem

8. Örnek Görüntüleme

NOT: KÖK modunda bir elektron mikroskobu kurmak için nasıl açıklamak için bu protokol kapsamı dışındadır; Bu bilgilerin çoğunu bulunabilir in referans el kitabı elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan. Ancak, aşağıdaki noktalara dikkat edin: i) spot büyüklüğü istenen büyütme göre seçilmelidir; ii) Ronchigram iyi hizada olmalıdır; ve iii) BF modunda, kamera uzunluğu dedektörün iyi aydınlatma korurken unscattered elektronları seçmek için ayarlanması gerekir. elektron mikroskobu bakır ızgaralar üzerinde biriken reçine bölümleri küçülmesini önlemek için görüntü alımı öncesinde ışıklı olmalıdır. Reçine büzülme ve şarj etkileri görüntü alımı sırasında eleştirilmiştir olabilir. Şarj etkiler ortaya çıktığında bir objektif lens açıklığı kullanımı örnek istikrarı geliştirmek olabilir. Ancak, KÖK kurulumları özelinde, objektif diyafram HAADF görüntüleme modu ile uyumlu değildir ve çok küçük objektif delikler BF görüntüleme modu ile uyumlu değildir.

  1. Düşük büyütme (STEM olarak 20,000X civarında) kullanılarak, numune göz atabilir ve ilgi bölgeyi bulun.
  2. t ayarlayınörnek dönerken ilgi bölge sürüklenip kalmaması o yüksekliği (Z ekseni) eucentric.
  3. ilgi nesnesi tüm eğim aralığı boyunca görünür kalacaktır emin olun.
  4. Çünkü içinden odak tilt-serisi sırasında elde edilen görüntü önemli sayıda, otomatik toplama yazılımı kullanın. Ya bir ticari çözüm kullanmak ya da istenirse özel bir veri toplama yazılım tasarımı. yazılım programı üç aşağıdaki adımları gerçekleştirmek mümkün olduğundan emin olun:
    1. Parça ve standart eğim serisi toplama düzeni olarak odaklanır.
    2. ile odak görüntüler numunenin Z-pozisyonunda örtüşüyor emin olun.
    3. Otomatik olarak her eğim açısında aracılığıyla-fokal görüntüleri bir dizi kazanır.
  5. Yazılım programı aracılığıyla odak tilt-serisinin ana parametreleri vermek (yani, odak aralıkları, fokal adım, asgari eğim açısı, maksimum eğim açısı, eğim adım ve tarama hızı).
  6. BaşlamaYazılım programı bitirmek için görüntü toplama süreci ve bekleyin.

9. Görüntü İşleme

NOT: Bu protokol, through-fokal tilt serisi işleme ImageJ eklentileri 17 kullanılarak gerçekleştirilir. Ek Veriler 1 hizalama adım (Turboreg) ve üç odak değerleri ile tasarlanmış aracılığıyla odak tilt-serisi için de odak bilgisini (Alan Genişletilmiş Derinliği) birleştirmek için bir ImageJ makro gösterir.

