Introduction
Sinds de vroege jaren 1970, tomografie benaderingen transmissie elektronenmicroscopie (TEM) zijn uitgebreid gebruikt voor structurele karakterisatie van biologische monsters 1, 2, 3. De aantrekkingskracht van transmissie elektronentomografie is dat het kan worden gebruikt om een breed scala aan biologische structuren bestuderen op nanometerschaal, de architectuur van cellen en de ultrastructuur van organellen om de structuur van macromoleculaire complexen en eiwitten. Niettemin kan transmissie elektronentomografie niet worden gebruikt voor zeer dikke samples (groter dan 0,5 micrometer) te bestuderen. Inderdaad, dikke specimens teveel verstrooide elektronen genereren lage signaal-ruisverhouding (SNR) beelden. Bovendien tomografie omvat het verzamelen van afbeeldingen van gekanteld specimens, de schijnbare dikte van het monster toeneemt met de hellingshoek. Hoewel inelastische verstrooiing kan worden gefilterdmet behulp van energie filters wordt de kritische hoeveelheid elektronen die nodig zijn voor hoge SNR beelden nauwelijks bereikt TEM. Vandaar dat dikke biologische monsters alleen onderzocht middels snijden 4.
Sommige monsters kunnen niet worden gesneden: sommigen breken wanneer zij worden gesneden en anderen moeten worden bestudeerd in hun geheel om de complexiteit te begrijpen. Een alternatieve benadering is om TEM gebruiken scanmodus 5, 6, 7, 8. In scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM), het optische pad van de elektronen is anders dan in conventionele TEM. Elektronen die door het monster zonder verstrooiing kunnen worden verzameld aan de optische as met een bright-field (BF) detector 9, dat deze elastisch verstrooid kan worden verzameld op een bepaalde hoek van de optische as met een donker-veld (DF) detector.Het andere voordeel is dat de STEM gefocusseerde elektronenbundel afgetast aan het oppervlak van het monster, waardoor de pixel-voor-pixel verzameling afbeeldingen. Hoewel de elektronenbundel verbreedt doortocht door het monster 10, dit inzamelingsregeling minder gevoelig voor inelastisch verstrooide elektronen dan conventionele TEM. Bovendien is er geen lens na specimen bèta, waardoor chromatische aberraties die kunnen optreden in TEM vermijden. De camera lengte kan worden aangepast zodat de BF detector detecteert hoofdzakelijk verstrooide elektronen. Met behulp van de DF detector dikke monsters te studeren wordt niet aangeraden omdat van meervoudige verstrooiing, die onjuiste beelden produceert. In plaats daarvan kan de detector worden gebruikt BF 11. Terwijl STEM produceren hoge SNR beelden, heeft een relatief lage diepte van het veld vanwege de relatief grootlicht convergentie vergelijking met TEM, verminderen van de hoeveelheid diepgaande informatie van dik kan worden hersteldspecimens. Bij aberratie gecorrigeerde STEM microscopen, waarbij de convergentiehoek oplopen tot 30 mrad kan zijn, kan de scherptediepte van laag genoeg zijn zodat de informatie die in beeld afkomstig van een brandvlak van slechts enkele nanometers . Instellen van de elektronenbundel Parallelle verhoogt de diepte-van-veld van de elektronenbundel ten koste van de 12 resolutie. Echter, deze opstelling is niet altijd mogelijk.