  1. Aynı eğim açısı (yani yoluyla-odak görüntüler) toplanan görüntüleri hizalayın. görüntüler aynı olarak odak bilgiye sahip olmadığı için, onlar uyum için aynı özellikleri liman yok; komşu görüntüleri ikişer ikişer hizalayarak hizalama işlemini (yani, ilk yakın odak değerleri ile bir piramidal hiyerarşi, aşağıdaki) Turboreg 18, bir ImageJ eklentisi kullanarak.
  2. Sürekli her eğim açısında aracılığıyla odak görüntülerin uyum doğrulayın.görsel denetim geliştirmek için hizalanmış aracılığıyla odak görüntüleri Stack.
    NOT: yığının üzerinden tarama yaparken sadece bölge odakta hareket etmelidir. Bir sonraki adım, farklı görüntüleri odak bilgilerin geri kazanımı oluşur çünkü doğru hizalama, en önemli şeydir.
  3. Alan 19, bir ImageJ eklentisi Genişletilmiş derinliği kullanarak odakta olan bilgileri birleştirmek; Bu sonuçta görüntüleri yığından tek bir görüntü oluşturur. Çeşitli ayarlar derinliği alanında kurtarma sırasında kullanılan, ancak görüntü bilgilerini korumak için en yüksek ayarlarını kullanmak olabilir.
    NOT: tilt-serisi şimdi eğim açısı başına tek bir görüntü oluşur, içinde odak bilgilerini içeren her bir görüntü ile odak görüntüleri kurtarıldı.
  4. veri işlemek.
    NOT: Veri artık standart eğim serisi azaltılmış beri uyum ve yeniden inşası için standart araçlar kullanılabilir. Bu protokolde, TomoJ bizized veri hizalama ve veri yeniden 20, 21. TomoJ nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla detay orijinal yayın 22 bulunabilir.
  5. tilt-serisi ince ayarı gerçekleştirin.
    NOT: İyi bir strateji doğru görüntüler arasında vardiya izlemek için referans belirteç olarak altın boncuk kullanmaktır. altın boncuk örnek eklenemez halinde, yerel minimum de kullanılabilir.
  6. hizalanmış verilerin 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin; çeşitli algoritmalar gerçek uzayda veya Fourier uzayında, avantaj ve sınırlamaları ile her rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir.
  7. tilt-serisi son hizalama kötüyse, ilk adımları optimize ederek bazı iyileştirmeler yapmak. Nihai 3D rekonstrüksiyon bulanık ya da deforme görünüyorsa hizalama adımlarını yinelemek; Uygulamada, toplanan odak düzlemleri daha fazla sayıda, daha iyi kontrast ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon ayrıntıları.
    NOT: SeVeral yazılım programları aracılığıyla odak tilt-serisi işlemek için kullanılabilir. Ancak, bu protokolde kullanılan araçlar seçildi çünkü, bizim deneyim, onlar en iyi performansı. Turboreg 18 odak gradyanı mevcut olduğu zaman görüntüleri hizalama açısından iyi performans gösterdi. Daha fazla bilgi adanmış web sitesinde 23 bulunabilir. Diğer araçlar görünür piksel değişiklikler sonuçlandı oysa Alan eklentisi 19 Genişletilmiş Derinlik, farklı görüntüleri de-odak bilgileri kurtarma açısından çok iyi bir performans. Daha fazla bilgi, özellikle ilgili senaryo yazma, bu adanmış web sitesinde 24 bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bizim çalışmamızda, elektronlar alan emisyon silah transmisyon elektron mikroskobu 200 kV hız verilmiştir. Görüntüler 20 uS bekleme süresi kullanılarak KÖK BF modunda toplanmıştır. ile odak tilt-serisinin tasarımı ile ilgili olarak, biz bir 750 nm kalınlığında biyolojik numune bile elektron ışınının derinliği alan olmasına rağmen sadece ultrastrüktürel çalışma için tatmin edici sonuçlar verdi nm 150 o odak aralıkları bulundu 3 nm beri 25 mrad çok büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır.

Bu raporda analiz örnek Trypanosoma brucei, kimin kamçı bu organel oldukça memeliler 25 protistler gelen korunduğu için yoğun çalışılan bir tek hücreli ökaryot olduğunu. Hücreler (örnek hazırlama protokolü sunulduğu gibi tedavi ve biz T. brucei flagellar cebinde yapısal analiz odaklanmıştı (Şekil 2B, C, ve D). Toplanan görüntülerde, odakta olan bölge ince görünür ve resmin en sınırlı olduğu derinliği alanın bulanık. In-odak bilgilerinin birleştirilmesi toplanan görüntülerde yapılan ve odak bölgesi çok daha geniş olan tek bir görüntü, (Şekil 2E) üretir.

In-odak bilgilerinin birleştirilmesi daha doğru odak tilt serisi görüntülerin yüksek frekans alanları (Şekil 2F, G, ve H beyaz piksel) vurgulayarak tarafından görüntülenmiştir olabilir. ImageJ komutu "Kenarları Bul" bizdikBu çalışmada ed. Bu komut komşu piksel yoğunluğunun değişiklikleri algılamak için bir Sobel filtre kullanır. tespit edilen yüksek frekans alanına yer değiştirme, diğer bir görüntü gözlenebilir. In-odak bilgi birleştirildi resim üzerinde, yüksek frekanslar görüntü (Şekil 2I) en span. Bu yöntem sayesinde odak tilt-serisi iyi işleme doğrulama verir.

aracılığıyla odak tilt-serilerini kullanarak, ekstra bir odak bilgiler toplanır ve 3D rekonstrüksiyon işlemi sırasında kullanılır. Bu daha yüksek bir kontrast ve SNR ve derinlik-alan-sınırlı görüntülerin 15 3D rekonstrüksiyon gözlenen bulanıklık etkilerini azaltır. Fourier uzayında, ekstra bilgiler sadece odak düzlemi üzerinde 13 toplanan klasik bir eğim serisi toplama düzeni ile karşılaştırıldığında elde edilir. bütün 3 boyunca Genel olarak, kaliteD rekonstrüksiyonu klasik bir eğim serisi toplama düzeni ile karşılaştırıldığında daha izotropik olduğunu.

Şekil 1
Şekil 1: biyolojik numune hazırlama protokolü farklı adımlarını gösteren görüntüler. numune hazırlama protokolü dört ana adımlar ayrılabilir. Örnek A) paraformaldehid ve glutaraldehid, b)) ozmiyum tetroksit ve etanol içinde dehidre edilmiş uranil asetat, C) ile tezat sabit sonrası ve D reçine içine gömüldü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
derinliği alanında iyileşme doğrulanması. derinliği alan kazanımı bir eğik numune görüntüleri kontrol edilebilir. A) 0 ° tilt anda, birkaç detay reçine gömülü T. brucei hücre flagellar cebine (Bayrak cep) görülebilir. kamçılı cep sitoplazma (Sit) yer alan ve bazal vücut (BB) flagella zarı kamçılı (Bayrak) çapa edilir. B, C ve D) elektron mikroskobu 70 ° eğik aynı kamçılı cebinde, üç görüntüleri, satın alındı. Bunlar 300 nm odak aralıklarla toplanmıştır. E) Bu resim Alan ImageJ eklenti Genişletilmiş Derinlik tarafından üretilen ve B, C olarak odak bilgilerini içerir ve D. F, G, H, ve ben) Bu görüntüler "Kenarları bul" komutu ile hesaplanmıştır edildi highl amacıyla ImageJsırasıyla B, C, D, ve E, içinde ihtiva ight yüksek frekans bilgileri. Beyaz piksel bir odak bilgilerine karşılık gelen, yüksek frekansları temsil etmektedir. Ölçek çubuğu 250 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Company Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, biz aracılığıyla odak tomografi STEM kullanarak kalın biyolojik örnekler üzerinde 3D analizlerini gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuz ile birlikte geleneksel numune hazırlama protokol mevcut. Biyolojik örneklerin reçine gömme yıllardır 26 için kullanılır olmuştur, ve örneklerin farklı uyarlanmış alternatif protokoller literatürde 27 boyunca bulunabilir. Bunun aksine, STEM görüntüleme kalınlıkta numuneler yeni bir teşebbüse odak-boyunca yöntemleri kullanılarak ve daha yaygın hale geldikçe yöntemleri, büyük olasılıkla daha iyi olacaktır.

Bu çalışmanın amacı, bir örnek hazırlama protokolü açıklamak ve daha spesifik olarak, şu anda donanımları ile STEM eğim serisi edinimi odak aracılığıyla ve zaman makul bir miktarda gerçekleştirmek için görüntüleme koşulları. Bu nedenle, geniş bir odak aralığı kullanılmıştır. Nitekim, hakkında fikir birliği yoktur ne kadar yakınodak düzlemleri boyunca odak tilt-serisi için KÖK ile kalın numuneyi görüntüleme için olmalıdır. Genellikle KÖK görüntüleri toplamak için birkaç saniye kadar sürer ve tüm geleneksel eğim serisi tamamlamak için saat sürebilir. bir kanıtı-of-concept olarak, yüzlerce veya görüntüleri hatta binlerce toplamak mümkündür. Ancak, uzun toplama süreleri, günlük kullanım için uygun olmadığı açıktır. Böyle uzun deneyler tasarlarken ışın istikrar ve örnek sürüklenme dikkate alınmalıdır. Ayrıca, uzun toplama süreleri birikmiş elektron dozunun soruyu. Tilt serisi esas olarak gerekli olan önemli bir elektron dozu, örneğin reçine gömülü biyolojik örnekler veya inorganik malzemeler gibi kiriş dayanıklı örnekleri, çalışma için uygundur ile odak Böylece, şu an için, kaynaklanıyor. Çünkü satın alma süresi ve nihai 3 boyutlu rekonstrüksiyon kalitesi arasındaki ticaret-off, biz, yüksek çözünürlüklü gerekmez projelerde birkaç aracılığıyla odak aralıkları kullanmanızı öneririznd yüksek çözünürlük gereklidir projelerde yoluyla-fokal aralıklarda daha fazla miktarda kullanmanızı öneririz.