Wanneer het noodzakelijk is een convergerend elektronenbundel gebruiken, moet men technieken die de diepte-van-veld van de elektronenbundel te verbeteren wanneer het bestuderen dikke samples. Recente studies hebben de overname van meerdere afbeeldingen op verschillende focale vliegtuigen gemeld door het monster om het maximale bedrag van de in-focus informatie 13, 14 herstellen. De twee studies beschrijven verschillende manieren om de gegevens van de verschillende beeldvlakken behandelen. Hovden et al.gecombineerd in Fourierruimte de beelden die op verschillende beeldvlakken werden verzameld en het uiteindelijke reconstructie werd rechtstreeks uit de 3D inverse Fouriertransformatie 13. Daarentegen Dahmen et al. ontwikkelde een convergente reconstructie motor te reconstrueren in de reële ruimte het 3D-volume van de verschillende focale vliegtuigen 14. Ons laboratorium ontwikkelde ook een werkwijze voor het afbeelden van dikke biologische monsters. Onze strategie was anders dan de twee methoden hierboven beschreven in dat we de informatie die is in focus op de verschillende focale vliegtuigen samengevoegd en reconstrueerde de uiteindelijke 3D-volume in de reële ruimte met behulp van een parallelle bundel projector 15. Ons doel was om een methode die gemakkelijk kan worden uitgevoerd in elke elektronenmicroscopie laboratorium ontwikkelen. Daartoe hebben we geprobeerd om het brandpunt beelden in een korte tijd, vergelijkbaar met het tijdskader van conventionele tomografie experimenten verzamelen. Bovendien, onze voorgestelde werkwijze could worden aangepast voor gebruik met verschillende soorten alignment en reconstructie software.
In het kader van onze publicatie vanaf 2015 15, wilden we te visualiseren en te karakteriseren het herstel van de diepte-van-veld, dus we gebruik gemaakt van een grote convergentie semi-hoek van 25 mrad. Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor het uitvoeren doorgaande focale beeldvorming bèta volgens de werkwijze ontwikkeld in ons laboratorium in 2015 15 en presenteren we hoe de gegevens van 2015 verwerkt. Deze methode herstelt in-focus informatie uit verschillende focale vliegtuigen gedurende een dikke (750 nm) biologisch monster en maakt hoogwaardige 3D-reconstructies. Waar relevant, zijn de verschillen in deze methode ten opzichte van de gebruikt door andere groepen methoden gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) van de verschillende reagentia voordat u ze gebruikt. Een aantal van de chemicaliën die worden gebruikt tijdens de voorbehandeling zijn giftig, kankerverwekkend, mutageen en / of giftig voor de voortplanting. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas, full-length broek en dichte schoenen) en werken onder een zuurkast tijdens het hanteren van het monster. Snijden het monster met een ultramicrotoom omvat het gebruik van scherpe instrumenten en zorgvuldig gebruik van deze tools is verplicht. In de hieronder beschreven stappen, de auteurs nemen aan dat het monster een celcultuur monster. Het protocol moet worden aangepast aan het type analyse, met name de centrifugatiestappen.
1. Bereiding van buffers en mengsels
- Bereid oplossing fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4 en 1,76 mM KH 2PO 4).
- Bereid oplossingen die 30%, 50% en 70% ethanol in PBS voor het monster uitdroging. Voer sample uitdroging door het geleidelijk incuberen van het monster in toenemende ethanol concentraties.
- Bereid epoxyhars door mengen bisfenol-A- (epichloorhydrine) (20 ml), dodecenylbarnsteenzuuranhydride (9 ml), methyl-5-norborneen-2,3-dicarbonzuur (11 ml) en 2,4,6-tris ( dimethylaminomethyl) fenol (0,7 ml); andere mengverhoudingen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste hardheid van de hars.
- Bereid oplossingen die 30%, 50% en 70% epoxyhars in ethanol voor monster inbedding. Uitvoeren hars inbedding door geleidelijk incuberen van het monster met toenemende concentraties hars.
OPMERKING: De volumes van de bereide oplossingen afhankelijk van het type monster dat wordt onderzocht. Meer nodig wil weefsels dan voor celculturen.
2. Fixatie en verkleuring van het Monster
- Centrifugeer de celcultuur gedurende 5 min bij 5000 x g. Voer alle volgende centrifugaties onder dezelfde omstandigheden.
- Verwijder het supernatant en bevestig de celpellet door resuspenderen in PBS (1 ml) met 4% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min (Figuur 1A). Als alternatief, bevestig de cellen bij 4 ° C 's nachts of in het weekend.
- Na centrifugeren, verwijder het supernatant en was de pellet 3 maal met PBS (1 ml) voor het verwijderen van het fixeermiddel agenten.
- Post-fix het monster met 1% OsO 4 in PBS (1 ml) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Na centrifugeren, verwijder het supernatant en was de pellet 3 maal met PBS (1 ml) voor het verwijderen van de OsO 4. Schakel de OsO 4 in olie en teruggooi.
- Voeg 2% uranylacetaat in PBS (1 ml) als contrastmiddel en incubeer het monster gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 1B).
- Na centrifugeren, verwijder het supernatant en was de pellet 3 maal met PBS (1 ml) om de ongebonden uranyl ac verwijderenetate; uranylacetaat bevat radioactieve elementen en mag van worden afgevoerd in een bak gewijd aan radioactief afval.
OPMERKING: De incubatietijden kunnen worden aangepast aan de grootte van het monster. Bijvoorbeeld door fixatie en kleuring van dikkere monsters, zoals weefsels monsters vereisen langere incubatietijden. Langere incubatietijden kunnen ook beter voor de dehydratatie en inbedden trede. Uranyl acetaat kan worden vervangen door een "uranyl-less" Gadolinium oplossing die zouten bevat.
3. De steekproef Uitdroging
- Na centrifugeren Verwijder de bovenstaande vloeistof en incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 4 ° C in PBS (1 ml) met 30% ethanol (figuur 1C).
- Herhaal stap 3,1 behulp oplossingen met geleidelijk toenemende concentraties ethanol (50%, 70% en tot 100%). Tijdens deze dehydratatietrappen handhaven van het monster bij 4 ° C voor monster bewaringsdoeleinden.
- Na centrifugeren, gooi het supernatmieren en resuspendeer de pellet in zuivere ethanol (1 ml); incubeer overnacht bij 4 ° C.
4. Hars Embedding
- Na centrifugeren gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in ethanol met 30% epoxyhars (1 ml) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1D).
- Herhaal stap 4,1 behulp oplossingen met geleidelijk toenemende concentraties epoxyhars (50%, 70% en tot 100%).
- Na centrifugeren gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in zuivere epoxyhars (1 ml); incubeer overnacht bij kamertemperatuur. De aanwezigheid van verharding DMP-30 kan de polymerisatie van de hars veroorzaken; als dit gebeurt, bereiden twee partijen van epoxyhars, met en zonder DMP-30.
- Na centrifugatie, resuspendeer de pellet in 200 pi zuivere epoxyhars (met de verharder) in een plastic capsule; het monster moeten bij de bodem van de plastic capsule.
5. Hars polymerisatie
- ikncubate de plastic capsule die het monster in een incubator ingesteld op 60 ° C gedurende 48 uur; andere vormen van hars kunnen polymeriseren met verschillende instellingen.
- Haal de capsule uit de couveuse en controleer of de hars is gepolymeriseerd; de hars moet moeilijk zijn als tegen een hard oppervlak gedrukt.
- Voeg zuivere epoxyhars (met de verharder) bovenop de gepolymeriseerde hars met monster; Deze extra laag hars maakt het gemakkelijker om het monster te snijden. Incubeer de capsule bij 60 ° C gedurende 48 uur.
6. Sample-Sectie
- Monteer het monster ondersteboven in een monsterhouder, zodat het monster naar boven en plaats deze op het trimmen blok van de ultramicrotoom. Nauw vergrendel de hendel om het trimmen blok vast te zetten aan de ultramicrotoom.
- Met een scheermesje of soortgelijke scherpe instrument knip de plastic capsule te scheiden van het gepolymeriseerde hars. Snijd het hars zodat het monster bevated in hars in ruwweg de vorm van een piramide. Er is geen noodzaak om de gehele kunststof capsule te verwijderen; alleen verwijder het deel met betrekking tot de gepolymeriseerde monster.
- Neem de capsule en de preparaathouder off van de trimmen blok en installeer ze op de bewegende arm van de ultramicrotoom.
- Installeer een trimmen mes op het messenblok en nauwkeurig trim de gezichten van de piramide. Het gebruik van een verrekijker wordt geadviseerd om een perfecte vorm om de piramide te geven; hoe beter de piramide, hoe beter de secties zijn.
- Haal de Stanleymes en te vervangen door een histologie mes dat kan worden gebruikt om delen die dikker zijn dan 0,5 micrometer zijn gesneden.
- Na het vullen van de cuvet histologie mes met de juiste hoeveelheid water, breng de snijrand van het mes op het oppervlak van het monster en gebruik de verrekijker om de capsule spoedhoek passen zodat het mes loodrecht zal snijden de piramide.
- Pas de snijsnelheid volgens de gewenstecoupedikte homogene secties herstellen.
- Laat de sectie zweven over het water en vissen het met een lus.
- Beweeg de lus naar een elektronenmicroscopie koperen raster dat is op de top van de filter papier heeft geplaatst.
NB: Het raster moeten worden behandeld eerder om zijn hydrofiliciteit te verhogen. Dit kan worden uitgevoerd met een raster coating pen. - Als gevolg van wateropname door de filter papier, laat de afdeling vasthouden aan het net. Laat het drogen voor enkele minuten voordat u deze in de elektronenmicroscoop.
7. Het ontwerp van de Via-focal Tilt-serie
- Verzamelen via-focal beelden bij constante focus intervallen.
LET OP: De through-focal tilt-serie bestaat uit een reeks van doorgaande focale beelden die worden verzameld op elk kantelhoek van de tilt-serie. De hele nadruk amplitude moet voldoende zijn om het gehele monster dikte dekken. - Bepaal de waarde van de focusinterval. Als het interval gelijk is aan de depth-van-veld, het verzamelen van het gehele monster in focus; deze instelling is de hoogst mogelijke bemonstering. Indien het interval groter is dan de diepte-van-veld, sommige delen van het monster niet in focus verkregen, hetgeen betekent dat bepaalde delen van het monster niet wordt verzameld in focus.
- Bereken de diepte van het veld van een elektronenbundel van golflengte van het elektron en de convergentie halve hoek van de elektronenbundel. Dat de golflengte van elektronen direct gekoppeld is aan de versnellingsspanning Gebruik de convergentie halve hoek van de fabrikant elektronenmicroscoop of proefondervindelijk bepalen van het diffractiepatroon van een bekende specimen 16. Omdat de elektronen versneld bij een golflengte λ raakte het monster met een convergentie semi-hoek van α in een elektronenmicroscoop, gebruik maken van de volgende vergelijking om het veld diepte-of-(DOF) te bepalen:
- Ontwerphet brandpunt serie zodat de hele aandacht amplitude van het monster bij de maximale schijnbare dikte dekt (dwz op het hoogste tilt).
LET OP: Een 0,75 urn dikke monster zal een schijnbare dikte van 2,19 urn op een 70 ° kantelen, zodat de focus amplitude groter is dan 2,19 micrometer zou moeten zijn. Voor dit voorbeeld, als de focus hiervoren bepaald gelijk aan 50 nm, eise 44 beelden (2,19 um / 50 nm) om het monster op zijn maximum schijnbare dikte dekken. De hele nadruk amplitude gelijk aan de waarde van de focusinterval vermenigvuldigd met het aantal focale stappen. Bij de hoogste tilt (θ) wordt het monster schijnbare dikte als volgt gedefinieerd:
8. Sample Imaging
LET OP: Het valt buiten het bestek van dit protocol om te beschrijven hoe het opzetten van een elektronenmicroscoop in STEM-modus; het grootste deel van deze informatie kan worden gevonden in de handleiding van de fabrikant elektronenmicroscoop. Echter, op het volgende: i) ter plaatse grootte moeten worden gekozen op basis van de gewenste vergroting; ii) de Ronchigram moet goed worden afgestemd; en iii) in BF modus moet de lengte camera aangepast aan verstrooide elektronen selecteren behoud goede verlichting van de detector. Harssecties afgezet op elektronenmicroscopie koper grids moeten vóór beeldverwerving worden verlicht om krimp te voorkomen. Hars krimp en het opladen van effecten kunnen worden verward tijdens beeldacquisitie. Het gebruik van een objectieflens diafragma kan monsterstabiliteit verbeteren bij het opladen optreden. In het specifieke geval van STEM opstellingen, het doel lensopening ten geschikt HAADF beeldmodus en zeer kleine openingen doel niet geschikt BF afbeeldingsmode.
- Met behulp van een lage vergroting (ongeveer 20.000 x in STEM), blader door het monster en zoek de regio van belang.
- Pas tHij eucentrische hoogte (Z-as), zodat het van belang zijnde niet weg te drijven tijdens het draaien van het monster.
- Controleer of het object van belang in het gehele kantelbereik zichtbaar blijft.
- Vanwege het grote aantal foto's die tijdens een doorgaande focal tilt-serie, maken gebruik van een automatische incasso software. Gebruik maken van een commerciële oplossing of ontwerp een aangepaste verzamelen van gegevens software indien gewenst. Zorg ervoor dat de software-programma is in staat om de volgende drie stappen uit te voeren:
- Track en focus als in een standaard tilt-serie inzamelingssysteem.
- Zorg ervoor dat de doorgaande focale beelden overlappen met de Z-positie van het monster.
- Automatisch verwerven van een reeks van doorgaande focale beelden bij elke kantelhoek.
- Geef het softwareprogramma de belangrijkste parameters van de doorgaande focal tilt-serie (dat wil zeggen, focale intervallen, focal stap, minimum hellingshoek, maximale hellingshoek, tilt stap, en scansnelheid).
- Beginde foto collectie proces en wacht tot het programma klaar is.
9. Beeldverwerking
LET OP: In dit protocol wordt het doorgaande focal tilt-serie verwerking uitgevoerd met behulp van ImageJ plugins 17. Aanvullende gegevens 1 toont een ImageJ macro voor de uitlijning stap (Turboreg) en voor het samenvoegen van in-focus informatie (Extended Depth of Field) voor een through-focal tilt-serie is ontworpen met drie aandachtsgebieden waarden.
- Lijn de verzameld op dezelfde hellingshoek (dat wil zeggen, de doorgaande focale beelden) beelden. Aangezien beelden niet dezelfde in-focus informatie, hebben ze niet dezelfde mogelijkheden voor het uitlijnen haven; uit te voeren uitlijning door het gelijktrekken van de naburige beelden twee aan twee (dat wil zeggen, na een piramidale hiërarchie, met de kortste scherpstelafstand waarden eerst) met behulp van Turboreg 18, een ImageJ plugin.
- Consequent controleren of de uitlijning van de doorgaande focale beelden bij elke kantelhoek.Stapel de uitgelijnde doorgaande focale afbeeldingen om visuele inspectie te verbeteren.
OPMERKING: Alleen de zone die in beeld zou moeten bewegen tijdens het browsen door de stapel. Nauwkeurige uitlijning is het allerbelangrijkste, aangezien de volgende stap bestaat uit het herstel van de informatie die in de focus van verschillende beelden. - De informatie die is scherpgesteld met behulp van Extended Depth of Field 19, een ImageJ plugin samen te voegen; Dit zal uiteindelijk het genereren van een enkel beeld van de stapel van de beelden. Verschillende instellingen kunnen worden gebruikt tijdens de herstelperiode diepte-van-veld, maar gebruik maken van de hoogste instellingen om het beeld informatie te bewaren.
LET OP: De tilt-serie bestaat nu uit een enkel beeld per kantelhoek, elk beeld met de in-focus informatie hersteld van de doorgaande focale beelden. - Verwerkt de gegevens.
OPMERKING: Standaardgereedschap uitgelijnd zijn en reconstructie kunnen worden gebruikt omdat de data is nu teruggebracht tot een standaard tilt-series. In dit protocol, TomoJ is onsed voor data uitlijning en datareconstructie 20, 21. Meer details over hoe u TomoJ gebruik kan worden gevonden in de oorspronkelijke publicatie 22. - Voer fijne afstemming van de tilt-serie.
LET OP: Een goede strategie is om goud kralen als de vaste markers te gebruiken om nauwkeurig bijhouden verschuivingen tussen de beelden. Lokale minima kunnen ook worden gebruikt als gouden kralen kunnen worden toegevoegd aan het monster. - Voer een 3D-reconstructie van de aangepaste gegevens; verschillende algoritmen beschikbaar voor het uitvoeren van de reconstructie in de reële ruimte of Fourierruimte, elk voordelen en beperkingen.
- Als de uiteindelijke uitlijning van de tilt-serie is slecht, maken een aantal verbeteringen door het optimaliseren van de eerste stappen. Herhaal de uitlijning stappen als de uiteindelijke 3D reconstructie is wazig of vervormd; in de praktijk, hoe groter het aantal verzamelde beeldvlakken, hoe beter het contrast en de details van de 3D-reconstructie.
LET OP: SeVeral software kan worden gebruikt om de doorgaande focal tilt-serie verwerken. Echter, de instrumenten die gebruikt worden in dit protocol werden gekozen omdat, in onze ervaring, traden ze de beste. Turboreg 18 presteerde beter in termen van het uitlijnen van de afbeeldingen wanneer een helling van de focus aanwezig was. Meer informatie is te vinden op de speciale website 23. De Extended Depth of Field plugin 19 presteerde zeer goed in termen van het terugwinnen van het in-focus informatie uit verschillende beelden, terwijl andere instrumenten resulteerde in zichtbare pixels wijzigingen. Meer informatie, met name met betrekking tot script schrijven, is te vinden op deze speciale website 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze studie werden elektronen versneld tot 200 kV in het veldemissie pistool elektronenmicroscoop. Beelden werden opgevangen in STEM BF-modus met behulp van een 20-ps verblijftijd. Betreffende het ontwerp van de doorgaande focal tilt-serie, vonden we aandacht intervallen van 150 nm hebben bevredigende resultaten voor de ultrastructurele studie van een 750 nm dikke biologisch monster-hoewel de scherptediepte van de elektronenbundel slechts 3 nm-aangezien we gebruik gemaakt van een zeer grote convergentie semi-hoek van 25 mrad.
Het monster in dit verslag geanalyseerd is Trypanosoma brucei, een eencellige eukaryoot waarvan flagellum wordt intensief bestudeerd omdat dit organel opmerkelijk is geconserveerd uit protists aan zoogdieren 25. Cellen werden behandeld zoals gepresenteerd in de steekproef voorbereiding protocol, en hebben we ons gericht de structurele analyse van de flagellaire zak van T. brucei (
Het samenvoegen van de in-brandpunt informatie kan beter worden gevisualiseerd door te wijzen op de hoge frequentiegebieden van de doorgaande focal tilt-serie beelden (witte pixels in figuur 2F, G en H). De ImageJ commando "Find Edges" was onsed in de huidige studie. Deze opdracht maakt gebruik van een Sobel-filter aan veranderingen in de naburige pixel intensiteiten op te sporen. De verplaatsing van de gedetecteerde hoge-frequentiegebied kan worden waargenomen van de ene afbeelding naar de andere. Op het beeld waar de in-focus informatie is samengevoegd, de hoge frequenties beslaan het grootste deel van de afbeelding (figuur 2I). Deze methode maakt de controle van de goede verwerkingseigenschappen van de doorgaande focal tilt-series.
Met behulp van through-focal tilt-serie, wordt extra in-focus informatie verzameld en gebruikt tijdens de 3D-reconstructie proces. Dit zorgt voor een groter contrast en SNR en vermindert de vervaging effecten waargenomen in de 3D-reconstructies van diepte-of-field-beperkte afbeeldingen 15. In Fourier ruimte, wordt extra informatie hersteld in vergelijking met een klassieke tilt-serie inzamelingssysteem, waarbij alleen op de focal plane wordt verzameld 13. Kortom, de kwaliteit gedurende het gehele 3D reconstructie is meer isotroop in vergelijking met een klassieke tilt-serie inzamelingssysteem.
Figuur 1: afbeeldingen presentatie van de verschillende stappen van het biologische monster bereidingsprotocol. De monsterbereiding protocol kan worden onderverdeeld in vier grote stappen. Het monster A) gefixeerd in paraformaldehyde en glutaaraldehyde, B) nagefixeerd in osmiumtetroxide en tegenover uranyl acetaat, C) in ethanol gedehydrateerd en D) ingebed in hars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende File 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een conventionele monstervoorbereiding protocol samen met een stap-voor-stap handleiding voor het uitvoeren van 3D-analyse op dik biologische monsters met behulp van STEM doorgaande focale tomografie. Hars inbedding van biologische monsters is gebruikt voor tientallen jaren 26, en andere protocollen die zijn aangepast aan verschillende soorten monsters te vinden in de literatuur 27. In tegenstelling beeldvorming dikke exemplaren in STEM met behulp van door de focus methoden wordt een nieuwe onderneming, en de methoden zal waarschijnlijk worden verbeterd als het wordt meer wijdverspreid.
Het doel van dit werk was om een monster voorbereiding protocol te beschrijven en, meer in het bijzonder, imaging voorwaarden voor het uitvoeren van through-focal tilt-serie acquisitie in STEM met apparatuur die momenteel beschikbaar is en in een redelijke hoeveelheid tijd. Daarom werden grote nadruk intervallen gebruikt. Sterker nog, er is geen consensus over hoe dicht defocale vliegtuigen moet worden voor het afbeelden van een dikke exemplaar met STEM voor through-focal tilt-serie. Het duurt meestal tot enkele seconden om STEM afbeeldingen verzamelen, en een hele conventionele tilt-serie kan uren duren. Als proof-of-concept is het mogelijk om honderden of zelfs duizenden beelden te verzamelen. Het is echter duidelijk dat lange afhaaltijden niet geschikt voor dagelijks gebruik. Balk stabiliteit en monster afwijking moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen van een dergelijk lange experimenten. Verder lange collectie keer doen de vraag rijzen van de geaccumuleerde elektron dosis. Zo is voor het moment, STEM through-focal tilt-serie is alleen geschikt voor de studie van de balk-resistente monsters, zoals hars ingebedde biologische monsters of anorganische materialen, vooral als gevolg van de aanzienlijke elektron dosis nodig. Vanwege de trade-off tussen de acquisitie tijd en kwaliteit van de uiteindelijke 3D-reconstructie, raden we u enkele doorgaande focale intervallen in projecten waar hoge resolutie niet nodig is, eennd raden we het gebruik van een grotere hoeveelheid doorgaande focale intervallen in projecten waarbij hoge resolutie nodig is.
Er is een gebrek aan consensus over de specifieke stappen in deze methode vanwege de nieuwigheid. Het is echter duidelijk dat verschillende stappen zijn essentieel voor hoogwaardige reconstructies van STEM doorgaande focal tilt-serie datasets. Ten eerste, de uitlijning van de focal beelden bij elke hellingshoek moet zorgvuldig worden uitgevoerd, zoals in de drie originele artikelen beschrijven through-focal beeldcollectie 13, 14, 15. Hoewel beelden verzameld op verschillende focale waarden niet zelfstandig informatie te delen, Turboreg blijft een goede oplossing voor nauwkeurige automatische uitlijning van beelden. Ten tweede, de samenvoeging van de focale beelden, zoals uitgevoerd in dit protocol, het voordeel van het genereren van een enkel beeld per kantelhoek die gemakkelijk wordt gehanteerd door een tilt-series alignment en 3D-reconstructie softwareprogramma. De Extended Depth of Field plug-in werd in eerste instantie ontworpen voor lichtmicroscopie beelden; Toch lijkt de beste oplossing voor het samenvoegen van de in-focus nieuwste electronenmicroscoop 28 zijn. Een alternatieve oplossing is om de hele set van beelden als een tilt-serie dataset met een aantal beelden per kantelhoek, vergelijkbaar met wat werd gedaan door Hovden et al te overwegen. 13 en Dahmen et al. 14. Dit vereist het gebruik van Fourier-gebaseerde algoritmes 13 of Ettention, ontwikkeld door Dahmen et al. 29 en dat is de enige 3D-reconstructie software die 3D-volumes kunnen reconstrueren van beelden verzameld op verschillende focale waarden in de reële ruimte. Met name zal een dergelijke alternatieve oplossingen extra uitrichtstap in het brandpunt richting (Z-as), wat verwarrend resu kunnen produceren vereisenlts die in strijd zijn met de defocus intervallen gekozen tijdens beeldcollectie zijn, zoals besproken in Dahmen et al. 14. Het samenvoegen van de in-focus informatie, zoals in dit protocol, het voordeel van het genereren van een beeld alsof de gegevens werden verzameld via een parallelle, waardoor deze extra uitrichtstap in de Z-richting wordt vermeden.
Door focal-tilt-serie werkwijzen ontwikkeld dikke monsters (ongeveer 1 pm) te bestuderen. De belangrijkste beperking van deze werkwijzen is dat ze niet kunnen worden gebruikt om monsters dikker dan enkele microns bestuderen, aangezien de elektronenbundel niet dergelijke monsters kan doordringen. Deze beperking komt van de vrije weglengte van de elektronen, die afhangt van de versnellingsspanning. Hoewel zeer hoge spanning (dat wil zeggen 1000 kV) elektronenmicroscopen kan worden gebruikt voor het afbeelden van eukaryotische cellen 30, zeer dikke monsters moeten nog het gebruik van andere technieken, zoals focused ionenbundel of seriële block-face scanning elektronenmicroscopie 31, 32. Deze werkwijzen produceren anisotroop reconstructies die kan worden beschouwd stapels beelden omdat de Z-as, die wordt gedefinieerd als de snijdiepte van de werkwijze is niet gelijk aan de X- en Y-assen. Deze technieken kunnen niet worden gebruikt voor hoge-resolutie studies.
In 2014 en 2015, drie originele artikelen meldde verschillende methoden voor het afbeelden dikke monsters 13, 14, 15. Sindsdien zijn slechts enkele studies een van deze methoden gebruikt om dikke monsters 33 bestuderen. Verbeteringen in de methoden zal helpen om door middel van-focale beeldvorming generaliseren in STEM. Vooral in life sciences, through-focal methoden moeten worden geoptimaliseerd voor het observeren van monsters onder cryogene omstandigheden. Dit is een grote uitdaging, omdat cryogene monstersbijzonder gevoelig voor dosering elektron en doorgaande aandacht vereisen veel afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | |
| Epoxy resin | EMS | 14120 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Add paraformaldehyde powder to PBS heated at approximately 60 °C. Increase pH by adding 1 N NaOH until no PFA powder is visible. |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Osmium Tetroxyde | EMS | 19150 | |
| Uranyl Acetate | Sigma-Aldrich | 73943 | |
| Gelatin Capsule | EMS | 70110 | |
| Triming and Histo knives | LFG Distribution | Diatome diamond knives | |
| Electron Microscopy copper grid | LFG Distribution | G200-Cu | |
| Grid Coating Pen | LFG Distribution | 70624 | |
| Specimen Holder | JEOL | EM-21311 HTR | |
| Electron Microscope | JEOL | JEM-2200FS |
References
- De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
- Al-Amoudi, A., et al.
- Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
- Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
- Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
- Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
- Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
- Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
- Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
- Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
- Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
- Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
- Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
- Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
- Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288 (2007).
- Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124 (2009).
- Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
- Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
- Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
- Kohl, L., Bastin, P.
- Luft, J. H.
- Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
- Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
- Dahmen, T., et al.
- Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
- Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
- Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041 (2016).