nedeniyle yenilik bu yöntemde belirli adımlar hakkında fikir birliği eksikliği vardır. Ancak, birkaç adım ile odak tilt serisi veri setleri KÖK yüksek kaliteli rekonstrüksiyon için kritik olduğu açıktır. İlk olarak, her eğim açısında odak görüntüleri hizalama yoluyla odak resim koleksiyonu 13, 14, 15 anlatan üç yazılarında belirttiği gibi dikkatle idam edilmesi gerekmektedir. Çeşitli odak değerleri toplanan görüntülerin ortak bilgi paylaşımı yok olsa da, Turboreg görüntülerin doğru, otomatik hizalama için iyi bir çözüm olmaya devam etmektedir. İkincisi, bu protokolde yapılan olarak odak görüntülerin birleştirilmesi, kolayca herhangi bir eğim serisi hizada tarafından ele alınır eğim açısı başına tek bir görüntü üreten avantajı vardırment ve 3D rekonstrüksiyon yazılım programı. Alan plug-in Genişletilmiş Derinlik başlangıçta ışık mikroskobu görüntüleri için dizayn edilmiştir; yine de, elektron mikrograflar 28 dan odak bilgilerini birleştirme için en iyi çözüm gibi görünüyor. Alternatif bir çözüm benzer Hovden ark yapıldığını ne eğim açısı başına birkaç görüntü, tek bir eğim serisi veri kümesi olarak görüntülerin tüm setini ele almaktır. 13 ve Dahmen ve diğ. 14. Fourier-tabanlı algoritmalar yeniden 13 veya Dahmen ve arkadaşları tarafından geliştirilen Ettention kullanımını gerektirir. 29 ve gerçek uzayda değişik odak değerleri toplanan görüntüleri 3D hacimleri yeniden tek 3 boyutlu rekonstrüksiyon yazılımı olan. Özellikle, bu tür alternatif çözümler kafa karıştırıcı resu üretebilir fokal yönde (Z ekseni) ekstra bir hizalama adım gerektirecektirDahmen vd tartışıldığı gibi, görüntü toplama sırasında seçilen bulanıklaştırma aralıklarla tutarsız lt. 14. in-odak bilgilerinin birleştirilmesi, bu protokolde sunulan veriler, böylece Z yönünde bu ekstra hizalama adımı kaçınarak, bir paralel kullanılarak toplanmıştır sanki bir görüntü üretme avantajına sahiptir.

Through-odak tilt serisi yöntemleri kalın örnekleri (um 1 civarında) incelemek için geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin başlıca sınırlaması elektron ışını tür numunelerin nüfuz edemez dolayı, birkaç mikronluk daha kalın örnekleri çalışmak için kullanılamaz olmasıdır. Bu sınırlama, hızlanma gerilimi bağlıdır elektron ortalama serbest yolu gelir. Çok yüksek voltaj (örneğin, 1000 kV) elektron mikroskopları ökaryotik hücreler 30 görüntülenmesinde kullanılabilir olsa da, çok kalın örnekleri hala bu tür focuse diğer tekniklerin kullanılmasını gerektirird iyon ışını veya seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu 31, 32. Bununla birlikte, bu yöntemler, yöntemin kesme derinliği gibi tanımlanmıştır, Z-ekseni, X ve Y eksenleri eşdeğer olmadığı için görüntü yığınları olarak kabul edilebilir anizotropik rekonstrüksiyon oluşturur. Bu teknikler, yüksek çözünürlüklü çalışmaları için kullanılamaz.

2014 ve 2015 yılında, üç orijinal makaleler görüntüleme kalın numuneler 13, 14, 15 için farklı yöntemler bildirilmiştir. O zamandan bu yana, sadece birkaç çalışma kalın örnekleri 33 incelemek için bu yöntemlerden birini kullandık. yöntemler gelişmeler STEM yoluyla odak görüntüleme genelleştirmek için yardımcı olacaktır. Özellikle yaşam bilimleri, through-fokal yöntemleri kriyojenik koşullar altında örnekleri gözlemlemek için optimize edilmesi gerekir. kriyojenik örnekleridir çünkü bu, büyük bir sorundurözellikle hassas doz elektron ve odak-boyunca yöntemleri birçok görüntü gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich P4417
Ethanol Sigma-Aldrich 2860
Epoxy resin EMS 14120
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C.
Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible.
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 
Osmium Tetroxyde EMS 19150
Uranyl Acetate Sigma-Aldrich 73943
Gelatin Capsule EMS 70110
Triming and Histo knives LFG Distribution Diatome diamond knives
Electron Microscopy copper grid LFG Distribution G200-Cu
Grid Coating Pen LFG Distribution 70624
Specimen Holder JEOL EM-21311 HTR
Electron Microscope JEOL JEM-2200FS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).

Tags

Cellular Biology Sayı 121 elektron tomografisi tarama transmisyon elektron mikroskobu kalın biyolojik numune, Derinliği alanında yoluyla odak tilt serisi
Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trépout, S., Bastin, P., Marco, … More

Trépout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. J. Vis. Exp. (121), e55215, doi:10.3791/55215 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter